滅菌與消毒器械消毒功效鑒定試驗

滅菌與消毒器械消毒功效鑒定試驗1干熱滅菌柜1.1目的測定干熱滅菌柜(下簡稱滅菌柜)對細菌芽孢的殺滅效果，以驗證其滅菌性能是否符合設計規(guī)定。1.2試驗器材(1)枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)芽孢菌片。染菌載體(10mm×10mm，以不銹鋼片或玻片為代表，必要時可隨滅菌對象，增用或改用其他載體)。菌片上細菌芽孢在160℃±2℃條件下，存活時間≥3.9min，殺滅時間≤19min，D值為1.3min～1.9min。(2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(見：附A)。(3)活菌培養(yǎng)計數(shù)所需器材(見2.1.1.2)。(4)使用說明書中規(guī)定滅菌柜可以處理的物品(裝填滅菌柜，使達滿載要求)。(5)多點溫度測定儀。1.3柜內(nèi)溫度測定將溫度測定儀的多個探頭，分別放于滅菌柜的各層內(nèi)、中、外不同部位。在柜內(nèi)擺放模擬的設計程序進行滅菌。每3min，記錄各點的溫度。試驗重復3次，計算各點不同時間的平均溫度，并在試驗報告中以圖表列出。1.4滅菌試驗(1)根據(jù)試驗要求，制備枯草桿菌黑色變種芽孢懸液和芽孢樣片。(2)每次試驗取2個菌片為一組，平放于無菌平皿內(nèi)，勿重疊。加蓋，分置于滅菌柜的各層，內(nèi)、中、外不同部位。試驗時，滅菌柜內(nèi)除菌片樣本外，還應滿載以模擬的常規(guī)處理物品。(3)關(guān)閉柜門，開啟電源，按滅菌柜設計程序進行滅菌。滅菌完畢，取出平皿，將菌片取出接種于含5.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)作定性培養(yǎng)。72h后觀察結(jié)果。肉湯管混濁者表示有菌生長，判為陽性;肉湯管澄清者表示無菌生長，繼續(xù)培養(yǎng)至第7d，若仍無菌生長，判為陰性。對難以判定的肉湯管，取其中0.2ml懸液接種營養(yǎng)瓊脂平板，用滅菌L棒涂抹勻，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后涂片染色，在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，或進一步做其他試驗，以判斷生長者是否為試驗菌。若有非試驗菌污染，應查找原因重新進行試驗。(4)測試中，應同時設立定性和定量陽性對照組(菌片對照)與陰性對照組(培養(yǎng)基對照)。(5)定量陽性對照組，以同批試驗用菌片放在室溫下，待試驗組滅菌接種后，立即將該菌片2片分別移入含5.0mlPBS試管中，各振蕩80次洗滌。按2.1.1.3所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。(6)定性陽性對照組，以同批試驗用菌片放在室溫下，待試驗組滅菌接種后，立即將試驗菌片2片，分別接種于5.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中作定性培養(yǎng)，觀察細菌生長情況。(7)陰性對照組，以空白樣片2片，分別接種于5.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，同時將未接種過的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作定性培養(yǎng)，觀察有無細菌生長。(8)試驗重復5次。(9)在5次試驗中，每次試驗中陽性對照菌片的回收菌量均應達5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性陽性對照組，細菌生長良好；陰性對照應無菌生長。陽性或陰性對照若有不符合上述要求的結(jié)果，試驗作廢，重新進行。1.5評價規(guī)定(1)在3次測定溫度的試驗中，各點平均溫度均達設計要求。(2)在5次滅菌試驗中，各次試驗定量陽性對照的回收菌量均達5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性陽性對照組，細菌生長良好；陰性對照組樣本應無菌生長。所有試驗菌片均無細菌生長時，可判為干熱滅菌合格。1.6注意事項(1)干熱滅菌效果檢測，應使用枯草桿菌黑色變種芽孢，不得使用嗜熱脂肪桿菌芽孢，因在干熱條件下，前者對干熱的抗力較后者為強。(2)滅菌柜柜室容積和加熱裝置的變化，均可影響消毒效果，故在這方面的設計有所變動時，殺菌效果應重新測定。(3)滅菌效果觀察，樣本檢測稍有污染即可將滅菌成功的結(jié)果全部否定，故試驗時必須注意防止環(huán)境的污染和嚴格遵守無菌操作技術(shù)規(guī)定。(4)柜室內(nèi)滿載與非滿載，結(jié)果差別較大，故正式試驗時必須在滿載條件下進行。2紅外線消毒碗柜2.1目的檢測紅外線消毒碗柜(下簡稱消毒碗柜)對餐(飲)具的消毒效果，以驗證其殺滅微生物性能是否符合設計規(guī)定。2.2試驗器材(1)大腸桿菌(8099)懸液。脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。染菌玻片(10mm×10mm)載體（必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體）(4)活菌培養(yǎng)計數(shù)所需器材(見2.1.1.3)。(5)病毒滅活試驗所需試液、培養(yǎng)基與器材(見2.1.1.10)。(6)食(飲)具(種類與數(shù)量按使用說明書規(guī)定，用于裝填消毒碗柜進行滿載試驗)(7)多點溫度測定儀2.3柜內(nèi)溫度測定將溫度測定儀的多個探頭，分別放于消毒碗柜每層的內(nèi)、外兩點(大型碗柜可在內(nèi)、中、外3點放置)，擺放食(飲)具至使用說明書規(guī)定的最高裝載量(滿載)。關(guān)閉柜門，開啟電源，按消毒碗柜規(guī)定程序進行消毒。每3min，記錄各點的溫度。試驗重復3次，計算各點不同時間的平均溫度，并以表列出。2.4大腸桿菌殺滅試驗(1)按2.1.1.2所示方法制備大腸桿菌菌片(載體為玻片)。(2)在消毒碗柜滿載的情況下，將干燥大腸桿菌菌片置無菌平皿內(nèi)，每平皿放2片，勿重疊。在消毒碗柜每層的內(nèi)、外兩個點各放一含菌片的平皿(大型碗柜可在內(nèi)、中、外各放一平皿)，打開平皿蓋。(3)關(guān)閉柜門，開啟電源，按消毒碗柜原設計程序進行消毒。消毒完畢，按說明書規(guī)定的時間打開柜門，取出平皿。將菌片移入含5mlPBS試管內(nèi)，按2.1.1.3所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。(4)在上述消毒試驗時，將未消毒菌片，放置室溫下，當消毒組試驗完畢后，取該菌片進行活菌培養(yǎng)計數(shù)，作為陽性對照。另將同批培養(yǎng)基與PBS等培養(yǎng)，作為陰性對照。(5)試驗重復3次，其平均殺滅率應按2.1.1.7的規(guī)定進行計算和表達。(6)在3次試驗中，每次陽性對照回收菌數(shù)均達5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照無菌生長，陽性和陰性對照組結(jié)果若不符上述要求，試驗作廢，重新進行。2.5脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗(1)按2.1.1.10.3所示方法制備脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。若無特殊要求，用玻片為載體。(2)在消毒碗柜滿載的情況下，將干燥的染有脊髓灰質(zhì)炎病毒的載體置無菌平皿內(nèi)，每平皿放2片，勿重疊。在消毒碗柜每層的內(nèi)、外兩個點各放一含染有脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的平皿(大型碗柜可在內(nèi)、中、外各放一平皿)，打開平皿蓋。(3)關(guān)閉柜門，開啟電源，按原規(guī)定程序進行消毒。消毒完畢，按說明書規(guī)定的時間，打開柜門，取出平皿。將載體移入含1ml細胞維持液的試管中。振蕩洗滌后，取樣按2.1.1.10.4所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染滴度。（4）陽性對照，將未消毒的染有脊髓灰質(zhì)炎病毒的載體2片，放置于消毒碗柜外室溫下。待試驗組消毒完畢后，立即將載體移入含1ml細胞維持液的試管中。振打后，取樣按2.1.1.10.4所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染滴度。脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染滴度應≥105TCID50。（5）陰性對照，用不含脊髓灰質(zhì)炎病毒的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以觀察培養(yǎng)基無污染，細胞是否生長良好。(6)試驗重復3次。(7)根據(jù)各組的平均病毒感染滴度（TCID50），分別計算其對病毒的滅活指數(shù)，病毒的滅活指數(shù)應達4個對數(shù)值。2.6評價規(guī)定對消毒碗柜實驗室試驗所得消毒效果的評價，應以對微生物的殺滅效果為準。當所測結(jié)果均達到以下要求者可判為合格：(1)柜內(nèi)最低溫度點達到120℃，并可持續(xù)15min以上。(2)對大腸桿菌，每次試驗，陽性對照組回收菌數(shù)均達5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照無菌生長，對大腸桿菌的殺滅對數(shù)值，各點均≥3.00為消毒合格。(3)對脊髓灰質(zhì)炎病毒，每次試驗，培養(yǎng)基無污染，細胞生長良好。脊髓灰質(zhì)炎病毒感染滴度（TCID50）≥105，滅活對數(shù)值≥4.00?？膳袨橄竞细?。