微生物視紫紅質(zhì)的生物三界系統(tǒng)發(fā)生分析

微生物視紫紅質(zhì)的生物三界系統(tǒng)發(fā)生分析

微生物視紫紅質(zhì)（rhodopsin）廣泛分布于廣泛的古細(xì)菌、細(xì)菌和細(xì)胞真核生物中。有兩個(gè)顯著的特點(diǎn)：1）所有微生物的顏色為紫色，帶有七種不同的螺線結(jié)構(gòu)。2）以類黃酮（維生素a的衍生物）為發(fā)色基，用藍(lán)色色調(diào)的基質(zhì)產(chǎn)生感覺。為2型復(fù)合紫紅色素，也被稱為1型復(fù)合紫紅色素，以區(qū)別于高等多細(xì)胞動(dòng)物的2型復(fù)合紫紅色素。盡管2型公共交通紫色原的2號(hào)性顏色沒有明顯變化，但它們之間的進(jìn)化關(guān)系尚不清楚。這是由于2型公共交通紫色原的氨基酸序列水平上的相同性。因此，使用的黃羧結(jié)構(gòu)也不同于微生物的公共交通紫色原。微生物視紫紅質(zhì)的功能非常多樣化,包括了光能驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子和氯離子泵、趨光性感受器和其他未知功能.在失去色基團(tuán)視黃醛后,其脫輔基蛋白在酵母作為熱激蛋白,在外界壓力刺激下,起調(diào)低氫離子ATP酶活性的作用.微生物視紫紅質(zhì)的最大光吸收值在光譜中分布比2型視紫紅質(zhì)要窄,基本范圍在藍(lán)光(487nm)到紅光(587nm)間.微生物視紫紅質(zhì)的基因重復(fù)并非罕見,在普通嗜鹽菌(Halobacteriumsalinarum)中有4份微生物視紫紅質(zhì)的拷貝.在高等植物水稻的基因組中也發(fā)現(xiàn)了編碼了微生物視紫紅質(zhì)的核苷酸序列,但該核苷酸序列是否在水稻中表達(dá)還是未知,所以只能稱這個(gè)微生物視紫紅質(zhì)為假設(shè)視紫紅質(zhì).這類假設(shè)的視紫紅質(zhì)的出現(xiàn)說明微生物視紫紅質(zhì)的存在不僅限于單細(xì)胞微生物中,其進(jìn)化和分布可能非常復(fù)雜.光能利用視紫紅質(zhì)(proteorhodopsin)在海洋細(xì)菌中分布極其廣泛,包括了γ-蛋白質(zhì)菌、α-蛋白質(zhì)菌和海洋桿菌.對(duì)這些浮游細(xì)菌的視黃醛合成基因所進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)生分析表明:光能利用視紫紅質(zhì)在浮游細(xì)菌中廣泛的分布可能歸因于水平基因傳遞和共同進(jìn)化.目前為止還沒有關(guān)于微生物視紫紅質(zhì)在生物三界系統(tǒng)中進(jìn)化和分化過程的研究.不同物種中的微生物視紫紅質(zhì)間的氨基酸序列和長度差異非常大,真核生物萊茵衣藻中起趨光性感受器作用的微生物視紫紅質(zhì)長達(dá)737個(gè)氨基酸,而海洋中γ-蛋白質(zhì)菌中細(xì)菌視紫紅質(zhì)的長度只有229個(gè)氨基酸.并且微生物相對(duì)多細(xì)胞生物而言,進(jìn)化歷史更長,基因內(nèi)中性突變更多,基因序列中的同源區(qū)域不易確定.因此基于微生物視紫紅質(zhì)的7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)生分析,可以更精確地反映微生物視紫紅質(zhì)的進(jìn)化.為了了解微生物視紫紅質(zhì)在三界系統(tǒng)中的進(jìn)化和分化過程,本文對(duì)美國基因數(shù)據(jù)庫(GenBankDatabase)中微生物視紫紅質(zhì)的蛋白質(zhì)序列用酵母熱激蛋白進(jìn)行了PSI-BLAST搜索,對(duì)篩選到的微生物視紫紅質(zhì)做了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列比對(duì),并對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行了基于7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)生分析.1材料和方法1.1psi-blast算法我們用酵母熱激蛋白對(duì)美國基因數(shù)據(jù)庫(GenBankDatabase)進(jìn)行了PSI-BLAST搜索.酵母熱激蛋白(Yeast30kDaheatshockproetin)和微生物視紫紅質(zhì)在進(jìn)化上有很弱的同源性.PSI-BLAST(Position-SpecificIteratedBLAST,特異位點(diǎn)迭代BLAST)對(duì)有非常弱的同源性氨基酸序列比較敏感.PSI-BLAST算法會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特異位點(diǎn)得分矩陣(position-specificscorematrix),使用這個(gè)矩陣對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反復(fù)的迭代BLAST搜索.每次搜索得到的新序列也會(huì)被加入這個(gè)矩陣中,所以即使進(jìn)化上非常遙遠(yuǎn)的序列只要有很弱的同源性也可以用PSI-BLAST搜索到.PSI-BLAST算法被整合在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的蛋白質(zhì)BLAST網(wǎng)頁上.