銀杏內(nèi)生黃酮菌的分離篩選

銀杏內(nèi)生黃酮菌的分離篩選

0內(nèi)生菌的利用銀杏提取物含有各種活性成分，有利于人類健康。其中，黃酮類物質(zhì)被廣泛研究和使用。目前,雖然利用銀杏葉工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的技術(shù)已成熟,但由于銀杏黃酮主要從植株或葉中提取,這在生產(chǎn)上受到很大限制,也會引起資源的枯竭。研究表明,植物內(nèi)生菌幾乎存在于所有目前已研究過的植物中,并且一些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或者相似的生理活性成分。如果能利用內(nèi)生菌,實現(xiàn)銀杏黃酮的微生物發(fā)酵體外培養(yǎng),則可使銀杏黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)不受植物資源的限制,并可防止銀杏資源的日益短缺。但是,利用內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)存在兩大問題:一是微生物傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定性;二是黃酮體外發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)量較低。本研究的目的是從銀杏根、莖中分離出產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生菌,并進行體外傳代培養(yǎng),初步分析銀杏黃酮體外發(fā)酵培養(yǎng)的可行性。1材料和方法1.1植物材料在寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi),取樹體健康、無病蟲害的幼齡銀杏樹的根、莖,采集后48h內(nèi)進行菌種分離。1.2銀杏枝條浸汁的制備改良固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入銀杏根部樹皮浸汁20%(體積分?jǐn)?shù)),2%瓊脂,即得。改良固體PDA培養(yǎng)基:在PDA培養(yǎng)基中加入銀杏根部樹皮浸汁20%(體積分?jǐn)?shù)),2%瓊脂,即得。改良固體察氏培養(yǎng)基:在察氏培養(yǎng)基中加入銀杏根部樹皮浸汁20%(體積分?jǐn)?shù)),2%瓊脂,即得。改良固體高氏1號培養(yǎng)基:在高氏1號培養(yǎng)基中加入銀杏根部樹皮浸汁20%(體積分?jǐn)?shù)),2%瓊脂,即得。銀杏根部樹皮浸汁的制備:取根部樹皮200g,清水洗凈,削成2cm×2cm小塊,放入1L蒸餾水中煮沸30min,補充蒸餾水至1L。使用4層紗布濾過,即得。液體培養(yǎng)基:葡萄糖20g,花生餅粉3g,NH4Cl3g,KH2PO43g,MgSO4·7H2O3g,CaCO34g,NaAc·3H2O1g,自來水定容至1L,pH值為6.0,分裝40mL/250mL三角瓶,121℃滅菌30min。1.3方法1.3.1表面消毒和切割分別選取新鮮的銀杏根、莖,用洗潔精水將其洗凈后,流水沖洗6h,放入裝有蒸餾水的燒杯中,在超聲洗滌器中洗滌20min。洗凈的材料各取5g,按下列程序進行表面消毒:體積分?jǐn)?shù)為75%酒精漂洗(1min)→無菌水沖洗5次→8%的次氯酸鈉漂洗(10min)→無菌水沖洗5次,最后一次洗液置于滅菌的小燒杯中。將經(jīng)過無菌處理的樣品在無菌條件下,切割成1cm左右的方塊,然后將其切割面與培養(yǎng)基接觸,放置于培養(yǎng)皿中。以上各處理均重復(fù)2次,并將最后一次洗液涂于培養(yǎng)皿中作為對照。1.3.2連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)將處理好的樣品置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中,連續(xù)培養(yǎng)3~7d。在培養(yǎng)期間,將植體上長出的菌體用接種針依次轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上,分別進行編號,繼續(xù)置28℃恒溫箱中培養(yǎng)。1.3.3內(nèi)生菌的分離純化分別待平板上菌體萌發(fā),用平板劃線、涂布稀釋及直接用無菌小剪刀取尖端菌絲等分離純化方法,經(jīng)過反復(fù)的分離、純化過程,直至得到純化的典型菌落。