第八章節(jié)動(dòng)物遺傳操作

2023/10/18

2歡迎同學(xué)們學(xué)習(xí)《動(dòng)物遺傳學(xué)》動(dòng)物遺傳學(xué)主講教師：劉若余聯(lián)系電話13984812913第八章動(dòng)物遺傳操作Chapter8GeneticManipulation第一節(jié)概述什么是動(dòng)物遺傳操作？它有哪些優(yōu)勢？動(dòng)物遺傳操作是在分子和細(xì)胞水平上對(duì)動(dòng)物的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向修飾和重組的技術(shù)總稱，包括個(gè)體、細(xì)胞和分子水平上的遺傳重組與修飾。一方面，可將攜帶有不同優(yōu)良性狀基因的動(dòng)物個(gè)體通過雜交的方式產(chǎn)生后代，由于后代優(yōu)良性狀基因互補(bǔ)產(chǎn)生雜種優(yōu)勢（heterosis,hybridvigor），顯著提高生產(chǎn)性能；另一方面，通過細(xì)胞和分子水平上遺傳修飾，迅速改變動(dòng)物個(gè)體的遺傳特性，并在一定程度上實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的定向遺傳改良，培育出抗逆、耐粗、優(yōu)良的動(dòng)物新品種。二、動(dòng)物遺傳操作的技術(shù)途徑（一）人工受精（artificialinsemination）在動(dòng)物個(gè)體水平上集成不同種群優(yōu)良基因。意義：可克服地域隔離、種群個(gè)體大小差異難以交配等問題，且能迅速增加某一優(yōu)良基因在種群中的基因頻率，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的品種改良與新品種培育。（二）胚胎移植（embryotransplantation）將胚胎從一頭母畜的子宮內(nèi)取出，移植到另一頭生理狀態(tài)相同的同種母畜子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體的一種技術(shù)。意義：可利用普通的動(dòng)物種群繁殖高生產(chǎn)性能的優(yōu)良動(dòng)物種群，加快動(dòng)物育種的進(jìn)程。目前，在提高奶牛群體的產(chǎn)奶性能、推動(dòng)我國奶業(yè)的發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用。（三）胚胎嵌合（embryonicchimera）在胚胎發(fā)育的早期階段，將兩枚或以上不同遺傳特性的胚胎卵裂球分離，重新組合形成一枚具有不同遺傳背景的新胚胎，進(jìn)而產(chǎn)生不同遺傳特性組合的新個(gè)體。意義：打破了物種間的生殖隔離，將不同物種的遺傳特性聚合在一起，獲得新的育種材料。嵌合體的動(dòng)物最早出現(xiàn)在希臘神話中，它是“山羊”，它擁有羊身、獅頭和蛇尾，會(huì)噴火的一種怪物?，F(xiàn)代的克隆技術(shù)中，也有一種叫胚胎嵌合的技術(shù)。（四）細(xì)胞核移植（nucleartransfer）將一個(gè)供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到一枚去核的受體卵母細(xì)胞內(nèi)，使之重構(gòu)形成胚胎，進(jìn)而發(fā)育成為動(dòng)物個(gè)體的一種技術(shù)。意義：可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞核質(zhì)的雜交，使動(dòng)物能夠通過無性繁殖的方式產(chǎn)生后代，進(jìn)而使得高產(chǎn)動(dòng)物的優(yōu)良性狀得以穩(wěn)定遺傳，快速擴(kuò)殖高產(chǎn)的動(dòng)物群體（五）轉(zhuǎn)基因技術(shù)（genetransfer）在分子水平上對(duì)動(dòng)物的基因組進(jìn)行遺傳修飾，通過向動(dòng)物基因組中導(dǎo)入新的基因，或者對(duì)動(dòng)物基因組中的特定基因進(jìn)行修飾，進(jìn)而獲得具有特定遺傳性狀的動(dòng)物育種新材料。