在PSI-BLAST算法參數(shù)中,我們把數(shù)據(jù)庫設(shè)為非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Non-redundantproteinsequences),矩陣(Matrix)設(shè)為BLOSUM80,閾值(Threshold)為0.005.BLOSUM80矩陣對(duì)同源性弱的序列比BLOSUM45矩陣和BLOSUM62矩陣更敏感.我們進(jìn)行了多次迭代搜索,第4次迭代搜索后找到的新序列基本上都是直接從環(huán)境中(unculturedbacterium)測(cè)序的序列,由于無法知道這些細(xì)菌的準(zhǔn)確分類,我們排除了第4次迭代后搜索到的序列.我們對(duì)前3次迭代搜索中找到的序列也進(jìn)行了篩選,排除了長度小于200個(gè)氨基酸、非視紫紅質(zhì)(hypotheticalproteinorunnamedprotein)和高于閾值(E-value>0.005)的序列.對(duì)具有相同E值的序列,其中相當(dāng)一部分是不同名稱重復(fù)出現(xiàn)的相同序列,即使是不同的序列由于E值相同,它們同酵母熱激蛋白在進(jìn)化距離上也相似,所以對(duì)具有相同E值的序列我們也只取其中的1條或2條序列.1.2mammol-malth-malth結(jié)構(gòu)比對(duì)對(duì)于序列同源性不高的微生物基因,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比對(duì)是進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析的最好方式.但是由于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)不足,無法對(duì)所有的微生物視紫紅質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比對(duì).所以我們只能用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為指導(dǎo),在氨基酸序列比對(duì)中找出相應(yīng)的7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域,以這些區(qū)域來進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析.我們首先對(duì)4個(gè)有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的微生物視紫紅質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì).4個(gè)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)比對(duì)由基于網(wǎng)頁的MAMMOTH-mult程序完成,MAMMOTH結(jié)構(gòu)比對(duì)法是完全獨(dú)立于氨基酸序列之外的模型比較的探索式算法.該程序可以直接進(jìn)行多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比對(duì),可以通過以下鏈接獲取:http://ub.cbm.uam.es/mammoth/mult.我們?nèi)缓笥密浖﨏LUSTALW對(duì)所有38條微生物視紫紅質(zhì)序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì).首先,在這38條氨基酸序列比對(duì)結(jié)果中找出具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的4條序列.然后,通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比對(duì)中找到的結(jié)構(gòu)同源區(qū)域,在這4個(gè)微生物視紫紅質(zhì)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果中找出能夠?qū)?yīng)的區(qū)域,看這些對(duì)應(yīng)區(qū)域是否在7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)內(nèi).在4個(gè)微生物視紫紅質(zhì)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果中確定7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)內(nèi)的對(duì)應(yīng)區(qū)域后,其他34條序列以這4條序列的7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)為參考,找出所有38條序列中7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)內(nèi)的對(duì)應(yīng)區(qū)域.