2.7注意事項(1)消毒碗柜內(nèi)滿載與非滿載，結(jié)果可有相當大差別，故正式試驗必須在滿載條件下進行。(2)不同大小的消毒碗柜，柜內(nèi)裝有紅外線燈的功率或安裝支數(shù)，均可影響消毒效果，故在這方面的設計有所變動時，應重新測定。(3)大腸桿菌殺滅試驗注意事項見2.1.1.7。(4)脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗注意事項見2.1.1.10。3微波滅菌柜3.1目的測定微波滅菌柜（下簡稱滅菌柜）對微生物的殺滅效果，以驗證其消毒或滅菌性能是否符合原設計規(guī)定。3.2試驗器材(1)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、龜分枝桿菌（ATCC93326）、枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)芽孢等細菌或芽孢懸液。(2)染菌載體(10mm×10mm，以布片或玻片為代表，必要時可隨滅菌對象，增用或改用其他載體)。(3)微波漏能測試儀(檢測滅菌柜微波有無泄漏)。(4)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：見附錄A?；罹囵B(yǎng)計數(shù)所用器材(見2.1.1.2)。(5)使用說明書中規(guī)定的處理的物品(裝填滅菌柜，使達滿載)。3.3細菌及其芽孢和真菌殺滅試驗操作程序（1）按2.1.1.2所示相關(guān)方法制備試驗用細菌及其芽孢和真菌菌片。若無特殊要求，菌片以布片為載體(10mm×10mm)。每一牛皮紙小袋裝2個菌片。（2）按實用情況，在滅菌柜內(nèi)模擬擺放常規(guī)處理物品至使用說明書中規(guī)定的最高裝載量(滿載)。將試驗菌片放于柜室各層中央和四角的物品中間，每層共放置5袋。放入試驗菌片前，按使用方法，做預濕處理。柜室容量小者可適當減少放置菌片數(shù)量。（3）菌片布放完以后，關(guān)閉柜門，進行微波照射。至預定時間，停止照射，打開柜門，取出物品和試驗菌片。（4）消毒試驗時，按2.1.1.7要求的方法，作定量殺菌效果的檢測。滅菌試驗時，將取出的試驗菌片移種于營養(yǎng)肉湯中，置溫箱內(nèi)作定性培養(yǎng)(37℃)。培養(yǎng)7d，若仍無菌生長，判為陰性。對難以判斷的肉湯管，取其中0.2ml懸液接種營養(yǎng)瓊脂平板，用滅菌L棒涂勻，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后涂片染色顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，或進一步做其他試驗，判斷生長的是否為試驗菌。若為非試驗菌，應重新進行試驗。（5）測試中，應同時設立定性和定量陽性對照組(菌片對照)與陰性對照組(培養(yǎng)基對照)。（6）定量陽性對照組，將同批試驗用的菌片放在室溫下，待消毒或滅菌試驗組達規(guī)定作用時間后，立即將該菌片2片分別移入含5.0mlPBS試管中，各振蕩80次。取洗液按2.1.1.3所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。（7）定性陽性對照組，將同批試驗用的菌片放在室溫下，待滅菌試驗組達規(guī)定作用時間后，立即將該批試驗用的菌片2片，分別接種于5.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中作定性培養(yǎng)，觀察細菌生長情況。（8）陰性對照組，在滅菌試驗中，將同批試驗用的菌片2片，分別接種于5.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，同時將未接種過的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作定性培養(yǎng)，觀察有無細菌生長。在消毒試驗中，則應對所用中和劑、稀釋液和培養(yǎng)基進行無菌檢測，觀察有無細菌污染。（9）試驗重復5次。（10）在5次試驗中，陽性對照組各次試驗樣片的回收菌量均應在5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性陽性對照組，細菌生長良好；陰性對照組樣本應無菌生長。陽性或陰性對照若有不符合上述要求的結(jié)果，試驗作廢，重新進行。3.4評價規(guī)定（1）在5次消毒試驗中，每次試驗中的陽性對照菌片，檢測回收菌量均應達5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照組應無菌生長，各次試驗的殺滅對數(shù)值均≥3.00?？膳袨橄竞细瘛＃?）在5次滅菌試驗中，每次試驗中的定量陽性對照組，檢測回收菌量均達5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性陽性對照組，細菌生長良好。陰性對照組樣本應無菌生長。所有試驗菌片都無細菌生長時，可判為滅菌合格。3.5注意事項(1)微波強弱受電壓影響很大。