意義：可打破不同生物物種間的生殖間隔，將外源基因直接導(dǎo)入動(dòng)物個(gè)體中，是動(dòng)物遺傳操作最為快捷的技術(shù)途徑。法國分子內(nèi)分泌學(xué)家Seralini及其同事在2009年第7期《國際生物科學(xué)學(xué)報(bào)》上發(fā)表文章，討論給老鼠喂食三種孟山都（Monsanto）公司轉(zhuǎn)基因玉米的實(shí)驗(yàn)和分析結(jié)論。文中指出，老鼠在食用轉(zhuǎn)基因玉米三個(gè)月后，其肝臟、腎臟和心臟功能均受到一定程度的不良影響2010年4月16日，俄羅斯廣播電臺(tái)俄羅斯之聲以《俄羅斯宣稱轉(zhuǎn)基因食品是有害的》為題報(bào)道了一則新聞，該新聞稱，由全國基因安全協(xié)會(huì)和生態(tài)與環(huán)境問題研究所聯(lián)合進(jìn)行的試驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)基因生物對(duì)哺乳動(dòng)物是有害的；負(fù)責(zé)該試驗(yàn)的AlexeiSurov博士介紹說，用轉(zhuǎn)基因大豆喂養(yǎng)的倉鼠第二代成長和性成熟緩慢，第三代失去生育能力。俄羅斯之聲還稱“俄羅斯科學(xué)家的結(jié)果與法國、澳大利亞的科學(xué)家結(jié)果一致。當(dāng)科學(xué)家證明轉(zhuǎn)基因玉米是有害的，法國立即禁止了其生產(chǎn)和銷售”。第二節(jié)細(xì)胞遺傳操作一、細(xì)胞的建系培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出后分散成單個(gè)細(xì)胞，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長與增殖的技術(shù)。可分為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞。體細(xì)胞建系培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞建系培養(yǎng)原生殖多能干細(xì)胞建系培養(yǎng)精原干細(xì)胞(一)體細(xì)胞建系培養(yǎng)1.取材取材是動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟，若取材不當(dāng)，會(huì)直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)效果。2.原代培養(yǎng)（primaryculture）將動(dòng)物特定組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞或小的組織塊，置于合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境中，使細(xì)胞得以生存生長和增長，這一過程稱原代培養(yǎng)。（1）消化培養(yǎng)法（2）組織塊培養(yǎng)法3.傳代培養(yǎng)（passage）隨著原代培養(yǎng)的細(xì)胞增值，單層培養(yǎng)的細(xì)胞相互匯合，整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，這時(shí)需要進(jìn)行消化、傳代培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因?yàn)榻佑|抑制而影響生長。細(xì)胞由原代培養(yǎng)瓶內(nèi)消化，并按一定比例稀釋后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)的過程為傳代培養(yǎng)。4.細(xì)胞系的維持細(xì)胞系的維持是通過換液、傳代、再換液、再傳代和細(xì)胞冷凍保存實(shí)現(xiàn)的。需要注意記錄完整的細(xì)胞系檔案，如組織來源、培養(yǎng)液條件、傳代換液規(guī)律、細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志等等。

