齊魯醫(yī)學(xué)固定化酶與固定化細(xì)胞

第四章固定化酶與固定化細(xì)胞2021/9/301本章內(nèi)容

酶的固定化

(1)為什么要固定化?(2)怎樣固定化?(固定化方法)(3)固定化酶的特性細(xì)胞的固定化

(1)細(xì)胞固定化所用的方法

(2)固定化細(xì)胞的特性輔酶的固定化2021/9/302什么是固定化酶？指固定在一定載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。一酶的固定化2021/9/303直接利用微生物酶——（1）不穩(wěn)定。在高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿下。（2）易失活。即使在最適合的條件下反應(yīng)。（3）回收困難。用適當(dāng)方法提取目的產(chǎn)物后，殘存酶回收困難。（4）反應(yīng)速度減慢。不容易和毒副分子和產(chǎn)物分離.（5）經(jīng)濟(jì)上不合算。一次性反應(yīng)后不能再次使用。阻礙了微生物酶的應(yīng)用和發(fā)展。研制固定化酶和固定化菌體(一)為什么要固定化?

2021/9/304(一)為什么要固定化?

在一定程度上可以改善酶的穩(wěn)定性；可以多次反復(fù)使用，有利于采用連續(xù)操作工藝，從而使酶和細(xì)胞的使用率提高，降低生產(chǎn)成本；酶和細(xì)胞不混入產(chǎn)物，可精簡(jiǎn)產(chǎn)物分離工序。2021/9/305(1)固定化在一定程度上可以改善酶的穩(wěn)定性固定化增加了酶的耐熱性（熱變性原理）固定化增加了酶對(duì)蛋白變性劑（尿素，鹽酸胍）等的抵抗能力固定化減少了蛋白酶的作用（阻礙了活性部位的接近）2021/9/306(2)固定化使酶和細(xì)胞的使用率提高江南大學(xué)的孫志浩通過卡拉膠包埋的方法，使酶的重復(fù)利用30個(gè)批次后活性沒有明顯減少，大大促進(jìn)了酶的利用率，加速了工藝工業(yè)化進(jìn)程．2021/9/307(3)可精簡(jiǎn)產(chǎn)物分離工序底物和產(chǎn)物更容易和酶分離2021/9/308(二)怎樣固定化?(固定化方法)2021/9/309固定化的第五種方法變性法在不使用載體的情況下，借助加熱、冰凍或β-射線等物理手段，也可通過添加檸檬酸、各種絮凝劑、交聯(lián)劑或變性劑處理，使細(xì)胞內(nèi)起破壞作用的蛋白酶變性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定和菌體聚集成大顆粒達(dá)到固定化的目的。此法制備的細(xì)胞一般只用于完成單酶或少數(shù)幾種酶催化反應(yīng)。

2021/9/3010(1)吸附法物理吸附是通過氫鍵、疏水鍵和π電子親和力等物理作用力將酶固定于不溶性載體的方法。常用的載體有高嶺土、皂土、硅膠、磷酸鈣膠、氧化鋁、微孔玻璃等無機(jī)吸附劑離子交換吸附是在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換劑的相互作用而達(dá)到固定化的一種方法。最常用的交換劑有CM－纖維素、DEAE－纖維素、DEAE－葡聚糖凝膠等。

2021/9/3011蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。

pH：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附。離子強(qiáng)度：多方面的影響，一般認(rèn)為鹽阻止吸附。溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。載體：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得同時(shí)對(duì)于非多孔性載體，則顆粒越小吸附力越強(qiáng)。多孔性載體，要考慮吸附對(duì)象的大小和總吸附面積的大小。

影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素2021/9/3012吸附法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心不易破壞，有利于制備高活性酶缺點(diǎn)：載體與酶的結(jié)合力較弱，在高離子強(qiáng)度下酶易從載體上脫落2021/9/3013吸附法（制備的工藝）水相固定化法這是最常見的吸附固定化方法，即將酶溶解于緩沖液中，加入載體，振蕩或攪拌一定時(shí)間后，抽濾、洗滌、冷凍干燥即可得固定化酶載體表面涂布法將酶溶入少量緩沖液中，加入載體，混合均勻，冷凍干燥可得固定化酶。此法相當(dāng)于直接將酶涂布于載體上，避免了水相固定化中酶的大量流失溶劑沉淀法即在低溫下向含有載體的脂肪酶液中加入酶的有機(jī)溶劑作沉淀劑(如丙酮)使酶析出，沉淀在載體表面。此法所得固定化酶酶活性較高，載體性質(zhì)對(duì)固定化無明顯影響，但酶在載體表面分布不均勻2021/9/3014吸附法（制備的工藝）游離固定化法將具有一定親水性的載體分散于疏水溶劑中，另將酶粉溶入少量緩沖液的酶液加入，振蕩可攪拌一定時(shí)間后，便得固定化酶。其原理是：親水性載體可在其表面形成一層水膜，酶分子不溶于溶劑，只能存在于這層水膜中，因而可以完全被固定化微晶體法將可結(jié)晶的物質(zhì)和酶溶液混合在一起，然后滴入親水有機(jī)溶劑中，當(dāng)可結(jié)晶物質(zhì)結(jié)晶析出時(shí)，酶就有規(guī)則吸附在晶體表面上電沉積法。在酶溶液中放置兩個(gè)電極，在電極臨近加入載體，通電后，酶移向電極，并沉積到載體表面的固定化方法。采用這種方法時(shí)需事先確定載體和酶在電場(chǎng)中是否會(huì)分解和失活。在沉積過程中和酶活性、穩(wěn)定性有關(guān)的某些離子如果發(fā)生移除、損漏，那么就必須即時(shí)補(bǔ)充、替代。2021/9/3015(2)共價(jià)結(jié)合法借助共價(jià)鍵將酶的活性非必須側(cè)鏈基團(tuán)或細(xì)胞表面基團(tuán)（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基等）和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)以達(dá)到固定化目的方法。此法得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用，因此它是目前應(yīng)用最多的一類固定化酶的方法。2021/9/3016共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)：得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。