試驗時，應注意電壓是否符合說明書規(guī)定值。波動較大時，應使用穩(wěn)壓電源。水量，一方面可防止棉織品燒焦，金屬物品對磁控管的破壞；一方面可提高其殺菌效果。(3)微波殺菌效果與樣本的含水量密切有關(guān)。在使用中規(guī)定需預濕者，試驗時亦必須預濕，不可省略。端放電損壞磁控管。(5)測試人員長時間受微波照射，對健康有害。試驗時必須穿戴專用的防護用具。測試的滅菌柜應先用微波漏能測試儀檢測有無微波泄漏。4紫外線燈4.1目的測定紫外線燈(包括雙燈管組合燈具)輻照強度及對微生物的殺滅作用，以驗證其殺菌性能是否達到合格標準。4.2試驗器材(1)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)芽孢、白色葡萄球菌（8032，空氣消毒時用）、等細菌及其芽孢和真菌懸液。(2)染菌載體(10mm×10mm，以玻片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。(3)紫外線照度計(在計量標定有效期內(nèi)，下簡稱照度計)。(4)紫外線燈測定架(測定時，紫外線燈固定于測定架頂端。頂端高2m，可上下移動。下簡稱測定架)。(5)穩(wěn)壓器(220V)（6）細菌及其芽孢和真菌殺滅試驗所需器材(見2.1.1.7，2.1.1.9)。4.3輻照強度測定(1)將待測紫外線燈管固定于測定架，調(diào)節(jié)距離使燈管距其下方垂直中心放置照度計處1m。(2)開啟紫外線燈5min后，用照度計在燈管下方垂直距離1m的中心處測量其輻照度值(μW/cm2)。(3)測量時，電壓應穩(wěn)定在220V。(4)普通型或低臭氧型直管紫外線燈(30W)，在燈管下方垂直1m的中心處，新燈管的輻照度值應≥90μW/cm2。(5)使用中的燈管，可在原裝置處進行測定。測定位置仍在燈管下方垂直距離1m的中心處。使用中燈管的輻照度值應≥70μW/cm2，低于此值者應予更換。(6)多燈管組合燈具的測定方法和合格標準，同單支燈管。(7)對異型(非直管型)、高強度型，或非30W功率等燈管的檢測距離和輻照度值合格標準，隨產(chǎn)品用途和使用方法而定。原則上，應不低于產(chǎn)品使用說明書注明的輻照度值，并按其推薦劑量[即輻照度值乘以照射時間(s)]進行殺菌試驗，證明能滿足應用所需效果者可判為實驗室測試合格。(8)輻照強度檢測，每次鑒定抽查10支燈管，每支燈管重復測定3次。各次數(shù)據(jù)均達標準可判輻照強度合格。4.4細菌及其芽孢和真菌殺滅效果的測定(1)按2.1.1.2所示方法制備細菌及其芽孢和真菌菌片。菌片以玻片為載體。(2)試驗時，確定菌片照射位置。若無特殊要求，30W燈管應在燈管下方垂直距離1m的中心處。(3)將菌片平置于無菌平皿中，勿重疊。平皿放于測定架預先確定的照射位置上進行照射。(4)照射分為3個時間組。各組時間的設置應使能測出將試驗細菌及其芽孢和真菌殺滅對數(shù)值≥3.00所需的最低劑量，否則應調(diào)整時間，重新試驗，直至取得所需結(jié)果為止。(5)將照射后樣本送實驗室進行活菌培養(yǎng)計數(shù)(見2.1.1.2)的測定。(6)測試中，應同時設立陽性對照組(菌片對照)與陰性對照組(培養(yǎng)基對照)。(7)陽性對照組，以試驗用的同批菌片置室溫下，待試驗組消毒完畢后，立即將該批菌片2片分別放入含5.0mlPBS試管中，電動混勻器震蕩20s或各振敲80次。取洗液按2.1.1.2所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。(8)陰性對照組，以同次實驗用培養(yǎng)基或PBS接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察有無細菌生長。(9)試驗重3次。每次試驗中的陽性對照菌片，檢測回收菌量均應在5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照組應無菌生長，各次試驗對細菌及其芽孢和真菌的殺滅對數(shù)值均≥3.00。該照射時間可判為消毒合格所需照射的時間。陽性或陰性對照組結(jié)果若不符上述要求，該次試驗作廢，重新進行。(10)對異型(非直管型)、高強度型，或非30W功率等燈管的照射距離，隨產(chǎn)品用途和使用方法而定。4.5評價規(guī)定在3次消毒試驗中，對細菌及其芽孢和真菌，每次試驗中的陽性對照菌片，檢測回收菌量均應達5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照應無菌生長，各次試驗的殺滅對數(shù)值均≥3?？膳袨橄竞细?。4.6臭氧產(chǎn)生量的測定紫外線燈產(chǎn)生的臭氧量不同可影響殺菌效果和使用的安全，故應測定臭氧濃度以便進行綜合考慮。臭氧濃度測定方法見本規(guī)范理化鑒定技術(shù)。檢測條件應以產(chǎn)品使用說明中規(guī)定的使用方法、面積(或容積)和時間為準，進行現(xiàn)場(或模擬現(xiàn)場)測定。臭氧濃度應寫明于使用說明書中，低臭氧紫外線燈產(chǎn)生的臭氧濃度，應不超過國家規(guī)定的工作場所安全濃度(0.3mg/m3)。