發(fā)酵工程技術(shù)制藥

發(fā)酵工程制藥第一節(jié)：微生物細(xì)胞工程（發(fā)酵工程制藥）生產(chǎn)原理第二節(jié)：利用微生物進(jìn)行藥物的生產(chǎn)實(shí)例

一、發(fā)酵生產(chǎn)過程生產(chǎn)用菌種--------原始材料--------培養(yǎng)基------程序-------生產(chǎn)細(xì)則-------以青霉素為例講解（1）青霉素（penicillin）所用菌種---黃青霉菌原始材料---α-氨基已二酸、半胱氨酸、纈氨酸。發(fā)酵方法----加前體物質(zhì)的深層發(fā)酵法。青霉素發(fā)現(xiàn)者弗萊明沙土管菌種↓轉(zhuǎn)移到固體瓊脂斜面培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)5-6天，獲得芽孢↓芽孢懸浮于無菌水中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)↓進(jìn)入移種瓶培養(yǎng)↓進(jìn)種子罐，接種量為5%-10%↓進(jìn)繁殖罐，28℃培養(yǎng)48-96小時(shí)↓進(jìn)入發(fā)酵罐，開始生產(chǎn)?！氖竭^濾↓第一次萃取器↓純化柱↓第二次萃取器↓第三次萃取器↓真空結(jié)晶釜↓瓷過濾器↓結(jié)晶洗滌釜↓真空干燥器（結(jié)束）程序（1）使用消沫劑，由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的CO2，會(huì)產(chǎn)生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫劑進(jìn)行消沫處理。（2）溫度控制在24-30℃、PH值控制在6.8--7.2。（3）應(yīng)該注意控制殘?zhí)橇?、還原糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。（4）發(fā)酵過程中要注意通氣攪拌，所通入的空氣必須是無菌的。（5）發(fā)酵罐必須保持正壓（20-30kPa），以防罐外不潔凈的空氣流入。（6）目前國(guó)際上青霉素發(fā)酵的水平已經(jīng)達(dá)到8萬(wàn)多單位/ml，相當(dāng)于50g/L。生產(chǎn)細(xì)則二、滅菌技術(shù)滅菌操作是為了保證雜菌不進(jìn)入工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)。（一）滅菌項(xiàng)目（二）滅菌方法（三）滅菌的矛盾之處（四）具體的滅菌技術(shù)（一）滅菌項(xiàng)目1、在投入生產(chǎn)之前，必須對(duì)設(shè)備、管道進(jìn)行徹底清洗、和嚴(yán)格滅菌。2、對(duì)通入的培養(yǎng)基、通入的空氣進(jìn)行先行滅菌。

（二）滅菌方法

2、化學(xué)法1、加熱法3、輻射法4、過濾法（三）滅菌的矛盾之處對(duì)殺滅細(xì)菌的同時(shí)1、培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成份也隨之遭到分解和破壞。

2、殺死雜菌的同時(shí)也殺死了工程細(xì)菌。

（四）具體的滅菌技術(shù)可分為6種技術(shù)：1、間歇滅菌法2、加熱滅菌法3、連續(xù)滅菌法4、空氣加熱滅菌法5、空氣過濾滅菌法6、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)瞬時(shí)高溫殺菌法1：間歇滅菌法又稱為分批滅菌，是指將培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐內(nèi)，然后連罐加熱到規(guī)定的滅菌溫度。

（1）滅菌方法（2）注意事項(xiàng)（3）間歇滅菌法的優(yōu)點(diǎn)（1）滅菌方法間歇滅菌的操作過程分為3個(gè)過程：加熱----保溫維持----冷卻。這些不同的階段，均能夠起到滅菌的作用。然而，在滅菌過程中，保溫殺菌的作用是主要的，冷卻殺菌的作用最小。（2）注意事項(xiàng)應(yīng)當(dāng)避免過長(zhǎng)的加熱時(shí)間，否則常常會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。系統(tǒng)經(jīng)過滅菌操作之后，必須達(dá)到不留1個(gè)雜菌，否則，只要經(jīng)過1晝夜的增殖，1個(gè)雜菌就會(huì)增加到272個(gè)雜菌，最后會(huì)導(dǎo)致整批發(fā)酵液的失敗。

