第十一章 克隆與醫(yī)學(xué)

第十一章克隆與醫(yī)學(xué)

1997年2月23日，英國(guó)科學(xué)家Wilmut等宣布通過(guò)克隆技術(shù)，獲得了世界上第一只來(lái)源于體細(xì)胞的克隆羊——Dolly，“克隆”問(wèn)題成為科技界、法律界、宗教界、各媒體及全社會(huì)熱烈討論的話題。克隆牛（Kato,1998）

克隆小鼠(Wakayama,1998)克隆猴“太特拉”克隆的熒光小豬(左)和正常小豬(右)

克隆貓CC(威蘇辛,2002)

克隆兔(保羅·雷納德,2002)克隆馬“普羅梅泰亞”在意大利出生。后面是它的“母親兼姐姐”。

克隆騾子(戈登·伍茲,2003）克隆狗“斯納皮”第一節(jié)克隆及治療性克隆的概念1.1．克隆的一般概念克隆(clone)：指通過(guò)無(wú)性方式由單個(gè)細(xì)胞或個(gè)體產(chǎn)生的、和親代非常相似的一群細(xì)胞或生物體，在不發(fā)生突變的情況下，一個(gè)克隆內(nèi)的所有成員具有完全相同的遺傳構(gòu)成。

克隆的概念強(qiáng)調(diào)：以無(wú)性的方式進(jìn)行增殖或繁殖一個(gè)克隆中的每一成員其遺傳構(gòu)成完全相同克隆與醫(yī)學(xué)克隆在分子水平的層次個(gè)體克隆組織器官克隆細(xì)胞克隆分子克隆克隆按照目的來(lái)分類(lèi)生殖性克隆治療性克隆(1).分子克?。豪肈NA重組技術(shù)將特定基因或DNA序列插入載體或利用PCR技術(shù)獲得大量相同基因或DNA序列的過(guò)程?？寺≡诜肿铀降膶哟螌?dǎo)入擴(kuò)增(2).細(xì)胞克隆:

指的是一個(gè)祖先細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂，增殖而形成一群細(xì)胞，這些細(xì)胞具有相同的遺傳組成，該群細(xì)胞中的每一個(gè)細(xì)胞都含有相同的遺傳組成和特性，也稱(chēng)無(wú)性繁殖細(xì)胞系。(3).組織器官克?。簩Ⅲw細(xì)胞核移入到去核的卵細(xì)胞形成重構(gòu)胚，經(jīng)過(guò)一定處理，待發(fā)育到囊胚后，分離胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，純化、培養(yǎng)、篩選胚胎干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)分化成預(yù)定組織和器官的過(guò)程。(4).個(gè)體克?。荷矬w克隆，是指用無(wú)性繁殖的方法，從體細(xì)胞得到遺傳上與原來(lái)生物體完全相同的生物體，即人工復(fù)制生物體。1958年，Steward首次證實(shí)哈布蘭特的細(xì)胞全能性設(shè)想(1).生殖性克隆(reproductivecloning)是指對(duì)生物包括人個(gè)體的復(fù)制，即從被克隆的個(gè)體獲得細(xì)胞之后，將其植入被去除了遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞中，通過(guò)刺激使重構(gòu)胚分化發(fā)育到囊胚，然后植入母體的子宮里孕育，發(fā)育為與供體完全相同的遺傳組成的個(gè)體?？寺“凑漳康膩?lái)分類(lèi)1998年9月，多莉與威爾士山羊交配，自然懷孕生下一健康小羊，取名“邦尼”。(2).治療性克隆(therapeuticcloning)是指出于治療目的而克隆人的胚胎，提取胚胎干細(xì)胞，并使干細(xì)胞定向發(fā)育，培育出健康的可以修復(fù)或替代壞死受損的細(xì)胞、組織和器官，然后移植，治療疾病。目前的外科移植手術(shù)（心、肝、腎）常見(jiàn)問(wèn)題☆免疫排斥反應(yīng)☆器官的來(lái)源問(wèn)題人的治療性克?。ㄗ螅┖蜕承钥寺。ㄓ遥┥承钥寺〖爸委熜钥寺〉谋容^生殖性克隆治療性克隆最終產(chǎn)品動(dòng)物或人可用于治療的細(xì)胞、組織或器官克隆目的復(fù)制動(dòng)物或人修復(fù)受損的組織器官需要時(shí)間胚胎發(fā)育整個(gè)時(shí)間短，幾周移植子宮需要不需要法律限制對(duì)人禁止美、德等國(guó)反對(duì)；英、中等國(guó)支持相同點(diǎn)：兩者都是以細(xì)胞核移植為基礎(chǔ)第二節(jié)動(dòng)物克隆及治療性克隆技術(shù)的基本方法2.1．動(dòng)物克隆技術(shù)的基本方法動(dòng)物克隆技術(shù)的理論依據(jù)是細(xì)胞具有全能性。從理論上講，動(dòng)物體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞，包括已分化的體細(xì)胞，細(xì)胞核中都含有完全相同的遺傳信息，具發(fā)育的全能性。受體卵細(xì)胞質(zhì)中含有啟動(dòng)細(xì)胞核重新編程的各種因子，供體核在卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)因子的作用下，可以重新回到未分化狀態(tài)。2.1動(dòng)物克隆技術(shù)的基本方法動(dòng)物克隆的獲得的3個(gè)途徑胚胎分割技術(shù)：人工獲得同卵雙生細(xì)胞核移植技術(shù)：1、供體細(xì)胞2、受體細(xì)胞3、核移植4、重構(gòu)胚的培養(yǎng)及移植體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合技術(shù)：不移植核，供體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞直接融合?？寺∨c醫(yī)學(xué)2.1.1．胚胎分割技術(shù)克隆與醫(yī)學(xué)胚胎分割(embryosplitting)技術(shù)是指在2細(xì)胞期至囊胚期以前的早期胚胎用酶或者是機(jī)械方法分割，然后由分割的細(xì)胞分別發(fā)育產(chǎn)生新個(gè)體。用胚胎分割技術(shù)產(chǎn)生的后代數(shù)量有限，但方法較簡(jiǎn)單，可有效地獲得同卵孿生后代。2.1.2．細(xì)胞核移植技術(shù)原理：利用細(xì)胞拆合或細(xì)胞重組技術(shù)，將卵母細(xì)胞去核作為核受體，以不同來(lái)源細(xì)胞核作為核供體，將后者移入前者中，構(gòu)建重組胚，供體核在去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中重新編程，啟動(dòng)卵裂，開(kāi)始胚胎發(fā)育過(guò)程。動(dòng)物克隆技術(shù)的核心是核移植?？寺∨c醫(yī)學(xué)克隆與醫(yī)學(xué)細(xì)胞核移植技術(shù)的技術(shù)路線(1)供體細(xì)胞的準(zhǔn)備(2)受體細(xì)胞的準(zhǔn)備(3)核移植(4)重構(gòu)胚的培養(yǎng)及移植(1)供體細(xì)胞的準(zhǔn)備