4.7有效使用期的測定將燈管裝設于測試架上，通電連續(xù)照射。每周測試一次輻照度值，直至低于70μW/cm2時為止。該樣本連續(xù)照射的時間(h)，即為其有效使用時間(h)。隨機抽樣，重復測試5支燈管，取其最低值。4.8注意事項(1)測試前應先用酒精棉球擦除燈管上的灰塵和油垢，以免影響紫外線的照射強度。(2)殺菌試驗時，應使紫外線直接照射擬消毒表面，否則不能反映該劑量真實的殺菌效果。試人員的傷害。在有人工作環(huán)境中，空氣中臭氧濃度不得超過0.3mg/m3。測定輻照度值或進行殺菌試驗時，應保持室內(nèi)潔凈無塵。5紫外線消毒箱5.1目的測定紫外線消毒箱(下簡稱消毒箱)對物體表面微生物的殺滅效果，以驗證其殺菌性能是否符合原設計規(guī)定。5.2試驗器材（1）金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)芽孢、白色念珠菌(ATCC10231)、龜分枝桿菌膿腫亞種（ATCC93326）等懸液和脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。（2）染菌載體(10mm×10mm，以玻片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。（3）紫外線照度計(在計量標定有效期內(nèi)，下簡稱照度計)。（4）紫外線燈測定架[見4.2(3)](見2.1.1.7，2.1.1.8，2.1.1.9)。（6）脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗所需試液、培養(yǎng)基和器材（見2.1.1.10）（7）使用說明書中規(guī)定消毒箱可處理的物品(裝放于消毒箱，使達滿載要求)。5.3紫外線照射強度測定打開消毒箱的蓋或門，將內(nèi)裝紫外線燈管取下，在紫外線燈測定架上按2.1.6.4測定其照射強度的輻照度值，以確定是否與產(chǎn)品質(zhì)量標準或企業(yè)標準中規(guī)定的相同。必要時，以與箱門(或蓋)一樣大小的鋁板，用膠帶固定于消毒箱的門框(或消毒箱蓋)上。鋁板中央處鉆一直徑為15mm小圓孔，開啟箱內(nèi)紫外線燈，照射5min，待穩(wěn)定后，通過鋁板上小圓孔用照度計測定射出紫外線的輻照度值(μW/cm2)。5.4對微生物殺滅效果的測定（1）細菌及其芽孢、龜分枝桿菌和真菌殺滅效果的測定①按2.1.1.2所示相關(guān)方法制備細菌及其芽孢和真菌菌片。菌片以玻片為載體。②每次試驗只測試一種微生物，以防交叉污染。試驗用樣片每2片為一組，平放于無菌平皿中，勿重疊。箱內(nèi)容積過小時，可將試驗細菌及其芽孢和真菌直接涂染于所設計消毒的物品表面進行試驗，每2件為一組。③根據(jù)消毒箱容積的大小，放入一定數(shù)量裝有樣片的平皿，或直接涂染的樣本，但消毒箱內(nèi)應同時將所設計消毒的物品擺放至使用說明書中規(guī)定的最高裝載量(滿載)。④關(guān)閉消毒箱門(或蓋)，打開紫外線燈，照射至規(guī)定時間。⑤取出樣本，按2.1.1.3所示方法進行活菌計數(shù)。對白色念珠菌的殺滅試驗，用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，對黑曲霉菌的殺滅試驗，用胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，其他方法和步驟均與細菌殺滅試驗相同。⑥陽性對照組，以試驗用的同批菌片置室溫下，待試驗組菌片消毒達規(guī)定作用時間后，立即將該批菌片2片分別放入含5.0mlPBS試管中，各振蕩80下。取樣液按2.1.1.3所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。⑦陰性對照組，用同批次試驗用培養(yǎng)基或PBS接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察有無細菌生長。⑧試驗重復3次。陽性對照菌片每次試驗回收的含菌量均應在5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照組樣本應無菌生長，各次試驗對細菌及其芽孢和真菌的殺滅對數(shù)值均≥3.00。該照射時間可判為消毒合格所需照射的時間。陽性或陰性對照組結(jié)果若不符上述要求，該次試驗作廢，重新進行。（2）脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗①按2.1.1.10.3所示方法制備脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。若無特殊要求，用玻片為載體。②每次試驗2片脊髓灰質(zhì)炎病毒樣片為一組，平放于無菌平皿中，勿重疊。箱內(nèi)容積過小時，可將脊髓灰質(zhì)炎病毒直接涂染于所設計消毒的物品表面進行試驗，每2件為一組。