（3）間歇滅菌法的優(yōu)點(diǎn)設(shè)備造價(jià)低廉。便于進(jìn)行手動(dòng)操作。

2：加熱滅菌法隧道滅菌箱設(shè)備3：連續(xù)滅菌法（1）定義（2）技術(shù)分類（3）連續(xù)滅菌法的優(yōu)點(diǎn)（4）連續(xù)滅菌法的不足（1）定義連續(xù)滅菌法是指滅菌的操作的加熱、保溫維持、冷卻這三個(gè)過程，在同一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。因此，在連續(xù)滅菌系統(tǒng)中，需要分別設(shè)置加熱設(shè)備、保溫維持設(shè)備、冷卻設(shè)備。（2）技術(shù)分類連續(xù)滅菌法可以分為2種：（1）加熱、冷卻緩慢交替進(jìn)行方法。（2）迅速升溫+閃急冷卻方法-----這種方法稱為HTST方法，這對(duì)于保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極為有利。（3）連續(xù)滅菌法的優(yōu)點(diǎn)（1）可減少培養(yǎng)劑中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失、提高產(chǎn)物收率。（2）由于操作條件恒定，可以獲得穩(wěn)定的滅菌質(zhì)量。（3）容易實(shí)現(xiàn)自控操作。（4）能夠避免系統(tǒng)的反復(fù)加熱和冷卻，可提高熱利用率。是目前很多制藥廠經(jīng)常采用的方法。（4）連續(xù)滅菌法的不足（1）投資較大，

（2）需要同時(shí)設(shè)置加熱、冷卻裝置。

4：空氣加熱滅菌法利用空氣壓縮時(shí)產(chǎn)生的高溫，使得微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，而達(dá)到殺菌目的，這種方法稱為空氣加熱滅菌法。

不同溫度下的空氣細(xì)菌存活時(shí)間：

200℃/15.1s，250℃/5.1s，

300℃/2.1s，350℃/1.05s。干熱殺菌的流程通常是：先采用廢熱，將空氣預(yù)熱到60-70℃，然后進(jìn)入壓縮機(jī)壓縮，并在200℃以上的溫度維持一段時(shí)間。以便殺死雜菌，然后再進(jìn)入發(fā)酵罐之中。5：空氣過濾滅菌法是指讓空氣通過過濾介質(zhì)，以阻截空氣中所含的微生物，取得無菌空氣的目的。

空氣過濾分為2種：（1）絕對(duì)過濾（2）深層過濾陶瓷過濾機(jī)（1）絕對(duì)過濾如超濾膜過濾就屬于絕對(duì)過濾是指所用濾膜的孔徑小于空氣中的固體顆粒。從而把顆粒截留。（2）深層過濾是憑借濾層內(nèi)的曲折通道，而將顆粒截留的方法。它不要求濾膜的孔徑小于空氣中的固體顆粒。這是目前發(fā)酵工業(yè)常用的過濾除菌方法。深層過濾所用的過濾介質(zhì)-------棉花、活性碳、玻璃纖維、合成纖維、各種有機(jī)或無機(jī)的燒結(jié)材料（燒結(jié)金屬、燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)塑料、蒙乃爾合金粉燒結(jié)板）、超細(xì)玻璃纖維、超細(xì)玻璃纖維過濾紙，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA過濾板、PVA燒結(jié)板等已經(jīng)在日本的發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用）。6：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)瞬時(shí)高溫殺菌法一般來說，當(dāng)溫度升高時(shí)，微生物死亡速率的增加>>營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)遭到破壞的速率。因此，對(duì)于瞬時(shí)的高溫，細(xì)菌常常被殺死，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)則破壞得不多。根據(jù)這一原理，可以采用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)瞬時(shí)高溫殺菌法進(jìn)行殺菌操作。三、分離純化技術(shù)微生物的發(fā)酵產(chǎn)物是一種混合物，里面除了含有主要產(chǎn)物以外，還含有未能轉(zhuǎn)化的基質(zhì)和底物、殘余的原料、大量的水、微生物細(xì)胞、各種雜質(zhì)。因此，必須對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化。

分離和純化過程被稱作“下游加工過程”，需要經(jīng)過以下這幾個(gè)階段：

（一）固體物質(zhì)的去除，

（二）初步分離，

（三）產(chǎn)品提純，

（四）產(chǎn)品的最終分離。（一）固體物質(zhì)的去除1、目的2、常用的方法有3、常用的設(shè)備

4、固體物質(zhì)的前期預(yù)處理技術(shù)1、目的（1）分離出完整的細(xì)胞。（2）將細(xì)胞進(jìn)行溶菌處理，提取細(xì)胞內(nèi)的生物產(chǎn)品。（3）除去細(xì)胞有殘留碎片。（4）除去沒有轉(zhuǎn)化的不溶性基質(zhì)。（5）一部分細(xì)胞返回到反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行再循環(huán)操作。2、常用的方法（1）過濾法------分批過濾、連續(xù)真空過濾、錯(cuò)流流動(dòng)過濾。

