核酸雜交技術(shù)完整版

nucleicacidhybridization核酸分子雜交2（nucleicacidmolecular

hybridization）是指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。雜交雙方分別稱為探針與待測核酸。雜交分子：雜交后形成的異源雙鏈分子探針(probe)：帶有可檢測標(biāo)記的已知序列的DNA或RNA片段。核酸雜交技術(shù)3利用核酸分子雜交檢測靶序列的一類技術(shù)主要用途：核酸定性或定量檢測基因克隆、突變及其表達研究疾病的臨床診斷第一節(jié)

核酸雜交基本原理4一、核酸變性三、核酸復(fù)性四、核酸分子雜交核酸的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：核苷酸的排列循序穩(wěn)定鍵：磷酸二酯鍵二級結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定鍵：氫鍵、堿基堆積力、疏水鍵高級結(jié)構(gòu)：染色體5G6CA一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu)一、核酸變性變性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程?；瘜W(xué)鍵變化：維持雙螺旋穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵發(fā)生斷裂，斷裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化：DNA變性改變了其空間結(jié)構(gòu)，不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變78DNA的變性因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件加熱極端的pH有機試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）一、核酸變性-DNA的變性因素910變性能導(dǎo)致DNA

的一些理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變一、核酸變性-變性DNA的性質(zhì)溶液黏度降低DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結(jié)構(gòu)，變性后代之以“柔軟”

無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA黏度明顯下降溶液旋光性發(fā)生改變變性后DNA分子的對稱性及局部構(gòu)型改變紫外吸收增加DNA變性后，DNA溶液的紫外吸收增強雙鏈DNA＜單鏈DNA＜單核苷酸DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)（

hyperchromic

effect

）：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象11一、核酸變性-變性DNA的增色效應(yīng)DNA分子在250－280nm

波長具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm紫外吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是：DNA分子中堿基間電子的相互作用，變性后，雙鏈解開，堿基間電子的相互作用更有利于紫外吸收，

產(chǎn)生增色效應(yīng)增色效應(yīng)可以作為DNA變性的指標(biāo)不同來源DNA的變化不一，如大腸桿菌DNA經(jīng)熱變性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同來源的DNA溶液的增值范圍大多在20－30%之間一、核酸變性-變性DNA的增色效應(yīng)12一、核酸變性-解鏈曲線通常利用DNA變性后在波長260nm處吸光度（A260）的增加來監(jiān)測DNA變性的過程。如果以溫度對A260的關(guān)系作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。典型DNA變性曲線呈S型1314一、核酸變性-融解溫度增色效應(yīng)與溫度有十分密切的關(guān)系，這主要是變性溫度取決于DNA自身的性質(zhì)。融解溫度（

melting

temperature，Tm）：在熱變性過程中，紫外吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度特點：爆發(fā)式：熱變性是在變性溫度范圍內(nèi)突發(fā)的躍變過程，很像結(jié)晶達到熔點時的融化現(xiàn)象，故名融解溫度狹窄性：變性溫度范圍很小一、核酸變性-融解溫度15Tm的影響因素：DNA分子大小和堿基的組成溶液的離子強度pH值4．變性劑DNA復(fù)雜度對Tm的影響一、核酸變性-融解溫度16（一）DNA分子大小和堿基的組成不同來源

DNA

間的

Tm

存在差別，在溶劑相同的前提下，這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質(zhì)所造成的–

DNA的均一性–

DNA的（G+C）含量一、核酸變性-融解溫度17DNA的均一性有二種含義DNA分子中堿基組成的均一性：如人工合成的只含有一種堿基對的多核苷酸片段，與天然

DNA比較，其Tm值范圍就較窄。因前者變性時氫鍵斷裂幾乎可“齊同”進行待測DNA樣品組成的均一性：如樣品中只含有一種病毒DNA，其

Tm

值范圍較窄，若混有其它來源的DNA，則Tm值范圍較寬一、核酸變性-融解溫度18DNA的（G+C）含量在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的（G+C）的含量（G+C）含量越高，G-C