③根據(jù)消毒箱容積的大小，放入一定數(shù)量裝有樣片的平皿，或直接涂染的樣本，但消毒箱箱內(nèi)應同時將所設計消毒的物品擺放至使用說明書中規(guī)定的最高裝載量(滿載)。④關(guān)閉消毒箱的門(或蓋)，打開紫外線燈，照射至規(guī)定時間。⑤將照射后將脊髓灰質(zhì)炎病毒樣片移入含1ml細胞維持液的試管中。振打后，取樣按2.1.1.10所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒的滴度。⑥將未消毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒樣片2片，放置于消毒箱外室溫下。待試驗組消毒完畢后，立即將脊髓灰質(zhì)炎病毒樣片移入含1ml細胞維持液的試管中。振蕩后，取樣按2.1.1.10.4所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染滴度，作為陽性對照。⑦陰性對照，用不含脊髓灰質(zhì)炎病毒的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以觀察培養(yǎng)基有無污染，細胞是否生長良好。⑧試驗重復3次。⑨根據(jù)各組的平均病毒的感染滴度（TCID50），分別計算其對病毒的滅活對數(shù)值。（3）評價規(guī)定在3次消毒試驗中，對細菌及其芽孢和真菌，每次試驗中的陽性對照菌片，檢測回收菌量均應達5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照組樣本應無菌生長，各次試驗的殺滅對數(shù)值均≥3.00。對脊髓灰質(zhì)炎病毒，培養(yǎng)基無污染，細胞生長良好，脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染滴度（TCID50）≥105，滅活對數(shù)值≥4.00?？膳袨橄竞细瘛?.5注意事項(1)試驗時，應注意箱內(nèi)物品有無未被紫外線直接照到處(如被箱內(nèi)支架遮擋)。如實用中擬消毒物品有可能處于該位置，在染菌樣片布點時應考慮觀察該部位的消毒效果。(2)其他同4.6。6環(huán)氧乙烷滅菌器6.1目的測定環(huán)氧乙烷滅菌器(下簡稱滅菌器)對細菌芽孢的殺滅能力，以驗證其滅菌性能是否符合原設計規(guī)定。6.2試驗器材(1)枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)芽孢菌片。含菌量要求為5×105cfu/片～5×106cfu/片(按活菌培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果計)。在環(huán)氧乙烷量為600mg/L±30mg/L，溫度為54℃±2℃，相對濕度為60%±10%條件下，菌片上芽孢存活時間應≥7.8min，殺滅時間≤58min，D值為2.6min～5.8min。(2)染菌載體(10mm×10mm，以布片為代表，必要時可隨滅菌對象，增用或改用其他載體。(3)聚乙烯塑料袋(封裝菌片用，大小為60mm×40mm，厚0.2min～0.4mm)。(4)活菌培養(yǎng)計數(shù)所需器材(見2.1.1.3)。(5)使用說明書中規(guī)定滅菌器可處理的物品(裝填滅菌器，使達滿載要求)。6.3滅菌試驗操作程序(1)根據(jù)試驗要求，制備枯草桿菌黑色變種芽孢懸液和菌片。菌片放入雙層聚乙烯塑料袋內(nèi)密封包裝，每袋2片。每次試驗用20袋。(2)將滅菌器上、中、下3層，每層內(nèi)、中、外各設一點，共設9點。每點物品中間布放1袋，共需18袋試驗菌片。另將一袋（2片）菌片放置在室溫條件下作為陽性對照。(3)按使用說明書所規(guī)定的環(huán)氧乙烷濃度、作用時間、柜內(nèi)的溫度和相對濕度，在滿載條件下進行環(huán)氧乙烷滅菌處理。滿載用物品，隨滅菌器用途而定。處理完畢，取出菌片，分別移種于5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，7d后觀察最終結(jié)果(定性培養(yǎng)檢測)。對難以判斷結(jié)果的營養(yǎng)肉湯管，取其中0.2ml懸液接種營養(yǎng)瓊脂平板，用無菌L棒涂抹均勻，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48h后涂片染色，顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，或進一步做其他試驗，判斷有無生長或生長的是否為試驗菌。若為非試驗菌，則應重新進行試驗。(4)測試中，應同時設立定性和定量陽性對照組與陰性對照組。(5)定量陽性對照組，以同批試驗用菌片置室溫下，待消毒或滅菌試驗組達規(guī)定作用時間后，立即將該菌片2片分別放入含5.0mlPBS試管中，各振敲打80次。取洗液按2.1.1.3所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。