甘草甜素對大鼠腎小球硬化早期保護(hù)作用的研究

甘草甜素對大鼠腎小球硬化早期保護(hù)作用的研究

腎衰竭是腎衰竭的主要病理基礎(chǔ)。病理改變的特點是大量外基質(zhì)（ecm）積聚。根據(jù)研究，轉(zhuǎn)化生長因子1（tgf-1）、遺傳生長因子（ctgf）、基底金屬酶（pmps）及其金屬酶（imps）和金屬酶（tips）等細(xì)胞因子的出現(xiàn)是一致的，最終導(dǎo)致腎衰竭。腎小球硬化在臨床上尚無特效治療方法,多采用激素、免疫抑制劑、細(xì)胞毒藥物、血漿置換等綜合治療。甘草甜素(glycyrrhizin)又稱甘草酸,是甘草中最主要的活性物質(zhì),因其有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、類腎上腺皮質(zhì)激素樣等作用,已被用于治療肝肺纖維化等疾病,而有關(guān)甘草甜素在腎小球硬化方面的研究報道較少。本研究以大鼠腎小球硬化模型為研究對象,觀察甘草甜素對阿霉素致腎小球硬化模型大鼠尿蛋白、血脂、腎功能等臨床指標(biāo)及TGF-β1、CTGF、TIMP-1細(xì)胞因子的影響,探討甘草甜素對腎小球硬化早期的防護(hù)作用。1材料和方法1.1動物雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,月齡2~3月,購自廣州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。1.2甘草甜素/片甘草甜素(復(fù)方甘草酸苷片,商品名:美能),日本米諾發(fā)源制藥株式會社產(chǎn)品,由深圳健安醫(yī)藥有限公司提供,進(jìn)口注冊證號:H20030184,含甘草甜素25mg/片。鹽酸阿霉素(注射用鹽酸多柔比星,由深圳萬樂藥業(yè)有限公司提供,批號0408E1,10mg/支)。TGF-β1和CTGF兔抗大鼠一抗及即用型SABC免疫組化試劑盒(SA1022)均購自武漢博士德公司。Taq酶(德國AppliChem公司);M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖系統(tǒng)(美國Promega公司)。2腎組織中rna的表達(dá)及檢測2.1動物模型的制備與分組:大鼠給予普通飼料,常規(guī)自由飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為3組,即模型組、治療組和對照組。模型組尾iv阿霉素5mg/kg,第7天重復(fù)尾iv阿霉素3mg/kg。治療組同模型組方法造模,第1次iv阿霉素后次日開始ig給予甘草甜素200mg/kg,每日1次,至實驗結(jié)束,第2次iv阿霉素后開始計時。對照組iv生理鹽水替代阿霉素,每只約注射1mL。分別于第4、6、8周每組各處死大鼠6只。2.224h尿蛋白定量及血液生化測定:分別于第4、6、8周時將大鼠放入代謝籠中,收集24h尿液,用溴甲酚氯仿法測24h尿蛋白定量。隨后,第4、6、8周所有大鼠用10%水合氯醛0.5mL/100gip麻醉后,置手術(shù)臺,暴露腎臟和腹主動脈。經(jīng)腹主動脈快速采血3mL,采用奧林巴斯AU2700型全自動生化分析儀測定血中尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、膽固醇(TC)和白蛋白(Alb)。2.3腎組織病理學(xué)檢查:大鼠處死采血后,迅速取出一側(cè)腎臟,將腎皮質(zhì)平均分為6小塊,每塊約100g,放入液氮罐凍存,用于提取RNA。剪取另一側(cè)腎臟,取少許腎皮質(zhì)用10%中性福爾馬林固定,進(jìn)行Masson染色用于光鏡及免疫組織化學(xué)檢測。Masson染色后,光鏡下觀察腎組織病理改變,根據(jù)Racková等的方法評估腎小球硬化程度,每張切片至少觀察30個腎小球,根據(jù)腎小球硬化灶所占腎小球比例分級,將切片中每個腎小球硬化程度分為0~4級。0級:腎小球基本正常;1級:腎小球硬化面積≤25%;2級:25%<腎小球硬化面積≤50%;3級:50%<腎小球硬化面積≤75%;4級:75%<腎小球硬化面積≤100%。計算腎小球硬化指數(shù)[GSI,GSI=(1N1+2N2+3N3+4N4)/切片中腎小球總數(shù)×100%,N1、N2、N3、N4分別代表1、2、3、4級硬化的腎小球個數(shù)]。2.4免疫組織化學(xué)檢測:采用SABC法檢測腎組織中的TGF-β1和CTGF的蛋白。片中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果,每組染色以PAS代替一抗作為陰性對照,以一抗試劑公司提供的陽性對照片作為陽性對照。采用捷達(dá)801高清晰形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。每張標(biāo)本按順序選5個視野,計算每個視野內(nèi)染色區(qū)域的平均吸光度,以均值計算每個標(biāo)本的吸光度,最后以每組的均值進(jìn)行比較,用積分吸光度表示指標(biāo)的相對陽性表達(dá)量。2.5熒光定量PCR方法檢測:用Trizol試劑提取腎組織細(xì)胞總RNA,紫外分光光度儀測RNA濃度及A260/A280。取RNA2μg進(jìn)行RT反應(yīng),RT產(chǎn)物用紫外分光光度計測濃度后調(diào)整為100ng/μL。