堿基對越多，Tm

值越高。–

因G-C堿基對具有3對氫鍵，而A-T堿基對只有2對氫鍵，DNA中（G+C）含量高顯然更能增強結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，破壞

G-C間氫鍵需比A-T

氫鍵付出更多的能量。一、核酸變性-融解溫度19Tm與（G+C）含量的關(guān)系Tm

與DNA中（G+C）含量存在著密切相關(guān)性Tm與（G+C）含量（X）百分?jǐn)?shù)的這種關(guān)系可用以下經(jīng)驗公式表示（DNA溶于0.2mol/L

NaCl中）:Tm=69.3+0.41（G+C）

%核苷酸≤20bp Tm=4（G+C）+2（A+T）一、核酸變性-融解溫度20（二）溶液的離子強度溶液中離子與DNA分子中磷酸基團形成離子鍵，需要較高溫度才能使DNA變性離子強度較低時，Tm值較低，而且解鏈的溫度范圍也較寬一、核酸變性-融解溫度21（三）pH值pH值影響氫鍵的形成pH值在5-9范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。當(dāng)溶液pH值小于4時或大于11時，均不利于氫鍵的形成，DNA容易變性一、核酸變性-融解溫度22（四）變性劑干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑有甲酰胺、尿素、甲醛等一、核酸變性-融解溫度2324雙鏈DNA、RNA雙鏈區(qū)、DNA:

RNA雜交雙鏈（hybrid

duplex）以及其它異源雙鏈核酸分子（heteroduplex）都具有此性質(zhì)二、核酸復(fù)性復(fù)性（renaturation）：指變性

DNA

在適當(dāng)條件下，二條互補鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為“退火”。DNA的復(fù)性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響：溫度和時間DNA濃度DNA分子大小和復(fù)雜度離子強度二、核酸復(fù)性-影響因素25溫度和時間一般認(rèn)為比

Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠離此溫度，復(fù)性速度就越慢復(fù)性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫（如4℃以下），復(fù)性幾乎是不可能的二、核酸復(fù)性-影響因素26DNA濃度DNA復(fù)性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用“成核”“成核”速度與DNA濃度的平方成正比溶液中DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合“成核”的機會越大二、核酸復(fù)性-影響因素27DNA分子大小和復(fù)雜度用非重復(fù)堿基對（bp）數(shù)表示核酸分子的復(fù)雜性。多聚（A）的復(fù)雜性為1，重復(fù)的（ATGC）n組成的多聚體的復(fù)雜性為4，分子長度是105核苷酸的非重復(fù)DNA序列的復(fù)雜性為105原核生物基因組均為非重復(fù)順序，故以非重復(fù)核苷酸對表示的復(fù)雜性直接與基因組大小成正比真核生物基因組中的非重復(fù)片段也是如此二、核酸復(fù)性-影響因素28DNA順序的復(fù)雜性對復(fù)性的影響簡單順序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）這二種單鏈序列復(fù)性時，互補堿基的配對較易實現(xiàn)順序復(fù)雜的DNA，如小牛DNA的非重復(fù)部分（一般以單拷貝存在于基因組中），這種復(fù)雜的特定序列要實現(xiàn)互補，顯然要比上述簡單序列困難得多二、核酸復(fù)性-影響因素29離子強度對復(fù)性的影響增加鹽濃度可怎見互補鏈合成雙鏈的速度，鹽中和DNA單鏈中磷酸基團的負電荷，減少互補鏈靜電排斥二、核酸復(fù)性-影響因素30三、核酸分子雜交核酸雜交示意圖核酸分子雜交（molecular

hybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補的原則結(jié)合成異質(zhì)雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交3132雜交的本質(zhì)：就是在一定條件下使互補單鏈核酸實現(xiàn)復(fù)性利用探針（probe）與靶DNA雜交，可識別靶DNA中的特異核苷酸序列3334第二節(jié)