根據(jù)其主要群體形態(tài)特征,包括菌落大小、顏色、表面特征和質(zhì)地。將所分離的內(nèi)生菌按微生物學(xué)不同的類群歸類。將已純化的菌株分別轉(zhuǎn)移置斜面培養(yǎng)基上,每株保存兩支斜面,28℃恒溫箱中培養(yǎng),待菌株生長旺盛時,取出置4℃保藏。1~2月后轉(zhuǎn)接入新的斜面,同前操作。1.3.4超聲波細(xì)胞破碎法接1環(huán)活化后的菌體于液體培養(yǎng)基中,溫度28℃,150r/min發(fā)酵7d。發(fā)酵結(jié)束后,用超聲波細(xì)胞破碎儀對搖瓶中菌體進行破碎,每瓶破碎30min。取破碎液在10000r/min下,離心20min,取上清液備用。1.3.5紫外燈下合成氧化鋁三氯化鋁反應(yīng):取樣品5mL置于試管中,加入體積分?jǐn)?shù)為1%的三氯化鋁乙醇溶液數(shù)滴,置于振蕩器上搖勻,放在紫外燈下看有無黃綠色熒光。氫氧化鈉反應(yīng):取樣品5mL置于試管中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液數(shù)滴,置于振蕩器上搖勻,看有無黃色出現(xiàn)。硼酸反應(yīng):取樣品5mL置于試管中,加入2%的硼酸溶液數(shù)滴,置于振蕩器上搖勻,看有無棕黃色出現(xiàn)。1.3.6tlc層析對照品為槲皮素;硅膠板為用硅膠自制硅膠薄板;展開劑為甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸=5∶4∶1;顯色劑為體積分?jǐn)?shù)3%三氯化鋁乙醇溶液。1.3.7hplc法一定體積的發(fā)酵上清液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃蒸發(fā)濃縮至干后,加入5mL浸提液,濃度為4mol/L甲醇∶HCl=7∶3(體積比),溫度為78℃避光水浴4h后4000r/min離心,取上清液進行HPLC檢測。色譜柱為C18(15cm×4mm);流速為0.8mL/min;檢測器為紫外檢測器;波長為360nm;柱溫為50℃;進樣體積為10μL;流動相為V甲醇︰VH2O︰V磷酸=45︰55︰0.1;以質(zhì)量濃度為20mg/L槲皮素甲醇溶液為標(biāo)準(zhǔn)品對照液。采用內(nèi)標(biāo)法,計算樣品中槲皮素的質(zhì)量濃度。1.3.8培養(yǎng)基培養(yǎng)方法經(jīng)顯色反應(yīng)與HPLC定性定量分析后的菌株,按常規(guī)方法進行鑒定。挑取純化的菌株尖端菌絲接種于察氏培養(yǎng)基上,按如下各種方法培養(yǎng)一段時間后觀察菌落、菌絲體和孢子的形態(tài)特征并進行鑒定。點植培養(yǎng)法(觀察菌落及常規(guī)鏡檢):用接種針從斜面上蘸極少量孢子,點植于平板上適當(dāng)?shù)奈恢?使成三角形的3點,倒置放于恒溫箱中28℃培養(yǎng)4,7,10d,觀察菌落特征。接種針從菌落邊緣處挑取少量菌絲,用乳酸石炭酸棉藍染色液染色,進行常規(guī)鏡檢。載片培養(yǎng)觀察法(觀察孢子及菌絲體形態(tài)):將培養(yǎng)基瓊脂置于載玻片上,接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng),真菌即在載玻片與蓋玻片之間有限的空間內(nèi)沿蓋玻片橫向生長。培養(yǎng)一段時間后,將載玻片置于顯微鏡下觀察。插片法(觀察基內(nèi)、外氣生菌絲):將真菌接種到平板上,插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng),使真菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻片上。觀察時輕輕取出蓋玻片,置于顯微鏡下觀察。1.3.9培養(yǎng)基、傳代保藏的銀杏內(nèi)生菌純菌落,莖活化后,轉(zhuǎn)至液體培養(yǎng)基中,28℃,150r/min培養(yǎng)48h,再次接種于液體培養(yǎng)基中傳代,每代培養(yǎng)基發(fā)酵7d后測定槲皮素質(zhì)量濃度。2結(jié)果與分析2.1植物內(nèi)生菌的分離純化本研究選用4種不同選擇培養(yǎng)基對銀杏的根、莖進行內(nèi)生菌的分離純化,結(jié)果如表1所示。由表1可以看出,在這4種不同選擇培養(yǎng)基中都分離到了植物內(nèi)生菌,但分離到的數(shù)量不同,牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基分離得到16株,高氏1號培養(yǎng)基分離得到20株,察氏培養(yǎng)基分離得到17株,PDA分離得到19株,共分離內(nèi)生菌72株。