每個樣品取2μLRT產(chǎn)物在熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR檢測TGF-β1、CTGF和TIMP-1的mRNA表達(dá),TGF-β1、CTGF和TIMP-1以及內(nèi)參β-actin引物用PrimerPremere5.0設(shè)計,TGF-β1正、反義引物序列分別為:5′-GTGGACCGCAACAACGCA-3′,5′-ACCAAGGTAACGCCAGGGA-AT-3′,片段長度209bp。CTGF正、反義引物序列分別為:5′-GCGTAAAGCCAGGGAGTA-3′,5′-AGCAGTTAGGAACCCAGATT-3′,片段長度133bp。TIMP-1正、反義引物序列分別為:5′-CAAGTCCCAGAACCGCAGC-3′,5′-GGCAGGC-AGGCAAAGTGAT-3′,片段長度281bp。β-actin正、反義引物序列分別為:5′-GACCTTCAACACCCCAGCCA-3′,5′-GTCACGCACGATTTCCCT-CTC-3′,片段長度258bp。PCR擴增產(chǎn)物在熒光定量PCR儀上做熔解曲線,只有一個峰,瓊脂糖凝膠電泳只有一條泳帶,說明擴增產(chǎn)物特異。以β-actin為引物進(jìn)行PCR,將PCR產(chǎn)物割膠回收,用紫外分光光度計對回收產(chǎn)物定量,再等比稀釋,得到已知不同濃度的β-actinDNA片斷。以已知不同濃度的β-actinDNA片斷為底物,同時進(jìn)行PCR,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。其他引物與內(nèi)參β-actin同時進(jìn)行PCR,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線的同時,得到相應(yīng)基因表達(dá)量。2.6統(tǒng)計學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)結(jié)果用ˉx±s表示,統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.0軟件分析,組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),若差異顯著進(jìn)行兩兩比較,組間方差齊者采用LSD法,方差不齊采用Dunnett′sT3法。3結(jié)果3.1血生化指標(biāo)的檢測24h尿蛋白和血液生化指標(biāo)的變化:與對照組比較,模型組第4、6、8周大鼠24h尿蛋白定量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,治療組第4、6、8周大鼠24h尿蛋白定量明顯降低(P<0.01)。見表1。模型組與對照組比較,第4、6、8周血液生化指標(biāo)(BUN、SCr、TC和Alb)有顯著性差異(P<0.01)。治療組第4、6、8周血液生化指標(biāo)(BUN、SCr、TC和Alb)較模型組明顯改善,兩組有顯著性差異(P<0.05)。見表2。3.2治療前后大鼠血清型半神經(jīng)損傷的變化光鏡檢查結(jié)果表明,模型組第4周大鼠系膜細(xì)胞增生和上皮細(xì)胞空泡變性,細(xì)胞外基質(zhì)逐漸增加;6周細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多,毛細(xì)血管塌陷,出現(xiàn)局灶節(jié)段性硬化;8周后腎小球數(shù)量明顯減少,腎小球內(nèi)出現(xiàn)玻璃樣變,80%腎小球結(jié)構(gòu)破壞,腎小管萎縮呈腎小球硬化的改變。治療組第4周大鼠系膜細(xì)胞輕度增生及細(xì)胞空泡較輕;6周系膜細(xì)胞輕度增生,細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少,毛細(xì)血管塌陷減輕;8周腎小球呈部分局灶節(jié)段性硬化。腎組織病理改變治療組明顯輕于模型組。結(jié)果見圖1。3.3各組腎硬化指數(shù)(GSI):模型組和治療組大鼠GSI較對照組明顯增高(P<0.01),治療組較模型組明顯降低(P<0.01)。結(jié)果見表3。3.4各組tgf蛋白表達(dá)比較TGF-β1、CTGF蛋白的表達(dá):模型組4~6周大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加,8周時TGF-β1蛋白表達(dá)維持增加,但較前有所下降。治療組與模型組比較,4、6、8周時TGF-β1蛋白表達(dá)明顯下降,兩組有顯著性差異(P<0.01)。對照組TGF-β1無表達(dá)。模型組4~6周大鼠腎組織CTGF蛋白表達(dá)明顯增加,8周時CTGF蛋白表達(dá)下降。治療組與模型組比較,4~6周時CTGF蛋白表達(dá)下降,兩組有顯著性差異(P<0.01);8周時無顯著性差異(P>0.05)。CTGF在對照組無表達(dá)。見表4。3.5ctgfmrna表達(dá)變化TGF-β1、CTGF和TIMP-1mRNA表達(dá)的變化:模型組4周時出現(xiàn)TGF-β1mRNA的表達(dá)明顯上調(diào),并且達(dá)到高峰,6~8周時表達(dá)逐漸下降。治療組與模型組比較,4周時TGF-β1mRNA表達(dá)明顯下降,6~8周TGF-β1mRNA表達(dá)呈下降趨勢,兩組有顯著性差異(P<0.01)。