（二）胚胎干細(xì)胞建系培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）是從早期胚胎卵裂球或囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）分離培養(yǎng)獲得的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化多能細(xì)胞。ES細(xì)胞的生物學(xué)特性（1）全能性和多能性全能性（totipotenty）：ES細(xì)胞具有發(fā)育成完整動(dòng)物個(gè)體的能力。多能性（pluripotency）：ES細(xì)胞具有發(fā)育為多種組織的能力。（2）ES細(xì)胞的體外增值特性（3）ES細(xì)胞的可操作性（4）ES細(xì)胞的形態(tài)特性：細(xì)胞核大，胞質(zhì)少，體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞排列緊密，程集落狀生長，形似鳥巢，邊緣折光性強(qiáng)。（三）原生殖多能干細(xì)胞建系培養(yǎng)原生殖多能干細(xì)胞(primordialgermcell，PGC)是指性腺原始生殖細(xì)胞經(jīng)分離培養(yǎng)后得到的一類具有多能性的細(xì)胞。1.原生殖多能干細(xì)胞的分離方法2.原生殖多能干細(xì)胞的傳代方法

（四）精原干細(xì)胞精原干細(xì)胞（spermatogonialstemcell，SSC）是睪丸曲細(xì)精管生精上皮內(nèi)可復(fù)制的多潛能雙倍體細(xì)胞，并始終保持著干細(xì)胞的原始狀態(tài)直到青春期。精原干細(xì)胞是雄性動(dòng)物中唯一可以自我增殖、更新并向下一代傳遞遺傳信息的細(xì)胞類型。對(duì)精原干細(xì)胞的操作和修飾在建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、制備乳腺生物反應(yīng)器等方面有重要意義。動(dòng)物物乳腺生物反應(yīng)器是基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)，使外源基因?qū)雱?dòng)物基因組中并定位表達(dá)于動(dòng)物乳腺，利用動(dòng)物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在動(dòng)物的乳汁中生產(chǎn)一些具有重要價(jià)值產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的總稱。利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)點(diǎn)有：（1）生物活性高，無污染。動(dòng)物乳腺有完整的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，從而保證了產(chǎn)品的高生物活性。（2）易分離提純，成本低廉?，F(xiàn)有的一些人藥物蛋白之所以昂貴，除了原料難以收集外，另一原因是分離提純極為困難成本極高。而動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)物直接經(jīng)乳汁分泌出體外，只需用常規(guī)方法除去酪蛋白沉淀乳清，再經(jīng)層析即可得到重組蛋白，已經(jīng)建立起完整的分離純化生產(chǎn)程序。（3）產(chǎn)量高。外源基因在動(dòng)物乳腺中的表達(dá)量可以達(dá)到每升幾克到幾十克，小群轉(zhuǎn)基因大家畜的產(chǎn)量即可滿足全世界市場的需求。動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域最具開發(fā)應(yīng)用前景的尖端方向。

二、基因打靶（genetargeting）1.定義應(yīng)用同源重組原理將外源DNA定點(diǎn)整合到宿主細(xì)胞基因組，替代靶序列整合在預(yù)定的基因位點(diǎn)，從而改變細(xì)胞甚至生物個(gè)體遺傳特性的遺傳操作方法。2.意義利用基因打靶，可以將某個(gè)基因敲除（geneknockout），使之失去功能，繼而通過表型分析研究該基因編碼的特異蛋白的功能，詮釋基因功能，是功能基因組學(xué)研究的有力工具?？梢酝ㄟ^將正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到靶向基因治療的目的。還可以將某些藥物用蛋白基因定點(diǎn)敲入高等生物基因組中的高表達(dá)基因座，獲得高效的生物反應(yīng)器?；蚯贸腔虼虬屑夹g(shù)的一種，類似于基因的同源重組。指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變。三、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染（celltransfection）是指外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的過程。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞有兩種類型：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，并未整合到細(xì)胞的染色體，而是應(yīng)用宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)瞬時(shí)表達(dá)外源基因，一般在基因?qū)爰?xì)胞1~4d后收獲細(xì)胞進(jìn)行目的基因表達(dá)分析，外源基因DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)逐步降解。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：需要外源基因整合到宿主細(xì)胞的染色體上，從而得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，達(dá)到長期表達(dá)外源基因的目的。Humangenetherapy人的基因治療

（一）細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法1、磷酸鈣法2、陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低，操作簡單，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性，是目前常用的動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染效率受脂質(zhì)體成分、細(xì)胞種類及實(shí)驗(yàn)條件等諸多因素的影響。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法目前應(yīng)用最廣泛也是效率最高的外源基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，但由于其可能存在的遺傳毒性、免疫原性及難于像質(zhì)粒那樣大規(guī)模制備重組病毒而限制了應(yīng)用。4、電穿孔法（electroporation）理論上講電穿孔法可用于各種細(xì)胞，且不需要另外采購特殊試劑，但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高，此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA。每種轉(zhuǎn)染方法都有其局限性和適用范圍，不存在適合于所有細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法。