最后在38條序列的氨基酸序列中把位于7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)外的區(qū)域刪除,最后得到的就是基于7個(gè)α螺旋跨膜的比對(duì)結(jié)果.1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論我們使用了兩種特點(diǎn)完全不同的方法對(duì)基于7個(gè)α螺旋跨膜的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析.先使用了基于距離數(shù)據(jù)的鄰接法(Neighbor-joining),鄰接法由軟件平臺(tái)MEGA3.1完成,使用的模型為p-istance,并用Bootstrap檢驗(yàn)對(duì)重建的系統(tǒng)發(fā)生樹的每個(gè)分支進(jìn)行了重抽樣測(cè)試,重復(fù)數(shù)為500.最后得到Bootstrap一致樹.我們又使用了基于特征數(shù)據(jù)的貝葉斯法,采用的軟件為MrBayes3.1.1.由于貝葉斯法需要預(yù)先估算氨基酸進(jìn)化模型,可以估算最適氨基酸進(jìn)化模型的軟件ProtTest被用于對(duì)基于7個(gè)α螺旋跨膜的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行最適氨基酸進(jìn)化模型的計(jì)算.把由ProtTest得到的最適氨基酸進(jìn)化模型預(yù)設(shè)于MrBayes中,把世代設(shè)為500000(ngen=500000),把抽樣頻率設(shè)為100(samplefreq=100).貝葉斯法計(jì)算的對(duì)數(shù)類似值(lnLikelihood),在10000個(gè)世代后開始達(dá)到-10830左右的穩(wěn)定值.最后通過總結(jié)25%的樣本樹(sumtburnin=1250),取得了一致樹,包括枝長和每個(gè)進(jìn)化枝的可信度.最后用軟件TreeView來展示貝葉斯樹.2結(jié)果2.1長17氨基酸序列比對(duì)圖1是4個(gè)微生物視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比對(duì)的結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)微生物視紫紅質(zhì)在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)中具有高度的結(jié)構(gòu)同源性.圖2是相同的4個(gè)微生物視紫紅質(zhì)氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果,和圖1作比較,可以看出在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)內(nèi)結(jié)構(gòu)比對(duì)的結(jié)果與序列比對(duì)結(jié)果基本可以達(dá)成一致.特別是在2個(gè)圖中,氨基酸的保守位點(diǎn)完全一致.所以即使在沒有所有蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的情況下,通過4個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果為指導(dǎo),還是可以在38條氨基酸序列比對(duì)結(jié)果中找出7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)的基本位置和相應(yīng)的結(jié)構(gòu)同源性區(qū)域.其他34條序列中與圖2中用黑框框出的區(qū)域可以用序列比對(duì)上的部分被留下,不能與黑框框出的區(qū)域比對(duì)上的部分將被刪除,最后得到了長170氨基酸的比對(duì)結(jié)果(見第608頁圖2).2.2氨基酸進(jìn)化模型通過軟件ProtTest由基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果,對(duì)各個(gè)進(jìn)化模型進(jìn)行綜合比較,最適模型為Blosum62+G+F.+G說明在該蛋白質(zhì)中每個(gè)氨基酸位點(diǎn)的替代率是不同的,+F說明使用了觀測(cè)到的氨基酸頻率.但在MrBayes中只能設(shè)氨基酸進(jìn)化模型(aamodel=Blosum62),而無法設(shè)+G,+F等參數(shù).2.3微生物視紫紅質(zhì)的進(jìn)化枝鄰接法(NJ)做出無根系統(tǒng)發(fā)生樹(見第609頁圖3),可以發(fā)現(xiàn)這38條微生物視紫紅質(zhì)分成了3個(gè)進(jìn)化枝,每個(gè)進(jìn)化枝中通過古細(xì)菌,細(xì)菌和真核微生物的多少,可以基本定為A類群——真核微生物視紫紅質(zhì),B類群——古細(xì)菌類視紫紅質(zhì)和C類群——細(xì)菌類視紫紅質(zhì).但在每個(gè)大類中,并非只有一個(gè)生物域.在A類群中,有10條真核微生物視紫紅質(zhì),但在該類的根部有2條古細(xì)菌類視紫紅質(zhì).