模型組4周時CTGFmRNA出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),并持續(xù)表達(dá)增加,6周時達(dá)高峰,8周時CTGFmRNA的表達(dá)明顯下降。CTGFmRNA表達(dá)高峰出現(xiàn)時間晚于TGF-β1。治療組與模型組比較,4~6周CTGF出現(xiàn)mRNA表達(dá)下降,兩組有顯著性差異(P<0.01),8周時CTGFmRNA表達(dá)下降,兩組無顯著性差異(P>0.05)。模型組4周時TIMP-1mRNA出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),并持續(xù)表達(dá)增加,6周時達(dá)高峰,8周時TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯下降。TIMP-1mRNA表達(dá)峰值與CTGFmRNA表達(dá)峰值相似。治療組與模型組比較,4~6周出現(xiàn)TIMP-1mRNA表達(dá)下降,8周時TIMP-1mRNA表達(dá)明顯下降,兩組有顯著性差異(P<0.01)。見圖2和表5。4甘草甜素對腎組織病理學(xué)的作用甘草甜素又稱甘草酸,是甘草中最主要的活性物質(zhì),大量的臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn),甘草酸具有廣泛的生物學(xué)活性,如抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、防治肝損害、抗過敏、抗腫瘤、抗生物氧化和類腎上腺皮質(zhì)激素樣作用等,因而被廣泛用于治療病毒性肝炎、腎出血熱綜合征、皮膚病(包括多種病毒感染性皮膚病)、干燥綜合征、變態(tài)反應(yīng)性疾病以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病。近年來,有關(guān)甘草酸對腎臟疾病的治療作用,引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。王會玲等研究發(fā)現(xiàn),甘草酸對大鼠慢性馬兜鈴酸腎損害有一定的保護(hù)作用,能降低血肌酐,改善腎功能,在一定程度上減輕馬兜鈴酸造成的腎組織形態(tài)學(xué)改變,并減少腎間質(zhì)纖維化程度。Sohn等研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素通過調(diào)節(jié)水鈉通道來改善慶大霉素引起的急性腎衰竭大鼠腎功能。Yokozawa等發(fā)現(xiàn)甘草酸及其代謝產(chǎn)物明顯抑制腎缺血再灌注損傷大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)釋放,使內(nèi)源性抗氧化物酶(包括過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶)的活性得到恢復(fù),從而使血BUN和SCr明顯下降,對腎缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。然而有關(guān)甘草甜素對腎小球硬化早期防護(hù)作用方面的研究較少。本實驗采用兩次尾iv阿霉素制備成大鼠腎小球硬化模型,研究甘草甜素對腎小球硬化早期防護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),甘草甜素可以明顯減輕腎小球硬化大鼠的尿蛋白水平,提高血漿Alb、TC,改善腎功能。大量蛋白尿、高脂血癥等代謝紊亂不僅是慢性腎疾病的主要臨床表現(xiàn),而且還參與了腎小球硬化等進(jìn)行性腎臟損害的病理生理過程,對疾病預(yù)后影響重大。因此,上述結(jié)果提示,甘草甜素可以通過減輕蛋白尿、降低高脂血癥等作用對腎小球硬化起到早期防護(hù)作用,延緩腎臟進(jìn)行性損害。本研究還觀察到,甘草甜素可明顯減輕腎小球系膜細(xì)胞增生,使腎小管上皮細(xì)胞空泡變性明顯減少,減輕ECM的積聚,減輕腎小球硬化的程度,降低GSI,從而延緩腎小球硬化形成的病理進(jìn)程。大量研究表明,腎小球硬化主要由于ECM合成與降解失衡造成,多種細(xì)胞因子參與ECM的合成與降解過程,如TGF-β1、CTGF、PA/PAI、MMPs/TIMP等。TGF-β1可以直接刺激ECM各成分(LN、FN和ColⅣ)合成增加,還可以通過調(diào)節(jié)CTGF、PA/PAI、MMPs/TIMP等其他細(xì)胞因子表達(dá),間接減少ECM的降解,最終導(dǎo)致ECM堆積,發(fā)生腎小球硬化。研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素可能通過下調(diào)腎小球基底膜NF-kappaB表達(dá)來降低ColⅢ合成,同時還可下調(diào)CTGF和TGF-β1的表達(dá),從而延緩腎病大鼠腎小球纖維化的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn),甘草甜素可以抑制TGF-β1和CTGF蛋白及mRNA表達(dá),同時還可明顯抑制TIMP-1mRNA的表達(dá),而上述細(xì)胞因子在腎小