第二章生物藥物分析與檢驗常用的方法

第二章

生物藥物分析與檢驗常用的方法第一節(jié)酶法

第二節(jié)電泳法

第三節(jié)理化法

第四節(jié)生物檢定法第一節(jié)酶法酶法包括兩種類型：酶活力測定法和酶分析法。酶活力測定法是以酶為分析對象的研究，測定樣品中某種酶的含量或活性。酶分析法是以酶為分析工具或分析試劑，測定樣品中酶以外的其他物質(zhì)的含量。兩者檢驗對象不同原理和方法相同：以酶專一而高效催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對酶促反應(yīng)速度的測定或?qū)ι晌锏葷舛鹊臏y定而檢驗相應(yīng)物質(zhì)的含量。一、酶活力測定法（一）酶活力酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的測定實際上是測定一個被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)的速度可以用單位時間內(nèi)反應(yīng)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。酶反應(yīng)的速度愈快表示酶活力愈高。（二）酶的活力單位和比活力1961年國際酶學(xué)會議規(guī)定：1個酶活力單位是指在特定條件（25℃，其它為最適條件）下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1微摩爾的有關(guān)基團的酶量。酶活力單位：用來表示酶活力大小的單位，通常用酶量來表示。其中一個稱酶活力國際單位，規(guī)定為：在特定條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物，或者底物中1微摩爾有關(guān)基團所需的酶量，稱為一個國際單位（IU，又稱U）。

另外一個國際酶學(xué)會議規(guī)定的酶活力單位是Kat，規(guī)定為：在最適條件下，1秒鐘能使1摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量。

Kat和U的換算關(guān)系：

1Kat=6×107U，1U=16.67nKat酶的比活力（specificactivity）：是指每毫克質(zhì)量的蛋白質(zhì)中所含的某種酶的催化活力。是用來度量酶純度的指標(biāo)。是生產(chǎn)和酶學(xué)研究中經(jīng)常使用的基本數(shù)據(jù)。比活力越大，酶的純度越高。酶在酶制劑中的有效含量可以用每克酶蛋白或每毫升酶蛋白含有多少酶單位來表示（U/g或U/mL）固體酶比活力=活力（U）/蛋白（mg）=總活力（U）/總蛋白（mg）酶的轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)：在單位時間內(nèi)每一活性中心或每分子酶所能轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)。生產(chǎn)中并不常用。

（三）酶活力的測定方法常規(guī)測定酶活力的步驟：1、酶液的稀釋酶制劑是粉劑，要溶解和稀釋；液體酶制劑也要稀釋。從測定要求來分析，要求底物濃度要遠大于酶的濃度。初測時，最佳稀釋倍數(shù)只能通過試驗來確定2、選擇底物濃度根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配置成一定濃度的底物溶液。要求所用的底物均勻一致，達到一定的純度。有的底物溶液要求新鮮配置，有的則可預(yù)先配置后置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、確定酶促反應(yīng)的最適條件根據(jù)資料或試驗結(jié)果，確定酶促反應(yīng)的最適條件，最適條件包括溫度、pH、底物濃度、適宜的離子強度、適當(dāng)稀釋的酶液及嚴格的反應(yīng)時間，不允許抑制劑存在，輔助因子不可缺少。4、反應(yīng)計時必須準確反應(yīng)體系必須預(yù)熱至規(guī)定溫度后，加入酶液，攪拌均勻，并立即計時；達到反應(yīng)時間后，要立即滅除酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終止時間。

終止酶反應(yīng)的方法很多，常用的有：加熱使酶失活；加入酶變性劑；加入酸或堿溶液，使pH遠離最適pH；降低溫度。5、反應(yīng)量的測定測底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。酶促反應(yīng)所用底物的濃度一般都很高，少量底物的消失不易測準；而產(chǎn)物則是從無到有，變化明顯，測定較為靈敏準確，所以大都測定產(chǎn)物的生成量。酶活力測定常用的具體方法有化學(xué)分析法、滴定法、比色法、吸收光譜法、熒光法、電化學(xué)法和量氣法等。二、酶分析法

酶分析法是一種以酶為分析工具（或試劑）的分析方法。分析對象可以是酶的底物、輔酶活化劑，甚至酶的抑制劑。在進行這類分析時，先要根據(jù)分析對象選擇適宜的“工具酶”，然后再通過酶反應(yīng)的測定，并借助相應(yīng)的校正曲線來測定他們的濃度或含量。1、動力學(xué)分析法原理是通過條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反應(yīng)中起決定反應(yīng)速度的主導(dǎo)作用，這時酶反應(yīng)速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，這樣測定酶反應(yīng)的速度就可求出它們的濃度。酶分析法采用的條件和酶活力測定法的條件基本相同，但其所用的酶量必須恒定，被測物以外的其他反應(yīng)成分均須保證處于恒定和最適。酶分析法必須制備一條酶反應(yīng)速度相對于相應(yīng)的被測物濃度的標(biāo)準曲線，以便對未知樣品的量進行檢驗。在測定未知樣品時，所采用的反應(yīng)、測定系統(tǒng)和制備標(biāo)準曲線時所用的系統(tǒng)應(yīng)完全相同，而且待測樣品的濃度還應(yīng)控制在這一曲線范圍以內(nèi)。2、總變量分析法（又稱為平衡點法或終點法）根據(jù)被測物質(zhì)的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對該物質(zhì)進行作用，然后再反應(yīng)完成后，借助理化方法測出其總變化量，并參考反應(yīng)的平衡點，計算出被測物的實際含量或濃度的一種分析方法。該方法僅適用于底物的測定，應(yīng)用時應(yīng)考慮工具酶的用量與反應(yīng)的平衡點。第二節(jié)電泳法帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis,EP)。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。1937年瑞典學(xué)者A.W.K.蒂塞利烏斯設(shè)計制造了移動界面電泳儀，分離了馬血清白蛋白的3種球蛋白，創(chuàng)建了電泳技術(shù)。