錯(cuò)流流動(dòng)過濾法------使液體平等于過濾膜的表面進(jìn)行流動(dòng)，這樣能夠不斷地移去在濾膜表面積累的細(xì)胞物質(zhì)，從而獲得近似于恒定的過濾速率。（2）離心分離法------垂直式離心、水平式離心。（3）沉降法------與一般的自由沉降不同，工業(yè)生產(chǎn)過程的沉降都屬于干擾式沉降。3、常用的設(shè)備（1）過濾設(shè)備------板框過濾機(jī)、回轉(zhuǎn)真空過濾機(jī)（2）離心設(shè)備-------轉(zhuǎn)籃式離心過濾機(jī)（三足式離心過濾機(jī)）、刮刀卸料式離心過濾機(jī)、沉降式離心過濾機(jī)、噴霧離心過濾機(jī)、間斷排料式離心過濾機(jī)、傾析式離心過濾機(jī)。（3）沉降設(shè)備------管式離心沉降機(jī)。4、固體物質(zhì)的前期預(yù)處理技術(shù)由于生物反應(yīng)液的粘度很大，直接分離往往比較困難，因此，常常對(duì)其進(jìn)行預(yù)先的前期處理，來提高分離效果。常見的預(yù)處理技術(shù)有：

（1）使細(xì)胞老化凝聚成團(tuán)，

（2）加熱，

（3）改變PH值，

（4）添加化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)凝聚，如加入高分子電解質(zhì)、氯化鈣、膠態(tài)粘士。（二）初步分離進(jìn)一步把已經(jīng)分離的溶液濃縮，提高目的產(chǎn)物濃度的方法，稱為初步分離。初步分離的具體方法可以分為：1、蒸發(fā)2、萃取3、沉淀4、膜分離1、蒸發(fā)蒸發(fā)是通過加熱，使溶液中的水經(jīng)過汽化除去要提高溶質(zhì)濃度、為溶質(zhì)的析出創(chuàng)造條件的一種操作方法。各種代謝物，如氨基酸、抗生素、酶都可以進(jìn)行蒸發(fā)操作。由于生物產(chǎn)品大多數(shù)是熱敏性物質(zhì)，所以物料在蒸發(fā)器內(nèi)的停留時(shí)間必須盡可能短，同時(shí)，還應(yīng)該晝避免局部液體過熱。LG系列離心式刮板薄膜蒸發(fā)器示意圖蒸發(fā)設(shè)備

（1）連續(xù)流動(dòng)膜式蒸發(fā)器，

（2）長(zhǎng)管膜式蒸發(fā)器，

（3）強(qiáng)制膜式蒸發(fā)器，

（4）離心膜蒸發(fā)器。2、萃取萃取是通過物質(zhì)在2種溶液之間不同的溶解度，來實(shí)現(xiàn)分離的操作方法。萃取的分類（1）有機(jī)溶劑萃取（2）雙水相萃?。?）有機(jī)溶劑萃取許多抗生素都能夠溶解在有機(jī)溶劑之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通過萃取，可使得抗生素從水相進(jìn)入有機(jī)相之中，從而實(shí)現(xiàn)分離。由于抗生素在有機(jī)溶劑之中極不穩(wěn)定，因此，在保證萃取效率的前提條件下，必須盡量縮短操作時(shí)間。有機(jī)溶劑萃取設(shè)備可使用Podbielniak離心萃取機(jī)。SFT-150超臨界萃取反應(yīng)儀利用萃取法來提取抗生素，具有質(zhì)量好、收率高、速度快的優(yōu)點(diǎn)。雙水相萃取法，目前用于進(jìn)行酶、和蛋白質(zhì)的提取工藝。（2）雙水相萃取使用2種互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分別將它們?nèi)苡谒行纬呻p水相，利用目的產(chǎn)物在雙水相中不同的分配系數(shù)而實(shí)現(xiàn)分離的方法，稱為雙水相萃取。萃取之后的目的產(chǎn)物可以通過超濾法進(jìn)行提純。雙水相萃取材料--------（1）PEG--葡聚糖萃取系統(tǒng)，（2）PEG—磷酸鉀萃取系統(tǒng)。3、沉淀蛋白質(zhì)在溶液中具有“等電點(diǎn)”的特性，而且其等電點(diǎn)與溶液PH值有關(guān)，PH值大，蛋白質(zhì)呈負(fù)電，PH值小，蛋白質(zhì)呈正電，當(dāng)PH=pI（等電點(diǎn)）時(shí)，蛋白質(zhì)不帶電荷。蛋白質(zhì)在PI時(shí)的溶解度最小。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在水中有均勻分布是由于同性電荷相斥的緣故，當(dāng)PH=pI時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子不帶電荷，于是開始相互凝聚、產(chǎn)生沉淀。NSG-630濃縮分離機(jī)ZHN系列真空濃縮罐沉淀和鹽折的結(jié)合由于沉淀常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性而失效。而利用鹽溶液就能避免蛋白質(zhì)的變性，這種方法就稱為------鹽析法。在不同的鹽溶液之中，蛋白質(zhì)有鹽析效應(yīng)有所不同。按下列順序遞減：