用于細(xì)胞核移植的供體(donor)細(xì)胞有：早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞，它們可來(lái)自活體或體外培養(yǎng)的細(xì)胞。供體核處在GO/G1期：容易獲得最佳克隆效果。這時(shí)的細(xì)胞雖然代謝比較活躍，但細(xì)胞卻置身于細(xì)胞分裂周期之外；供體核處在Ｓ/G２期：受體卵母細(xì)胞質(zhì)指導(dǎo)的潛在的基因組復(fù)制將導(dǎo)致異常的發(fā)育。胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植

(2)受體細(xì)胞的準(zhǔn)備

核移植的受體(recipient)細(xì)胞有：去核卵細(xì)胞、受精卵和2細(xì)胞胚胎，其中多以卵細(xì)胞作為受體。卵細(xì)胞一般采用超排卵法或卵巢的卵泡，經(jīng)體外培養(yǎng)成熟而獲得。將收集到的受體細(xì)胞經(jīng)顯微操作或其他方式去除細(xì)胞核。

供體細(xì)胞與受體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化。卵母細(xì)胞的去核：(3)核移植利用顯微操作技術(shù)，將供體核移入去核受體細(xì)胞質(zhì)形成重構(gòu)胚。卵子的激活：在正常受精過(guò)程中，精子穿過(guò)透明帶及卵黃膜時(shí)，引起卵子內(nèi)鈣離子濃度升高，卵子細(xì)胞周期恢復(fù)，啟動(dòng)胚胎發(fā)育，這一現(xiàn)象稱(chēng)為激活。胚胎克隆時(shí)，通常用一定強(qiáng)度的電脈沖作用卵母細(xì)胞。(4)重構(gòu)胚的培養(yǎng)及移植完成核移植后形成的單個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)一段時(shí)間，或者是移入離體輸卵管（同種或異種）進(jìn)行體外培養(yǎng)，待獲得發(fā)育的重構(gòu)胚（囊胚或桑椹胚）后再移入雌性子宮或輸卵管進(jìn)行發(fā)育，直到出生。通過(guò)核移植得到的胚胎可作供體，再進(jìn)行細(xì)胞核移植，稱(chēng)再克隆。2.1.3．體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合技術(shù)供體細(xì)胞不一定是核，可以是含部分細(xì)胞質(zhì)甚至是整個(gè)細(xì)胞不進(jìn)行核移植，而是用細(xì)胞融合技術(shù)，使供核細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合獲得重構(gòu)胚融合方法有：電融合、化學(xué)融合、病毒融合等。2.2．治療性克隆技術(shù)克隆與醫(yī)學(xué)治療性克隆技術(shù)是克隆技術(shù)、胚胎干細(xì)胞技術(shù)、移植技術(shù)結(jié)合的一種綜合技術(shù)。Somaticcellnucleartransfer