在確定的條件下，帶電粒子在單位電場強度作用下，單位時間內(nèi)移動的距離（即遷移率）為常數(shù)，是該帶電粒子的物化特征性常數(shù)。不同帶電粒子因所帶電荷不同，或雖所帶電荷相同但荷質(zhì)比不同，在同一電場中電泳，經(jīng)一定時間后，由于移動距離不同而相互分離。分開的距離與外加電場的電壓與電泳時間成正比。利用電泳可以確定膠體微粒的電性質(zhì)，向陽極移動的膠粒帶負電荷，向陰極移動的膠粒帶正電荷。金屬氫氧化物、金屬氧化物等膠體微粒吸附陽離子，帶正電荷。非金屬氧化物、非金屬硫化物等膠體微粒吸附陰離子，帶負電荷。例如，陶瓷工業(yè)中用的粘土，往往帶有氧化鐵，要除去氧化鐵，可以把粘土和水一起攪拌成懸浮液，由于粘土粒子帶負電荷，氧化鐵粒子帶正電荷，通電后在陽極附近會聚集出很純凈的粘土。工廠除塵也用到電泳。利用電泳還可以檢出被分離物，在生化和臨床診斷方面發(fā)揮重要作用。

一、分類

電泳分離是基于溶質(zhì)在電場中的遷移速度不同而進行的。根據(jù)分離原理的不同，電泳分為四類：移動界面電泳區(qū)帶電泳等電聚焦電泳等速電泳移動界面電泳是將被分離的離子（如陰離子）混合物置于電泳槽的一端（如負極），在電泳開始前，樣品與載體電解質(zhì)有清晰的界面。電泳開始后，帶電粒子向另一極（正極）移動，泳動速度最快的離子走在最前面，其他離子依電極速度快慢順序排列，形成不同的區(qū)帶。只有第一個區(qū)帶的界面是清晰的，達到完全分離，其中含有電泳速度最快的離子，其他大部分區(qū)帶重疊。區(qū)帶電泳是在一定的支持物上，于均一的載體電解質(zhì)中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、粉末電泳、凝膠電泳與絲線電泳。

等電聚焦電泳是將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當(dāng)其處在低于其本身等電點的環(huán)境中則帶正電荷，向負極移動；若其處在高于其本身等電點的環(huán)境中，則帶負電向正極移動。當(dāng)泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電點的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點位置，形成一個個清晰的區(qū)帶，分辨率極高。等速電泳是在樣品中加有領(lǐng)先離子（其遷移率比所有被分離離子的大）和終末離子（其遷移率比所有被分離離子的小），樣品加在領(lǐng)先離子和終末離子之間，在外電場作用下，各離子進行移動，經(jīng)過一段時間電泳后，達到完全分離。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領(lǐng)先離子與終末離子的區(qū)帶之間。由于沒有加入適當(dāng)?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流，所得到的區(qū)帶是相互連接，且因“自身校正”效應(yīng)，界面是清晰的，這是與區(qū)帶電泳不同之處。

等速電泳原理：將樣品置于含慢離子和快離子的緩沖液中電泳，快離子的電泳遷移率大于其他所有的離子，使其后面的離子濃度降低，形成一個低電導(dǎo)高電勢的梯度區(qū)，減慢了快離子的遷移速度，并促使后面的離子加速向前移動；而慢離子電泳遷移率小于其他所有的離子，同理會加速向前移動去靠近比它遷移快的離子；結(jié)果所有的離子都被壓縮在慢離子和快離子之間，以幾乎相等的速度遷移。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠的濃縮膠電泳過程中就應(yīng)用了等速電泳原理。

二、基本原理

三、影響因素1、顆粒性質(zhì)顆粒所帶靜電荷越多，粒子越小且是球形，電泳遷移率就越大。2、電場強度單位距離的電位降稱為電場強度也叫電勢強度。電場強度越高，帶電顆粒的電泳速度就越快。3、溶液的性質(zhì)（1）pH溶液的pH決定帶電顆粒的解離程度，即決定了帶電顆粒所帶電荷的多少。對蛋白質(zhì)和氨基酸而言，溶液的pH離等電點越遠，其所帶凈電荷的量就越大，電泳速度就越快；反之則越慢。為了使電泳過程中溶液的pH保持恒定，宜選用緩沖溶液。（2）離子強度離子強度代表所有類型的離子所產(chǎn)生的靜電力，它取決于離子電荷的總數(shù)。若離子強度過高，帶電離子能把溶液中與其電荷相反的離子吸進在自己周圍形成離子擴散層，導(dǎo)致顆粒所帶凈電荷量減少，電泳速度降低。（3）溶液黏度電泳速度與溶液黏度成反比，因此黏度越大，電泳速度就越小。（4）電滲

因為支持物不是絕對的惰性物質(zhì)，它可吸附溶液中的陽離子或陰離子，使靠近支持物的溶液相對帶電，從而引起電場中溶液層的移動，這種現(xiàn)象稱為電滲現(xiàn)象。如果顆粒泳動的方向與電滲方向一致，則泳動速度加快；如果顆粒泳動的方向與電滲方向相反，則泳動速度降低。為避免電滲現(xiàn)象，應(yīng)盡量選擇電滲作用小的支持物。若選用的支持物不合適，當(dāng)電場力等于甚至小于電滲力時，則顆粒泳動速度為零甚至向反方向移動四、電泳分析的檢測方法及其應(yīng)用電泳系統(tǒng)的基本組成電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200~600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳1000~2000V，固相梯度等電