（1）陰離子------檸檬酸鹽-3、酒石酸鹽-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸鹽-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。

（2）陽(yáng)離子-------Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。從離子物性來看，硫酸銨并不是鹽析效應(yīng)最強(qiáng)的鹽類，但是由于它在水中的溶解度極大，對(duì)鹽析十分有利，因此硫酸銨是目前最常用的鹽析劑。4、膜分離膜分離技術(shù)是基于一種半透性薄膜，它能夠使得溶液中的某些組分通過，而阻止和截留其它組分的分離方法。膜分離的優(yōu)點(diǎn)

（1）由于膜分離是純粹物質(zhì)粒度大小這一幾何特性來進(jìn)行分離，它不必象萃取、沉淀法那樣需加入其它化學(xué)物質(zhì)、也不必象蒸發(fā)那樣進(jìn)行加熱。因此，產(chǎn)物的生物學(xué)特性能夠得到完好的保存，

（2）產(chǎn)物的損失量很少，有利于提高得率。膜分離的分類（1）反滲透法（2）超濾法（1）反滲透法根據(jù)物理化學(xué)的原理，當(dāng)含有溶質(zhì)A的溶液B與另一滲透液C之間被半透膜隔開的時(shí)候，由于系統(tǒng)滲透壓的作用，滲透液C便會(huì)進(jìn)入到溶液B之中，這種現(xiàn)象稱為滲透現(xiàn)象。形成這種滲透的壓力就自然稱為滲透壓（π）如果在溶液B一方施加壓力（⊿P），發(fā)現(xiàn)滲透液C進(jìn)入溶液B的速率就會(huì)減小。

當(dāng)壓力（⊿P）=滲透壓（π）時(shí)，滲透現(xiàn)象就會(huì)停止。當(dāng)壓力（⊿P）>滲透壓（π）時(shí)，就會(huì)看到溶液B開始反向進(jìn)入滲透液C之中，這種現(xiàn)象就稱為反滲透現(xiàn)象。根據(jù)溶液所具有的反滲透特性，可以實(shí)現(xiàn)溶液的濃縮。（2）超濾法是指在反滲透的基礎(chǔ)之上，將隔離膜由原來的半透膜，改成帶有較大孔徑的薄膜。這樣一來，在反滲透操作過程中，不但是溶劑進(jìn)入到滲透液之中，就連那些許多小分子的雜質(zhì)也連帶一起進(jìn)入到滲透液之中。

與反滲透法相比，超濾法明顯具有其優(yōu)點(diǎn)-------反滲透法只能起到濃縮作用，而超濾法在濃縮的同時(shí)，還具有純化作用。反滲透法+超濾法的實(shí)際應(yīng)用（1）主要用于蛋白質(zhì)溶液的濃縮、脫鹽等步驟，

（2）在疫苗、血漿等生產(chǎn)中也常被使用。

膜分離裝置的分類

（1）中空纖維束，

（2）板-框膜分離裝置，

（3）螺旋狀膜分離裝置反滲透裝置（三）產(chǎn)品提純層析法，是指在一根層析柱內(nèi)，填充某種特殊的載體物質(zhì)，稱為固定相。含有待分離產(chǎn)物的溶液則稱為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流過固定相的時(shí)候，由于流動(dòng)相中不同的物質(zhì)與固定相之間產(chǎn)生了不同強(qiáng)度的結(jié)合力，因此各種物質(zhì)在層析柱內(nèi)停留的時(shí)間也各不相同，結(jié)果，它們將依次序的先后流出層析柱。層析法的分類

1、吸附層析法

2、離子交換層析法

3、凝膠層析法（分子篩）

4、親的層析法1、吸附層析法吸附層析法是利用各種物質(zhì)與固定相之間由于吸附力的差異、而產(chǎn)生不同的結(jié)合力的原理，所進(jìn)行的層析操作。固定相對(duì)溶質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合力，這種結(jié)合力是以離子鍵、氫鍵、范德華力所產(chǎn)生的。而流動(dòng)相的洗脫作用又對(duì)溶質(zhì)和固定相之間產(chǎn)生脫離作用。這樣，吸附—