一種瘤胃微生物的dna提取方法

一種瘤胃微生物的dna提取方法

0瘤胃微生物干產(chǎn)品的制備方法腫瘤胃的微生態(tài)系統(tǒng)極其復(fù)雜，包括許多微生物，如腫瘤、古細菌、原蟲和真菌。研究表明,瘤胃內(nèi)細菌數(shù)量最多,高達1010～1011個/mL(200多種);原蟲數(shù)量為104～106個/mL(25個屬);厭氧真菌游動孢子數(shù)為103～105個/mL(6個屬);噬菌體顆粒數(shù)高達107～109個/mL。反芻動物瘤胃利用這些復(fù)雜的微生物的協(xié)同作用,將飼料中的植物纖維類物質(zhì)快速降解轉(zhuǎn)化成動物營養(yǎng)和能量物質(zhì)。過去對瘤胃微生物的研究主要是采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù),但是由于瘤胃微生物要求嚴格的厭氧條件,因此較難在體外進行種群研究。隨著分子生物學的發(fā)展,基因組DNA水平上的研究方法得以應(yīng)用,并很好地實現(xiàn)了對復(fù)雜瘤胃微生物的研究。目前瘤胃微生物DNA提取采用較多的是珠磨儀破碎法、反復(fù)凍融SDS/蛋白酶K法、液氮研磨法,這些方法有些需要特殊儀器,有些在操作過程中容易造成DNA降解。本試驗旨在研究不需要特殊儀器情況下,也可以獲得完整微生物信息的DNA提取方法,為瘤胃中的細菌、古細菌、真菌和原蟲4類微生物DNA后續(xù)分子研究提供更好的實驗材料。1材料和方法1.1體外瘤胃模擬培養(yǎng)方法瘤胃體外培養(yǎng)物是通過采集裝有永久性瘤胃瘺管的牛瘤胃液,以稻草粉、玉米粉和黃豆粉為飼料底物,采用本研究小組改進的體外瘤胃模擬裝置培養(yǎng)24h后的培養(yǎng)物,詳細過程參見張志紅等方法。樣品采集后置于-20℃用于DNA提取。1.2sds-pcr法瘤胃培養(yǎng)物低溫12000g高速離心10min,棄上清;沉淀加入適量預(yù)熱的DNA提取緩沖液(100mMTris-HCl,100mMEDTA,1.5MNaCl,1%CTAB,pH8.0,用前置于65℃水浴預(yù)熱),充分混勻。置液氮中完全凍結(jié)(液氮中冷凍約5min),取出在65℃水浴中保溫至完全融化,反復(fù)凍融3次。65℃保溫30min,加入溶菌酶使其終濃度達到1mg/mL,37℃180r/min振蕩30min;加入10%SDS至終濃度2%,混勻后58℃保溫2h,每隔15～20min顛倒混勻數(shù)次。室溫下6000g離心10min,收集上清液。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),輕輕顛倒混勻,防止DNA斷裂。室溫下12000g離心10min,吸取上層液體,加入0.6倍體積的異丙醇,室溫沉淀2h;4℃下12000g離心10min,沉淀用70%冷乙醇漂洗3次,自然干燥;沉淀用TE(pH=8.0)溶解過夜,用0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA。最后DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.3dna的純化采用割膠回收試劑盒(EZSpinColumnDNAgelExtractionKit)純化DNA,取5μL純化后的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.4引物檢測微生物采用細菌16srDNA通用引物、古細菌16srDNA通用引物、真菌18srDNA通用引物及原蟲特異性引物分別對瘤胃總DNA中細菌、古細菌、真菌及原蟲4類微生物進行檢測。引物具體序列及4種微生物PCR檢測條件分別見表1、表2。反應(yīng)體系為25μL體系:模板DNA0.5μL,上、下游引物(10μM濃度)各1μL,2×EasyTaqPCRSupermix12.5μL,ddH20補足體積至25μL。2結(jié)果與分析2.1粗提dna產(chǎn)物的瓊脂糖檢測體外培養(yǎng)時添加的植物提取物顏色較重,因此,瘤胃內(nèi)容物粗提獲得的DNA也稍帶黃色。粗提DNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖檢測(見圖1),片段的大小接近20kb,由于粗提產(chǎn)物中含有較多的酚、多糖等雜質(zhì),所以上樣孔內(nèi)有亮帶,并出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此,如要獲取用于后期分子生物學研究的DNA,需經(jīng)過純化獲得較純的DNA。2.2pcr檢測dna粗提DNA產(chǎn)物經(jīng)過DNA純化試劑盒純化后獲得的DNA產(chǎn)物無色,經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(圖2),目的長片段DNA有部分損失,但濃度仍較高。而且上樣孔無亮帶,說明雜質(zhì)已經(jīng)去除干凈,可用于后期的分子研究。2.34瘤胃內(nèi)容物微生物多樣性分析純化后的DNA利用4種微生物的特異性引物擴增后均獲得目的大小的片段(見圖3),細菌16srDNA擴增產(chǎn)物大小為1500bp、古細菌16srDNA擴增產(chǎn)物大小為756bp、真菌18srDNA擴增產(chǎn)物大小為1800bp、原蟲特異性擴增產(chǎn)物為1360bp,說明采用體外培養(yǎng)的瘤胃內(nèi)容物存在細菌、古細菌、真菌及原蟲4種微生物。同時也說明液氮反復(fù)凍融和相關(guān)試劑提取以及試劑盒純化的方法可有效提取和純化瘤胃微生物DNA,所獲得的DNA產(chǎn)物可用于后期實時定量PCR和DGGE等分子研究。3總dna的提取由于傳統(tǒng)方法不能夠準確測定瘤胃微生物數(shù)量,限制了對它的深入研究。隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展,研究人員對瘤胃微生物的研究也進一步深入。從瘤胃樣品中高效獲取基因組DNA是研究和分析微生物結(jié)構(gòu)和多樣性的前提,由于瘤胃微生物總DNA片段較長,極易斷裂,且瘤胃微生物類型復(fù)雜,真菌和原蟲破壁較難,并且各種微生物的數(shù)量不一,其中細菌和古細菌較多,原蟲和真菌數(shù)量偏少。因此,必須尋找一種可最大限度保留瘤胃內(nèi)容物中所有類型的微生物DNA并能很好的獲取長片段DNA的提取方法。本研究采用液氮反復(fù)凍融方法,結(jié)合化學試劑破壁,高效獲得了基因組DNA,判斷大小在20kb,這與文獻中珠磨式機械破碎法提取牛瘤胃菌液中DNA大小接近。有文獻報道采用干冰-酒精凍融法提取耗牛瘤胃微生物中得到了長度大于50kb的DNA片段,可能與樣品來源有關(guān)。通過普通微生物引物擴增檢測DNA提取效果,DNA中擴增出真細菌、古細菌、真菌以及原蟲DNA序列,檢測結(jié)果說明經(jīng)過純化后的瘤胃微生物總DNA中含有這些微生物,完全適合后續(xù)的研究工作。本研究采用液氮反復(fù)凍融+溶菌酶+CTAB和SDS相結(jié)合的方法來提取總DNA