核酸探針技術(shù)一、核酸探針的類型二、核酸探針的標(biāo)記三、標(biāo)記探針的純化和檢測一、核酸探針的類型核酸探針（nucleicacid

probe)：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補雜交，雜交后可用特殊方法檢測的已知被標(biāo)記的核酸分子3536選擇探針的最基本的原則高度特異性探針的來源是否方便制備探針的難易程度37按化學(xué)本質(zhì)分：DNA探針RNA探針按標(biāo)記物分：放射性標(biāo)記探針非放射性標(biāo)記探針按分子大小分：寡核苷酸探針雙鏈探針單鏈探針核酸探針的類型常見的核酸探針38–基因組DNA探針–cDNA探針–RNA探針–寡核苷酸探針39來源：這類探針來源于某種生物的基因組，多為某一基因的全部或部分序列制備方法:基因克隆的方法聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)特點:多克隆在載體中的DNA片段，可無限繁殖，取之不盡PCR制備探針簡便和省時相對RNA而言，DNA探針不易降解，標(biāo)記方法也較成熟一、核酸探針的類型-基因組DNA探針40cDNA(complementary DNA)：是指與mRNA互補的DNA分子特點:不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達的研究排除了RNA酶的影響，現(xiàn)已成為分子生物學(xué)實驗室的常規(guī)實驗一、核酸探針的類型-cDNA探針41RNA探針與靶序列的雜交效率較高，穩(wěn)定性也高–RNA分子大多以單鏈形式存在，幾乎不存在互補雙鏈的競爭結(jié)合RNA分子中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交少，雜交后未雜交的探針分子水解可用RNA酶去除，本底的干擾低。RNA探針有易降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點，限制了其廣泛應(yīng)用。一、核酸探針的類型-RNA探針42特點

:根據(jù)需要來合成相應(yīng)的核酸序列，避免天然探針的缺點探針長度一般為10～50bp尤其適合點突變的檢測由于探針的長度較短，特異性較低，雜交信號較弱

，但經(jīng)過精心設(shè)計仍可設(shè)計出非常

特異的寡核苷酸探針一、核酸探針的類型-寡核苷酸探針43探針長度：一般要求在10～50bpG／C含量為40％～60％探針分子中應(yīng)避免互補序列

避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個，如GGGG-或

-CCCC-

借助計算機相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進行同源性比較一、核酸探針的類型-設(shè)計原則二、核酸探針的標(biāo)記44理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點檢測物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡便標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響探針分子的主要理化性質(zhì)。應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值標(biāo)記物對環(huán)境污染小，對人體無損傷，價格低廉標(biāo)記物對檢測方法無干擾檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性。常用的探針標(biāo)記物45放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：熒光、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。二、核酸探針－放射性同位素標(biāo)記物46放射性同位素的選擇：32P 優(yōu)點：放射比活度高缺點：半衰期短（14.3D）、散射嚴(yán)重35S

優(yōu)點：分辨率較高，半衰期長（87.4D）放射比活度高缺點：放射比活度只有32P的1/63H 優(yōu)點：半衰期長（12.3Y）、成像分辨率高，易于定位缺點：活性低二、核酸探針－非放射性標(biāo)記物47無放射性污染，穩(wěn)定性好①半抗原：生物素、地高辛②配體：生物素③熒光素：④化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，可以像放射性核素一樣直接對X光膠片進行曝光。⑤光密度或電子密度標(biāo)記物：如金、銀等，適用于細胞原位雜交，可以在光鏡或電鏡下進行觀察。三、常用的探針標(biāo)記方法48化學(xué)標(biāo)記法：光敏生物素標(biāo)記法酶促標(biāo)記法：將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后利用酶學(xué)的方法將標(biāo)記物摻入到探針分子上。缺口平移法、隨機引物法、末端標(biāo)記法等（1）化學(xué)標(biāo)記法：通過分子上的活性基團直接將標(biāo)記物結(jié)合到核酸分子上.光敏生物素標(biāo)記法:強光10-20分鐘，光敏基團與核酸探針的磷酸基團以共價鍵結(jié)合。49（2）酶促標(biāo)記法：將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后利用酶學(xué)的方法將標(biāo)記物摻入到探針分子上。缺口平移法、隨機引物法、末端標(biāo)記法等32P或35S同位素標(biāo)記的單核苷酸dig-dUTP的結(jié)構(gòu)50①缺口平移法