(6)定性陽性對照組，以同批試驗用菌片置室溫下，待滅菌試驗組達規(guī)定作用時間后，立即將該菌片2片，分別接種于5.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，放入溫箱中作定性培養(yǎng)，觀察有細菌生長情況。(7)陰性對照組，以同批次試驗用未染菌樣片2片，分別接種于5.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，同時將未接種過的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作定性培養(yǎng)，觀察有無細菌生長。(8)試驗重復5次。(9)在5次試驗中，每次試驗中的陽性對照菌片，回收菌量均應在5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性陽性對照組，細菌生長良好；陰性對照應無菌生長。陽性或陰性對照若有不符合上述要求的結(jié)果，試驗作廢，重新進行。6.5評價規(guī)定在5次滅菌試驗中，每次試驗中的定量陽性對照組，檢測回收菌量均達5×105cfu/片～5×106cfu/片；定性陽性對照組，細菌生長良好。陰性對照應無菌生長。所有試驗菌片全部無細菌生長時，可判為滅菌合格。6.6注意事項(1)溫度和相對濕度對環(huán)氧乙烷氣體殺菌效果影響較大，故應嚴格控制試驗中的有關(guān)條件。(2)環(huán)氧乙烷液體可溶解聚乙烯、聚氯乙烯等，不可將其液體滴落于此類物品上。環(huán)氧乙烷不論液體或氣體，均可損壞賽璐璐制品，試驗時應予注意。(3)環(huán)氧乙烷易燃易爆，操作現(xiàn)場應采取防火防爆措施，不得有明火作業(yè)及電火花發(fā)生。環(huán)境中應有良好的通風。在每日8h工作中，環(huán)氧乙烷濃度應不超過1.82mg/m3（1ppm），15min工作中暴露濃度不超過9.1mg/m3（5.0ppm）。如出現(xiàn)中毒癥狀，需迅速離開現(xiàn)場。輕者呼吸新鮮空氣，直到癥狀消除；重者應及時送醫(yī)院治療。7臭氧消毒柜7.1目的測定臭氧消毒柜(下簡稱消毒柜)對物體表面上微生物的殺滅效果，以驗證其殺菌性能是否符合原設計規(guī)定。7.2試驗器材(1)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、白色念珠菌(ATCC10231)懸液和脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。(2)染菌載體(10mm×10mm，以布片或玻璃片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。(3)臭氧采樣裝置和濃度分析儀。(4)細菌定量殺滅試驗用器材(見2.1.1.7，2.1.1.9)。(5)脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗用試液、培養(yǎng)基和器材(見2.1.1.10)。(6)溫度與濕度計。7.3臭氧濃度測定(1)儀器測定:臭氧濃度可用臭氧分析儀測定。操作按儀器使用說明書規(guī)定進行。(2)化學滴定法測定:參考本規(guī)范理化鑒定實驗技術(shù)。7.4殺滅微生物試驗操作程序臭氧消毒柜的臭氧發(fā)生器臭氧發(fā)生量一般不可調(diào)，故試驗時設3個作用時間組［時間分組見2.1.1.7.3（1）］。（1）細菌和真菌殺滅試驗①按2.1.1.2所示相關(guān)方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增設其他試驗微生物。②因臭氧在柜內(nèi)擴散慢，分布不易均勻，故物品在柜內(nèi)應擺放至使用說明書中規(guī)定的最高裝載量(滿載)，以盡量接近實際應用時的情況。③以2片菌片一組，置一無菌平皿中，勿重疊。試驗時，將放有菌片的平皿蓋打開，分層布放，每層內(nèi)、中、外各點分別放一組樣本。④按照使用說明書要求，調(diào)節(jié)柜內(nèi)溫度與相對濕度，并記錄備查，然后開啟臭氧發(fā)生器進行消毒。⑤消毒至規(guī)定時間，取出菌片，按2.1.1.3所示方法進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。對白色念珠菌的殺滅試驗，用沙堡瓊脂培養(yǎng)基，對黑曲霉菌的殺滅試驗，用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基，其他方法和步驟均與細菌殺滅試驗相同。因臭氧氣體熏蒸，載體吸收的量少、分解快，可不必進行去除殘留臭氧的處理。每組試驗重復3次。⑥將未消毒的菌片2片，放置于消毒碗柜外室溫下。待試驗組消毒完畢后，同時進行活菌培養(yǎng)計數(shù)檢測。取本次試驗同批的PBS接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為陰性對照。[對未固定裝于消毒箱內(nèi)的臭氧發(fā)生器(如冰箱臭氧消毒器)，其殺菌效果鑒定，可按其用途，在相應的密閉柜內(nèi)進行。