在B類中,有8條古細(xì)菌類視紫紅質(zhì)和4條細(xì)菌類視紫紅質(zhì),這8條古細(xì)菌類視紫紅質(zhì)可以再分為兩個(gè)亞類,但在每個(gè)亞類中都混有細(xì)菌類視紫紅質(zhì).C類群中,細(xì)菌類視紫紅質(zhì)有9條而真核微生物視紫紅質(zhì)有5條,其根部為3條真核微生物視紫紅質(zhì),而9條細(xì)菌類視紫紅質(zhì)與2條真核微生物視紫紅質(zhì)混雜在一起.為了便于識(shí)別,貝葉斯法做的是有根樹(第610頁圖4),外類群設(shè)為念珠藻感覺視紫紅質(zhì)(AsSR),但是并不說明念珠藻感覺視紫紅質(zhì)在這些微生物視紫紅質(zhì)中是最古老的.雖然貝葉斯樹和鄰接樹和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常不同,但是兩樹進(jìn)化枝的分類還是大致相同的.在貝葉斯樹中,所有的微生物視紫紅質(zhì)也可以分為3大類.A群類全是真核微生物視紫紅質(zhì),但是少了2條真核微生物視紫紅質(zhì)和2條古細(xì)菌類視紫紅質(zhì).B類古細(xì)菌類視紫紅質(zhì)和鄰接法的無根樹組成一致.在C類細(xì)菌類視紫紅質(zhì)中,多了2條原來屬于A類群的真核微生物視紫紅質(zhì).原來屬于A類群的兩條古細(xì)菌類視紫紅質(zhì)(HsHR和HrHR)獨(dú)立了出來,與3個(gè)主要進(jìn)化枝為平行關(guān)系.從兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)生樹,可以發(fā)現(xiàn)這樣的進(jìn)化關(guān)系:微生物視紫紅質(zhì)在進(jìn)化中主要分化為3個(gè)平行的類群;在A類群中,真核生物微生物視紫紅質(zhì)是獨(dú)立分化的;在B類群中,雖然古細(xì)菌微生物視紫紅質(zhì)占了絕大部分,但細(xì)菌微生物視紫紅質(zhì)位于這個(gè)進(jìn)化枝的根部;在C類群中,細(xì)菌微生物視紫紅質(zhì)占半數(shù)以上,但真核的藻類視紫紅質(zhì)位于這個(gè)進(jìn)化枝的根部.3微生物視紫紅質(zhì)的進(jìn)化絕大部分已知功能的微生物視紫紅質(zhì)為光感受器和產(chǎn)能用的質(zhì)子泵,所以可以推斷微生物視紫紅質(zhì)最初的功能就是用來感受和利用太陽光,光感受器和質(zhì)子泵兩個(gè)功能并不相互排斥.基因復(fù)制被認(rèn)為是進(jìn)化中起作用的重要手段,基因復(fù)制后基因的冗余使得功能上的分化變得有可能,普通嗜鹽菌的4個(gè)微生物視紫紅質(zhì)功能分別是光感受器,質(zhì)子泵和氯離子泵.在3類微生物視紫紅質(zhì)中,B類古細(xì)菌類視紫紅質(zhì)可能是最古老的一個(gè)類群,無論是鄰接樹還是貝葉斯樹中B類群中都沒有真核生物,其中6個(gè)起光感受器的作用,2個(gè)起質(zhì)子泵的作用;而且在B類群中,基因復(fù)制和功能上的分化都可以被找到,來自普通嗜鹽菌的古細(xì)菌類視紫紅質(zhì)在B類群中占了3個(gè),包括2個(gè)光感受器(HsSR1,HsSR2)和一個(gè)質(zhì)子泵(HsBR).在C類群中的微生物視紫紅質(zhì)都來自于浮游生物,海生細(xì)菌微生物視紫紅質(zhì)為主,但真核的藻類微生物視紫紅質(zhì)在鄰接樹(5/14)或貝葉斯樹(7/16)中都占了相當(dāng)一部分,而且從進(jìn)化關(guān)系上來看,C類群的所有分類單元都可能來自于一個(gè)真核的藻類視紫紅質(zhì)的祖先.在A類群中,真菌類(fungus)占了5條(LmO,NcO1,SsO1,CpO1和ScHSP),鄰接樹和貝葉斯樹中高等多細(xì)胞植物水稻的假設(shè)視紫紅質(zhì)(OsPO)都和真菌(Leptosphaeriamaculans)聚類在一起.幾乎所有的植物都與真菌有共生關(guān)系(symbiosis).水稻中的視紫紅質(zhì)非?？赡軄碜杂谠谶M(jìn)化早期與之共生的真菌,在漫長的進(jìn)化過程中該基因丟失了功能,變成了水稻中的假基因.微生物視紫紅質(zhì)的進(jìn)化和分化相當(dāng)?shù)膹?fù)雜,在3個(gè)類群中,古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物混雜在一起,但是A、B和C類群都只包括生物三界系統(tǒng)中的兩個(gè)域.對(duì)于這樣的結(jié)果,一個(gè)可能的假設(shè)是在古細(xì)菌與細(xì)菌間、細(xì)菌與真核生物間、古細(xì)菌與真核生物間的水平基因傳遞.生活在同一環(huán)境中的微生物中的視紫紅質(zhì)往往都在同一個(gè)進(jìn)化枝上,穿梭質(zhì)粒(shuttlevector)是生活在同一環(huán)境中不同物種間水平交換基因的一種方式.微生物視紫紅質(zhì)在生物的三界系統(tǒng)中普遍存在,說明微生物視紫紅質(zhì)相當(dāng)古老,其來源可能追溯到生物的三界系統(tǒng)分化前,細(xì)胞生物的最后共同祖先中(LastUniversalCellularAncestor).另一個(gè)可能的假設(shè)是,細(xì)胞生物的最后共同祖先可能以群落方式存在,生物的三界系統(tǒng)以兩兩分化的方式出現(xiàn),古細(xì)菌與細(xì)菌、細(xì)菌與真核生物、古細(xì)菌與真核生物都是成對(duì)從原始的類細(xì)胞中分化出來,