（nicktranslation）“邊切除、邊聚合”51由DNA酶Ⅰ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。1、利用DNase

I在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5

3

核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5

末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的5

3

聚合酶催化下，以互補的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3

末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中最合適的缺口平移片段一般為50-500個核苷酸。DNA酶Ⅰ的用量和E.coli

DNA聚合酶Ⅰ的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性,

故應(yīng)使用仔細純化后的DNA。52②隨機引物法53其原理是隨機引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5

3

方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補。另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互補的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中。隨機引物法所具有的優(yōu)點：541、能進行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來的一系列問題3、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達108cpm/μgDNA以上4、可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標(biāo)記隨機引物（4-6nt）：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=409655DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無5’→3’外切核酸酶活性56DNA聚合酶ⅠKlenow片段標(biāo)記法T4DNA聚合酶標(biāo)記法末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法T4多核苷酸激酶標(biāo)記法③探針的末端標(biāo)記：在5’或3’端通過酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物酶切④PCR標(biāo)記法57⑤光敏標(biāo)記法生物素、地高辛等光敏基團與生物素結(jié)合⑥化學(xué)衍生結(jié)合標(biāo)記法轉(zhuǎn)氨標(biāo)記法等DIG

標(biāo)記探針的方法探針類型標(biāo)記方法酶和引物結(jié)合的

DIG

分子數(shù)DNA

探針隨機引物標(biāo)記法Klenow

片段；每

25-36

個核苷酸

1

個六核苷酸引物缺口平移法DNaseI

和DNA

聚合酶I每

25-36

個核苷酸

1

個PCR

法Taq

DNA

聚合酶每

25

個核苷酸

1

個cDNA

探針逆轉(zhuǎn)錄法AMV

逆轉(zhuǎn)錄酶每

25-36

個核苷酸

1

個寡核苷酸探針3’末端標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3’末端只有一個3’末端加尾標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶每

12

個核苷酸

1

個5’末端標(biāo)記化學(xué)法5’末端只有一個RNA

探針體外轉(zhuǎn)錄法噬菌體

SP6、T3

和T7

RAN

聚合酶每

25-36

個核苷酸

1

個58探針的純化591、乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質(zhì)2、凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是SephadexG-503、微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針60四、核酸探針的檢測放射性同位素標(biāo)記探針放射自顯影非放射性同位素標(biāo)記探針偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)四、核酸探針的檢測-放射性探針的檢測放射自顯影接觸法液體乳膠法接觸法61液體乳膠法62放射自顯影是指利用放射線在x線片的成影作用來檢測雜交信號。過程：取出雜交膜，在Whatman濾紙上晾干，用保鮮膜包好，在暗室中置于X線片上，加增感屏，固定于暗盒內(nèi)，-70℃曝光適當(dāng)時間（1-7天），在暗室中取出X線片，顯影、定影，即可在X線片上讀出雜交帶。1．偶聯(lián)反應(yīng)2．顯色反應(yīng)(1)酶促顯色法(2)熒光法

(3)化學(xué)發(fā)光法非放射性探針檢測示意圖63四、核酸探針的檢測-非放射性探針的檢測64Dig：半抗原，可通過抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)Dig-DNA探針