2.2不同菌株的內(nèi)生放線菌數(shù)量銀杏內(nèi)生菌株存在不同種類,其中,內(nèi)生細(xì)菌71株,內(nèi)生真菌49株,內(nèi)生放線菌6株(見表2)。由表2可以看出,細(xì)菌多而真菌較少,放線菌最少。這可能是細(xì)菌的活性較真菌強,更易侵入植物體的緣故。2.3氯化鋁及氧化鋁反應(yīng)用3種不同的顯色劑對72株銀杏內(nèi)生菌發(fā)酵液進行顯色反應(yīng),結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,三氯化鋁反應(yīng),只有2株菌株在紫外燈下可見黃綠色熒光;氫氧化鈉反應(yīng),只有1株菌株有黃色出現(xiàn);硼酸反應(yīng),無棕黃出現(xiàn)。由此可見,由于黃酮產(chǎn)率太低,顯色結(jié)果不理想。2.4顯色反應(yīng)與tlc檢測有3株菌株的發(fā)酵抽提物具有與標(biāo)準(zhǔn)樣遷移相同或相似的顯色斑點,初步表明這些菌株能分泌黃酮類化臺物。通過顯色反應(yīng)與TLC檢測可以看出,這兩種檢測方法只能定性不能定量,而且靈敏度較低,因此不能很好的篩選出能產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的銀杏內(nèi)生菌株。另外,從某種藥用植物中分離的內(nèi)生菌數(shù)目通常有幾十種至數(shù)百種之多,對每個菌株進行生物活性檢測或者發(fā)酵分離次生代謝產(chǎn)物的工作量極大,篩選效率也不高。2.5銀杏黃酮內(nèi)生菌c6的液相色譜檢測用HPLC對分離到的72株銀杏內(nèi)生菌進行產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的能力鑒定,槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜譜圖如圖1所示。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),有9株菌株能產(chǎn)生黃酮類化合物(見表4)。表4中,高氏1號培養(yǎng)基中有3株,察氏培養(yǎng)基中有6株;1株為放線菌,8株為真菌;5株來自于銀杏根,4株來自于銀杏莖。槲皮素最高產(chǎn)量可達9.14mg/L。其中一株產(chǎn)銀杏黃酮內(nèi)生菌C6的發(fā)酵液液相色譜譜圖如圖2所示。與圖1對比,圖2中C6發(fā)酵液中含有槲皮素這一黃酮類物質(zhì),但是在3.5min處也有一吸收峰,且峰面積大于槲皮素峰。已知銀杏黃酮是一類物質(zhì),它的3種主要成分是槲皮素、山奈酚和異鼠李素,而槲皮素的HPLC吸收峰保留時間先于山奈素、異鼠李素,由此可見,在3.5min處出峰的為一成分未知的物質(zhì)。其他8株產(chǎn)銀杏黃酮內(nèi)生菌高效液相色譜結(jié)果與其相似。由高效液相色譜檢測結(jié)果可見,這種方法能很好地檢出能產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的銀杏內(nèi)生菌株,具有快速、高效的特點。因此,用HPLC對藥用植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的宿主活性成分結(jié)構(gòu)類似物進行初步篩選,特別是對內(nèi)生菌產(chǎn)生的微量、高活性的宿主活性成分類似物進行篩選,可有效提高篩選效率。2.6同屬的鑒定結(jié)果根據(jù)形態(tài)鑒定,9株產(chǎn)黃酮銀杏內(nèi)生菌分別屬于8個不同的屬,鑒定結(jié)果分別是:D1為放線菌屬;D2,D3,C1為暗梗梭孢霉屬;C2,C5為交鏈孢屬;C3為匐柄霉;C4為蜜孢霉;C6為鐮孢霉屬(見表5)。2.7形態(tài)特征的描述2.7.1保菌絲的制備內(nèi)生菌株D1在高氏1號培養(yǎng)基平板上,菌落較小,扁平,表面干燥粉粒狀,白色不透明。顯微觀察菌絲體纖細(xì),菌絲有分枝、無橫隔,彎曲。在菌絲體內(nèi)產(chǎn)生厚膜孢子(見圖3),橢圓形比菌絲的徑大一些。根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu),初步鑒定內(nèi)生菌株D1是屬于放線菌綱(Actinomycetes)放線菌目(Actinomycetales)放線菌屬(Actinomycea)的放線菌。