柜的大小應與所設計的殺菌有效范圍相近]。（2）脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗①按2.1.1.10.3所示方法制備脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。若無特殊要求，用玻片為載體。②在消毒碗柜滿載的情況下，將干燥的染有脊髓灰質(zhì)炎病毒的載體置滅菌平皿內(nèi)，每平皿放2片，勿重疊。在消毒碗柜每層的內(nèi)、外兩個點各放一含染有脊髓灰質(zhì)炎病毒載體的平皿(大型碗柜可在內(nèi)、中、外各放一平皿)，平皿蓋打開。③關(guān)閉柜門，開啟電源，按原規(guī)定程序進行消毒。消毒完畢，按說明書規(guī)定的時間，打開柜門，取出平皿。將載體移入含1ml細胞維持液的試管中。振打后，取樣按2.1.1.10.4所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度。④將未消毒的染有脊髓灰質(zhì)炎病毒的載體2片，放置于消毒碗柜外室溫下。待試驗組消毒完畢后，立即將載體移入含1ml細胞維持液的試管中。振打后，取樣按2.1.1.10.4所示方法檢測殘留脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度，作為陽性對照。⑤陰性對照，用不含脊髓灰質(zhì)炎病毒的完全培養(yǎng)基作為陰性對照，以觀察培養(yǎng)基有無污染，細胞是否生長良好。⑥試驗重復3次。⑦根據(jù)各組的平均病毒感染滴度（TCID50），分別計算其對病毒的滅活對數(shù)值。7.5評價規(guī)定對細菌及其芽孢和真菌，在3次試驗中，所設陽性對照組回收菌量在5×105cfu/片～5×106cfu/片，陰性對照無菌生長，試驗組中每次試驗細菌及其芽孢和真菌的殺滅對數(shù)值均≥3；對脊髓灰質(zhì)炎病毒，在3次試驗中，所設陽性對照組，脊髓灰質(zhì)炎病毒滴度達105(TCID50)，陰性對照細胞無污染，試驗組中每次試驗病毒滴度下降4個對數(shù)值者，該組作用時間可作為實驗室試驗消毒合格的最短作用時間。若陽性或陰性對照組的結(jié)果與上述要求不符，試驗作廢，重新進行。7.6注意事項(1)對試驗結(jié)果有懷疑時，可在試驗時同步進行臭氧濃度測定，以便作進一步的分析。(2)每次試驗完畢，應充分排除消毒柜內(nèi)的臭氧氣體，勿使有臭氧殘留，以免影響隨后的試驗。(3)空氣中臭氧濃度不得超過0.3mg/m3，臭氧吸入過多，可使人中毒，試驗場所應保持通風良好。(4)溫度和相對濕度均可影響臭氧氣體對細菌的殺滅效果，試驗時必須控制好這些條件，使其前后一致。8臭氧水消毒器8.1目的檢測臭氧水消毒器發(fā)生的臭氧水消毒劑對物品表面的消毒效果，以驗證臭氧水消毒劑對物品表面消毒的實用劑量。臭氧水消毒劑指應用臭氧消毒設備制備的含臭氧的水溶液，并以其作為消毒劑，用于對物品表面等的消毒。8.2試驗器材(1)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、白色念珠菌(ATCC10231)懸液和脊髓灰質(zhì)炎病毒懸液。(2)染菌載體(10mm×10mm，以布片為代表，必要時可隨消毒對象，增用或改用其他載體)。(3)臭氧采樣裝置。(4)細菌定量殺滅試驗用器材與培養(yǎng)基(見2.1.1.7，2.1.1.9)。(5)脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活試驗用試液、培養(yǎng)基和器材(見2.1.1.10)。(6)溫度與濕度計。(7)500ml塑料杯。(8)水流量計（1L/min～10L/min）。(9)不銹鋼網(wǎng)。(10)臭氧濃度測定用臭氧分析儀和化學滴定法用試劑、器材等。8.3臭氧濃度測定臭氧濃度的測定方法分為化學滴定法和儀器測定法。儀器測定法按儀器使用說明書要求進行。（1）通過式臭氧消毒設備測定水樣流出消毒設備后臭氧濃度由高到低的衰變曲線。測定時，若出水流量可調(diào)，設3個流量其中應包括該設備的最大流量和最小流量，若出水流量不可調(diào)，則按說明書要求設1個流量，各流量水樣流出消毒設備后，即刻測定水樣中臭氧含量，然后再將水樣放20℃水浴中，設5個～6個時間段，分別測定水樣中臭氧含量，并繪制臭氧濃度衰變曲線。（2）暴氣式臭氧消毒設備測定一定容量的水體中臭氧濃度由低到高，直到臭氧濃度達飽和時的濃度變化曲線。按說明書要求，加入規(guī)定容量的水樣，通入臭氧氣體，設5個～6個時間段（應測出臭氧濃度達飽和時的最短時間），分別測定水樣中臭氧含量，并繪制臭氧濃度變化曲線。8.4殺滅微生物試驗操作程序按臭氧設備制備臭氧水消毒劑的方式分為暴氣式與通過式兩類。（1）暴氣方式臭氧消毒設備制備臭氧水消毒劑的殺滅微生物試驗①按2.1.1.2所示相關(guān)方法制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌黑色變種芽孢、白色念珠菌、黑曲霉孢子的菌片。必要時，可增