+

抗Dig抗體-堿性磷酸酶（或辣根過氧化物酶）+

底物（1）偶聯(lián)反應(yīng)65（2）顯色反應(yīng)酶法 通過酶促反應(yīng)使其底物形成有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物堿性磷酸酶：BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸鹽-4-甲基胺藍）NBT（四氮唑藍辣根過氧化物酶：DAB（二氨基聯(lián)苯胺）→紅棕色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）→藍色66四、核酸探針的檢測-非放射性探針的檢測常用核酸探針的標(biāo)記和檢測標(biāo)記分子標(biāo)記方法檢測方法[α32P]dNTPNT、PCR、RP放射自顯影或計數(shù)[γ32P]dNTPTL放射自顯影或計數(shù)35SNT放射自顯影或計數(shù)3HNT放射自顯影或計數(shù)Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶標(biāo)親和素或酶標(biāo)光敏生物素可見光照射抗生物素抗體顯色生物素化補骨脂素紫外線照射抗生物素抗體顯色HRP戊二醛交聯(lián)法或過碘酸鈉法酶促底物顯色FITC和羅丹明合成法熒光顯微鏡觀察地高辛RP、NT酶標(biāo)抗體+底物顯色第三節(jié)

核酸分子雜交技術(shù)67分子雜交（hybridization）：樣品核酸變性處理后，在合適溫度條件下，加入標(biāo)記的核酸探針，探針與樣品互補序列形成雜交雙鏈，通過顯示標(biāo)記物或其它方法來檢測特定的核酸片段的技術(shù)。固相雜交探針被測DNA（RNA）在固體支持物上雜交液相雜交68探針被測DNA（RNA）在液體中雜交按照雜交的反應(yīng)條件分為固相和液相雜交兩類：69固相分子雜交：是將待測的靶核苷酸鏈預(yù)先固定在固體支持物上，然后放入含有標(biāo)記探針的雜交液中，進行雜交反應(yīng)后，使雜交分子留在支持物上，故稱固體雜交。固體雜交的優(yōu)點：未雜交的游離探針通過漂洗可容易除去，膜上的雜交分子容易檢測，還能防止靶DNA的自我復(fù)性，所以被廣泛應(yīng)用。液相雜交：待測樣品和雜交探針同時溶于雜交液中并在其中進行反應(yīng)。70分子雜交技術(shù)一般過程☆

探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素）☆

待測核酸樣品制備（分離，純化）☆

雜交（液相，固相，原位雜交）☆

雜交后處理（去掉非特異雜交分子）☆

顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）☆

結(jié)果分析7172核酸分子雜交技術(shù)類型雜交類型檢測目的及范圍Southern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子菌落雜交檢測固定在膜上，經(jīng)裂解從細菌體釋放的DNA分子正向斑點雜交檢測固定在膜上的DNA或RNA分子反向斑點雜交檢測樣品中的DNA或RNA分子微板雜交檢測固定微板孔上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細胞或組織上的DNA或RNA分子73一、Southern印跡雜交使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或

RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由英國人Edwin

MellorSouthern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫Southernblot。DNA變性中和Southern印跡預(yù)雜交雜交洗膜檢測Southern印跡雜交過程7475（一）待測核酸樣品的制備1、裂解或破碎細胞2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段76（二）待測DNA樣品的電泳分離1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶。3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記7778（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈

DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。（四）Southern印跡（轉(zhuǎn)膜）指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程。7980Southern印跡的常用方法81虹吸印跡法DNA片段<1kb，1小時DNA片段>15kb，18小時8283858687（五）Southern雜交1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA88（六）雜交結(jié)果檢測1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針89（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1、酶切圖譜分析2、特定基因定性和定量3、基因突變分析4、限制性片段長度多態(tài)性的分析90Northern印跡(Northern

blot)雜交是應(yīng)用DNA探針檢測特異mRNA的另一種膜上印跡技術(shù)是由Alwine于1977年建立的。后經(jīng)Thomas等人改進主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的轉(zhuǎn)錄情況二、Northern印跡雜交Northern印跡雜交流程圖919293與Southern印跡雜交比較：RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染所用的器材最好與Southern印跡實驗的分開使用RNA變性的方法：不能用堿變性，因為堿會水解RNA的2‘-羥基基團，在變性劑的存在下進行電泳,防止RNA分子形成發(fā)夾式的二級結(jié)構(gòu)，以保持其單鏈線形狀態(tài)Northern印跡雜交94印跡前將含變性劑的凝膠用水沖洗掉，