（二）陽性細(xì)胞的篩選方法1.陽性細(xì)胞的篩選策略目前常用的篩選策略有正負(fù)篩選法（postive-negativeselection，PNS）和正向選擇法（無啟動(dòng)子篩選法，無PolyA篩選法）兩類。2.陽性單克隆的篩選方法（三）陽性細(xì)胞的分子遺傳鑒定篩選得到抗性細(xì)胞克隆，表現(xiàn)出對(duì)G418的抗性和對(duì)GANC的耐受性，但此時(shí)目的基因是否發(fā)生了定點(diǎn)整合，仍需做進(jìn)一步的分子水平鑒定。中靶細(xì)胞的鑒定常采用PCR和Southern雜交分析的方法。PCR方法以快速、操作簡便的特點(diǎn)而廣泛適用于對(duì)大量樣品的快速鑒定，是一種比較理想的粗篩方法。其引物設(shè)計(jì)的特點(diǎn)是一條位于打靶載體的正選擇標(biāo)記基因內(nèi)，另一條位于同源短臂序列以外的旁側(cè)片段上。用PCR法篩選鑒定時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，原因可能是參入了其他細(xì)胞克隆或PCR鑒定載體，所以應(yīng)采用Southern雜交作進(jìn)一步的分析。第三節(jié)動(dòng)物克隆什么是動(dòng)物克??？指動(dòng)物不經(jīng)過有性生殖的方式而直接獲得與親本具有相同遺傳背景后代的過程，包括孤雌激活生殖、卵裂球分離與培養(yǎng)、胚胎分割以及核移植等。通常，將所有非受精方式繁殖所獲得的動(dòng)物均稱為克隆動(dòng)物，將產(chǎn)生克隆動(dòng)物的方法稱之為克隆技術(shù)。動(dòng)物克隆的意義有哪些？1.能使遺傳性狀優(yōu)秀的個(gè)體大量增殖，大大加快動(dòng)物育種進(jìn)展；2.可用來擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的后代數(shù)量，提高生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率；3.通過胚胎性別鑒定，再克隆，可生產(chǎn)出大量預(yù)知性別的動(dòng)物后代對(duì)于性別控制具有重要實(shí)踐意義；4.可用于珍稀和瀕危動(dòng)物的擴(kuò)繁和保種5.滿足生物醫(yī)學(xué)研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特殊需要，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。此外，以此技術(shù)為基礎(chǔ)，可以研究許多極為重要的基礎(chǔ)問題，如動(dòng)物個(gè)體發(fā)生的核質(zhì)互作關(guān)系、細(xì)胞核的去分化和重新編程問題以及重構(gòu)胚的線粒體變化、細(xì)胞的老化等問題動(dòng)物克隆研究的歷史和現(xiàn)狀我國哺乳動(dòng)物克隆研究雖起步較晚，但近年來也取得了長足進(jìn)展。1990年杜淼克隆出我國首例克隆動(dòng)物——家兔。胚胎細(xì)胞的克隆山羊、牛和豬已分別于1991，1995和1996年研究成功。山羊繼帶克隆的研究也已于1993年取得成功。近年來，體細(xì)胞克隆技術(shù)也在我國發(fā)展很快，體細(xì)胞克隆山羊和克隆牛分別于2000年和2001年研究成功，2004年11月和2005年3月又分別克隆成功世界首例胎兒體細(xì)胞克隆水牛和成年體細(xì)胞克隆水牛。“多莉”誕生十年，世界克隆進(jìn)展1996年第一只成年體細(xì)胞克隆羊“多利”誕生1997年一頭用胎盤克隆而成的荷蘭牛亮相。1998年兩頭由母牛細(xì)胞克隆而成的小牛在東京出生。一個(gè)國際研究小組宣布克隆出了三代實(shí)驗(yàn)鼠2000年曾參與克隆“多利”羊的英國公司培育了第一批克隆豬2001年一頭稀有品種的克隆亞洲牛誕生，兩天后死亡。2002年法國研究人員克隆出兔子。2003年美國科學(xué)家推出了一匹克隆騾。愛荷華州的研究人員稱他們克隆出了一頭瀕臨滅絕的爪哇野牛。2004年美國加利福尼亞的一家公司培育出了第一只克隆貓。這只貓后來成為第一只被賣出的克隆寵物。2005年韓國科學(xué)家宣布他們培育出了首條克隆狗叫“斯納皮”