directdifferentiationReplacetherapyEstablishofEScells2.2．治療性克隆技術(shù)取患者體細(xì)胞，體外培養(yǎng)，使細(xì)胞同步化顯微注射移入去核卵母細(xì)胞構(gòu)建重構(gòu)胚體外培養(yǎng)至囊胚分離細(xì)胞團(tuán)，獲得胚胎干細(xì)胞對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，定向誘導(dǎo)分化移植入患者病變部位，替代病損細(xì)胞、組織器官，達(dá)到治療的效果人的治療性克?。ㄗ螅┖蜕承钥寺。ㄓ遥┑谌?jié)動(dòng)物克隆技術(shù)的應(yīng)用前景3.1．動(dòng)物克隆技術(shù)與醫(yī)學(xué)克隆與醫(yī)學(xué)(1)克隆技術(shù)與醫(yī)藥生產(chǎn)

結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備動(dòng)物生物反應(yīng)器(2)克隆技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建疾病動(dòng)物模型(3)克隆技術(shù)與組織工程(4)動(dòng)物克隆技術(shù)與與基因療法結(jié)合治療遺傳疾病(1)克隆技術(shù)與醫(yī)藥生產(chǎn)克隆與醫(yī)學(xué)★將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與克隆技術(shù)有機(jī)結(jié)合，以動(dòng)物體細(xì)胞為受體，將藥用蛋白基因以DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，再以這些攜帶目的基因的體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動(dòng)物克隆?！飸?yīng)用克隆技術(shù)還可構(gòu)建疾病動(dòng)物模型，以研究疾病的發(fā)病機(jī)制、治療方案和防治措施。也可應(yīng)用體細(xì)胞克隆技術(shù)和干細(xì)胞技術(shù)研究疾病基因組、功能基因組、以及基因的功能。(2)克隆技術(shù)與組織工程克隆與醫(yī)學(xué)★組織工程(tissueengineering)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興交叉學(xué)科，它是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，創(chuàng)建組織和器官或替代物，植入體內(nèi)，修復(fù)組織缺損，替代損傷的組織、器官，達(dá)到提高生活、生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生命的目的?！锢弥委熜钥寺〖夹g(shù)獲得組織工程所需的胚胎干細(xì)胞可用于培育各種組織、器官進(jìn)行移植；也可接種于由生物可吸收材料構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)中，經(jīng)過(guò)適當(dāng)培養(yǎng)，形成具有一定組織結(jié)構(gòu)的移植物，移植于受損傷部位，細(xì)胞繼續(xù)分裂、分化、重組成新組織，避免排斥反應(yīng)。人耳鼠”是先使用可降解材料經(jīng)過(guò)耳形壓模，聚乳酸（PLA）溶液浸泡使其強(qiáng)度增強(qiáng)，制成耳廓支架材料，然后讓細(xì)胞在支架上繁殖生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)1-2周體外培養(yǎng)，在裸鼠背上割開(kāi)一個(gè)口子，植入“人耳”。隨后，“人耳”的支架會(huì)自己降解消失，“長(zhǎng)”在老鼠的背上。(3)與基因療法結(jié)合治療遺傳疾病克隆與醫(yī)學(xué)克隆技術(shù)與基因療法結(jié)合使用，能全面、徹底、高效地治療遺傳性疾病。但這只是理想的愿望，要克服技術(shù)上、倫理上的諸多困難，在目前情況下是不行的。3.2動(dòng)物克隆技術(shù)與遺傳育種克隆技術(shù)是一種無(wú)性繁殖技術(shù)，也稱(chēng)為生物復(fù)制技術(shù)，體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)明和發(fā)展極大地?cái)U(kuò)大了核供體的來(lái)源，利用其優(yōu)勢(shì)，復(fù)制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成為一個(gè)主要用途。

★擴(kuò)大優(yōu)良種群：提高育種效率；加快育種進(jìn)展

★保存基因資源

★拯救瀕危動(dòng)物★滿足生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特殊要求

3.3．克隆技術(shù)存在的