再印跡、雜交如果測定RNA片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進行Northern轉(zhuǎn)印95斑點雜交（Dot－blot）是將待檢樣品（DNA、RNA

或細胞）直接點到膜上，烘烤固定三、點雜交（Dot-blot）9697斑點雜交不需電泳和轉(zhuǎn)膜過程，整個操作過程簡便、快速但結(jié)果無法判斷核酸片段的大小，也無法判斷樣品溶液中是否存在著不同的靶序列多用作核酸定性或半定量分析，而且便于雜交條件的摸索斑點雜交（Dot-blot）98直接將不同的探針點印并固定在膜上，再將待測的DNA樣品與探針雜交，這樣一次雜交反應(yīng)就可以判斷DNA是否含有這些探針的同源序列。反向點雜交（reversedothybridization）99菌落雜交示意圖100四、菌落雜交101原位雜交（In

situ

hybridization

）是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其檢測的方法五、原位雜交它屬于固相分子雜交的范疇，但有別于其它任何固相核酸分子雜交技術(shù)102原位雜交技術(shù)除了具有核酸分子雜交的特異性高的特點之外，并可精確定位，因此該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的研究之中其應(yīng)用有以下幾方面：正?；虍惓Ｈ旧w的基因定位應(yīng)用核酸探針與細胞內(nèi)RNA進行雜交用于檢測該組織細胞中特定基因表達水平應(yīng)用特異的病原體核酸作為探針對組織、細胞進行雜交，以檢測有無該病原體的感染等五、原位雜交-特點與應(yīng)用103石蠟包埋組織切片冰凍切片細胞涂片培養(yǎng)細胞爬片（一）原位雜交材料104細胞或組織切片的處理玻片清洗組織和細胞的固定增強組織的通透性和核酸探針的穿透性預(yù)雜交雜交雜交后漂洗結(jié)果檢測（二）基本方法熒光原位雜交（fluorescence

in-situ

hybridization,FISH）是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術(shù)。五、原位雜交-熒光原位雜交熒光原位雜交是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法.105FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進化研究等許多領(lǐng)域。106熒光原位雜交的原理107108109基因（或DNA片段）的染色體定位；染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測；間期細胞遺傳學(xué)（絨毛/羊水/精子/卵裂

球/其它間期細胞研究與診斷）；病原體的檢測腫瘤遺傳學(xué)研究110熒光原位雜交的應(yīng)用FISH基因定位熒光原位雜交（FISH）檢測HER-2致癌基因：Her-2基因；位點：17q11.2-q12；編碼蛋白：跨膜蛋白（與表皮生長因子受體部分同源）；

25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴增；檢測HER-2的意義HER-2作為預(yù)后的指標(biāo)Her-2蛋白過度表達病人中，5年生存率28％，而Her-2陰性者則為71％。

HER

-2

基因擴增與乳腺癌患者無瘤生存期和總體生存期顯著縮短相關(guān)。HER-2作為化療方案的選擇和反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)HER-2高表達的乳腺癌患者對CMF聯(lián)合化療、三苯氧胺治療以及單獨的激素療法產(chǎn)生耐受，而對泰索帝

(docetaxel,

taxotere)、含蒽環(huán)類藥物（阿霉素、表阿霉素）的治療則更敏感。HER-2作為治療的靶點Herceptin

對Her-2基因擴增（HER-2蛋白高表達）的患者有明確的療效。結(jié)果判斷統(tǒng)計Ratio值（計數(shù)浸潤性部分的20個細胞）Ratio值＝20個細胞核中紅信號總數(shù)/綠信號總數(shù)Ratio＜1.8為陰性結(jié)果Ratio＞2.2或眾多信號連接成簇時可不計算為陽性結(jié)果比值2～4為低度擴增4～10為中度擴增>10為高度擴增Ratio在1.8-2.2 之間時，則需要再計數(shù)20個細胞核中的信號