羅斯林研究所科學(xué)家取一頭普通白綿羊的乳腺細(xì)胞，將細(xì)胞核移植到一個(gè)剔除了細(xì)胞核的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎，然后移植到第三頭羊的體內(nèi)?？茖W(xué)家共培育277個(gè)胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降臨人世。直到1997年2月23日才公布于眾。首條克隆狗叫“斯納皮”二、動(dòng)物克隆的方法細(xì)胞核移植的基本操作程序包括MII期（第二次減數(shù)分裂中期）卵母細(xì)胞的去核、供體細(xì)胞的準(zhǔn)備、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞融合、卵母細(xì)胞激活和重構(gòu)胚的培養(yǎng)等，其中的每一個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)核移植的效果都有影響。（一）供體細(xì)胞的準(zhǔn)備（二）受體細(xì)胞的準(zhǔn)備（三）注核（四）供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞的融合（五）重構(gòu)胚的激活（六）重構(gòu)胚的培養(yǎng)（七）繼代細(xì)胞核移植（一）供體細(xì)胞的準(zhǔn)備作為核供體的細(xì)胞可以是胚胎細(xì)胞，也可以是ES細(xì)胞或ES樣細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞、未分化的PGC或高度分化的成年動(dòng)物體細(xì)胞。供體核的種類和發(fā)育階段的不同，其核移植的效果仍存在著很大差異。1.胚胎作為核供體哺乳動(dòng)物胚胎細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從2細(xì)胞期到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎細(xì)胞都具有發(fā)育的全能性，都可以作為供體細(xì)胞。然而供體細(xì)胞的胚齡和類型對(duì)核移植結(jié)果有時(shí)產(chǎn)生一定的影響。供體細(xì)胞和受體細(xì)胞所處的細(xì)胞周期階段對(duì)核移植胚胎的發(fā)育（率）也有重要影響。2.體細(xì)胞作為核供體1997年，“多莉”的成功誕生表明成年哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞不僅具有基因組的全能性，而且還能在卵母細(xì)胞質(zhì)中回復(fù)到發(fā)育的起始狀態(tài)，完成整個(gè)個(gè)體發(fā)生過程。用體細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植時(shí)，亦須對(duì)其細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。調(diào)控供體細(xì)胞周期最為常用的方法是血清饑餓法。另一種方法是用Aphidicolin（APD）培養(yǎng)處理供體細(xì)胞。APD，一種哺乳動(dòng)物DNA聚合酶的可逆性抑制劑，可將細(xì)胞周期阻抑在G1到S期的過渡階段。不同種類的體細(xì)胞，其核移植效果存在著明顯差異。目前普遍認(rèn)為，顆粒細(xì)胞的核移植效果最好。3.胚胎干細(xì)胞作為核供體ES細(xì)胞具有體外發(fā)育的全能性，并且可以在體外無限傳代，因此，它是動(dòng)物克隆的理想供體細(xì)胞。ES細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞與體細(xì)胞的制備方法類似，亦需要進(jìn)行細(xì)胞周期的調(diào)控。供體細(xì)胞一般為活的細(xì)胞，但供體細(xì)胞也可以通過凍干保存，使得供體細(xì)胞的保存運(yùn)輸更為簡單方便。

（二）受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備受體卵母細(xì)胞在核移植前需進(jìn)行去核。如果不去核或去核不完全的話，將會(huì)因重組胚染色體的非整倍性和多倍體而導(dǎo)致發(fā)育受阻和胚胎早期死亡。因此，去核方法極為重要，目前常用的去核方法有如下幾種。1.盲吸法由于第一極體剛排除或排除后不久，染色體就在極體的附近，因此，用顯微去核針吸取極體附近的部分細(xì)胞質(zhì)便可去掉細(xì)胞核。2.半卵法將卵母細(xì)胞切為兩半，去掉含有極體的一半，然后用不含極體的一半進(jìn)行核移植。3.熒光引導(dǎo)去核法先用Hoechst33342對(duì)卵母細(xì)胞10~15分min，然后，在熒光顯微鏡下確定核的位置，去核后再觀察吸去的細(xì)胞質(zhì)或去核后的卵母細(xì)胞是否含有細(xì)胞核，以保證去核成功率。4.微分干涉和極性顯微鏡去核法對(duì)于一些脂肪顆粒含量較少的卵母細(xì)胞（如兔和小鼠等），在微分干涉相差顯微鏡下可觀察到染色體，因此，對(duì)于這類卵細(xì)胞可直接在微分干涉相差顯微鏡下去核。5.功能性去核將卵母細(xì)胞浸泡在Hoechst33342DNA染色液中，然后用紫外線照射核區(qū)，從而使核喪失功能。6.離心去核法根據(jù)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的密度不同，細(xì)胞核的密度大于細(xì)胞質(zhì)，用離心的方法可使沒有透明帶的卵母細(xì)胞核被甩向一側(cè)而最后脫離卵母細(xì)胞。7.化學(xué)試劑去核法用Etoposkle和放射菌酮處理于第一次減數(shù)分裂中期的小鼠卵母細(xì)胞，處理后的染色體相互緊密結(jié)合不易分開，形成染色體復(fù)合體，在卵母細(xì)胞排出極體時(shí)，染色體復(fù)合體隨極體一起排出這樣可使卵母細(xì)胞去核成功率達(dá)90%。8.末期去核法以上幾種去核方法的前四種比較常用，特別是第三種方法目前應(yīng)用最廣，而第五種方法紫外線照射可能影響卵母細(xì)胞質(zhì)的功能，進(jìn)而影響核移植效率，故一般不予采用。

（三）注核去核卵母細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)就可作為核移植的受體接受核供體移入。按核供體移入部位的不同，即帶下移植（注射）和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。

（四）供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞的融合帶下注核的卵母細(xì)