2.7.2分生孢子的形態(tài)觀察內(nèi)生菌株D2,D3,C1在察氏培養(yǎng)基平板上,菌絲體白色,菌絲茂密,呈棉絮狀,邊緣全緣,產(chǎn)生粉紅色色素,背面紅色。顯微觀察菌絲體白色,菌絲有分枝、有橫隔。分生孢子梗不分枝,褐色;分生孢子與菌絲的區(qū)別不明顯,分生孢子生在梗的短枝上;孢子梭形(見圖4)。根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu),初步鑒定內(nèi)生菌株D2,D3,C1是屬于半知菌綱(FungiImperfecti)叢梗孢目(Moniliales)暗梗孢科(Dematiaceae)暗梗梭孢霉屬(FusellaSacc)的真菌。2.7.3頂生孢子拾遺內(nèi)生菌株C2和C5在察氏培養(yǎng)基平板上,菌落中心突起呈半球狀,中心白色隆起周圍褐色菌絲鋪展,菌絲體結(jié)構(gòu)致密。顯微觀察菌絲褐色、分枝、有橫隔。分生孢子梗暗色,頂生不分枝或分枝的孢子鏈(見圖5);分生孢子暗色,多單生也有串生,孢子橢圓形、卵形或倒短棒狀,有縱橫隔膜。根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu),初步鑒定內(nèi)生菌株C2和C5是屬于半知菌綱(FungiImperfecti)叢梗孢目(Moniliales)暗梗孢科磚格孢亞科(Dictyosporoideaeofdematiaceae)交鏈孢屬(Alternariasp)的真菌。2.7.4芽孢桿菌設(shè)計方法內(nèi)生菌株C3在察氏培養(yǎng)基平板上,菌落中心突起呈半球狀,中心白色隆起周圍暗綠色菌絲鋪展,邊緣全緣,并在周圍形成一同心環(huán)。顯微觀察菌絲較細(xì)、褐色、分枝、有橫隔。分生孢子梗不分枝,褐色;產(chǎn)孢細(xì)胞全壁芽式產(chǎn)孢,分生孢子多單生也有串生(見圖6),孢子橢圓形或倒短棒狀,褐色,磚格狀分隔,有橫直隔膜3~6個。根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu),初步鑒定內(nèi)生菌株C3是屬于半知菌綱(FungiImperfecti)叢梗孢目(Moniliales)暗梗孢科磚格孢亞科(Dictyosporoideaeofdematiaceae)匐柄霉(Stemphyliumsp)的真菌。2.7.5分生孢子座表生內(nèi)生菌株C4在察氏培養(yǎng)基平板上,菌絲體白色,產(chǎn)生黃色色素,表面干燥粉粒狀,中心突起呈乳頭狀。顯微觀察菌絲體纖細(xì),菌絲有分枝、有橫隔。分生孢子梗小或無;產(chǎn)生分生孢子座,表生,表面隆起:分生孢子小,頂生,卵圓形,單細(xì)胞(見圖7)。根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu),初步鑒定內(nèi)生菌株C4是屬于半知菌綱(FungiImperfecti)叢梗孢目(Moniliales)瘤座孢科(Tuberculariaceae)蜜孢霉(Sphaceliasp)的真菌。2.7.6內(nèi)生真菌種類及形態(tài)分析內(nèi)生菌株C6在察氏培養(yǎng)基平板上,菌絲體白色,菌落氣生菌絲發(fā)達,呈白色絨毛狀。顯微觀察菌絲分枝,有隔,無色透明;分生孢子梗單生或集成分生孢子座;分生孢子無色,有大小兩種:大型孢子多細(xì)胞,微彎或兩端尖而彎曲呈鐮刀狀(見圖8);小型孢子多數(shù)單細(xì)胞,卵形。根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu),初步鑒定內(nèi)生菌株C6是屬于半知菌綱(FungiImperfecti)叢梗孢目(Moniliales)瘤座孢科(Tuberculariaceae)鐮孢霉屬(Fusariumsp)的真菌。在所分離得到的產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌,鑒定結(jié)果分別屬于匐柄霉、暗梗梭孢霉屬、交鏈孢屬、鐮孢霉屬、蜜孢霉,其中以叢梗孢目居優(yōu)勢類群。首次發(fā)現(xiàn)了一株放線菌,鑒定結(jié)果為放線菌屬,也產(chǎn)黃酮。2.8產(chǎn)黃酮穩(wěn)定性測定9株產(chǎn)黃酮銀杏內(nèi)生菌的傳代穩(wěn)定性如表6所示。由表6可以看出,9株菌株中,有5株能夠保持3代產(chǎn)黃酮的穩(wěn)定性,另外4株產(chǎn)黃酮的穩(wěn)定性只能保持2代。由此可見,當(dāng)菌株從宿主銀杏中分離出來之后,其代謝黃酮的能力并不能保持較為持久的穩(wěn)定性。3銀杏內(nèi)生菌的產(chǎn)黃酮研究表明,由于銀杏