共價(jià)偶聯(lián)法的缺點(diǎn)：載體活化的操作復(fù)雜，反應(yīng)條件激烈，需要嚴(yán)格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時(shí)共價(jià)結(jié)合會(huì)影響到酶的空間構(gòu)象，從而對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生影響。共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)2021/9/3017共價(jià)結(jié)合法example纖維素+鹽酸甲醇CMC－甲酯＋肼CMC－酰肼CMC－疊氮化物＋NH2酶亞硫酸鈉鹽酸＋固定化酶－CH2CO-NH酶CMC－CH2COOH制備酰肼疊氮化物羧甲基纖維素疊氮法制備固定化葡萄糖淀粉酶程序重氮法溴化氰法烷基化（三氯勻三嗪）疊氮法2021/9/3018A．重氮法反應(yīng)式及原理2021/9/3019B疊氮法例用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下：⑴酯化⑵肼解⑶疊氮化(4)偶聯(lián)2021/9/3020B疊氮法對(duì)含有羧基的載體，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后與酶偶聯(lián)。與酶中的氨基、羥基、巰基反應(yīng)。2021/9/3021C．烷基化反應(yīng)法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。與酶中的氨基、羥基、巰基反應(yīng)。2021/9/3022D．硅烷化法多孔玻璃特點(diǎn)：①機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。②耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長(zhǎng)等。2021/9/3023D．硅烷化法一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。2021/9/3024D．硅烷化法2021/9/3025D．硅烷化法2021/9/3026D．硅烷化法2021/9/3027E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。2021/9/3028E．溴化氰法與酶中的氨基反應(yīng)2021/9/30291)載體的物化性質(zhì)要求載體親水(避免吸附)，并且有一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時(shí)具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán)。

2)

偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件必須在溫和pH、中等離子強(qiáng)度和低溫的緩沖溶液中。

3)

所選擇的偶聯(lián)反應(yīng)要盡量考慮到對(duì)酶的其它功能基團(tuán)副反應(yīng)盡可能少。

4)

要考慮到酶固定化后的構(gòu)型，盡量減少載體的空間位阻對(duì)酶活力的影響。

共價(jià)偶聯(lián)法固定化酶的幾個(gè)影響因素

共價(jià)偶聯(lián)法成功的關(guān)鍵在于載體的選擇、偶聯(lián)反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)過程中的活性保護(hù)和偶聯(lián)量的多少。此法固定化細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)甚少，它的發(fā)展有賴于新的溫和偶聯(lián)方法和生物相容性好的偶聯(lián)試劑的開發(fā)2021/9/3030(3)交聯(lián)法利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、或酶分子與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以制備固定化酶的方法。常用的試劑有戊二醛、甲苯二異氰酸酯、乙烯-馬來酸酐共聚物等。交聯(lián)法操作簡(jiǎn)便，但交聯(lián)反應(yīng)往往比較激烈，許多酶容易在固定化過程中失活，酶回收率不高。

2021/9/3031交聯(lián)法發(fā)生作用的氨基酸殘基：

酪氨酸的酚基胱氨酸的SH巰基

N－末端的a－氨基常用的雙功能或多功能試劑：

戊二醛聚甲叉雙碘乙酰胺雙重氮聯(lián)苯胺2021/9/3032共價(jià)交聯(lián)法的四種形式1）酶直接交聯(lián)法

在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴于酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。操作簡(jiǎn)單，但是缺乏選擇性，活力回收往往不高。2021/9/30332）酶輔助蛋白交聯(lián)：

當(dāng)可得到的酶量有限，可以使用第二個(gè)“載體”蛋白來增加蛋白質(zhì)濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。這種“載體”蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、明膠、血紅蛋白等。2021/9/30343）吸附交聯(lián)法：此法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。2021/9/30354）載體交聯(lián)法：

用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)酶蛋白。

2021/9/3036(4)包埋法通過物理或化學(xué)的方法將酶或細(xì)胞限制在一定的空間范圍內(nèi)，底物和產(chǎn)物能自由擴(kuò)散，從而達(dá)到重復(fù)利用生物質(zhì)的一種固定化方法。此方法是固定化細(xì)胞的最主要方法。包埋法可分為格型包埋和微囊型包埋。前者是將酶或細(xì)胞分散包埋在聚合物的膠格中，如聚丙烯酰胺凝膠、卡拉膠、聚乙烯醇、海藻酸鈣等；后者是將一定量的酶或細(xì)胞包在半透膜內(nèi)，如尼龍膜、醋酸纖維、NaCS/PDMDAAC膠囊等。此法制備條件溫和、生物相容性好，但僅可用于低分子量的底物，且常受擴(kuò)散限制。

2021/9/3037微膠囊特點(diǎn)微囊直徑幾微米～幾百微米。低分子底物可以自由通過并進(jìn)入微囊內(nèi)。酶本身是高分子物質(zhì)不能通過微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質(zhì)也無法進(jìn)入微囊內(nèi)2021/9/3038包埋法的優(yōu)點(diǎn)在于它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶結(jié)構(gòu)但是又較牢固的固定化方法。

包埋法的缺點(diǎn)是只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物網(wǎng)架擴(kuò)散，對(duì)那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。這是由于高聚物網(wǎng)架會(huì)對(duì)大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為改變，使活力降低。包埋法的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)2021/9/3039微囊化制備方法微囊法主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主要用于醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適于工業(yè)使用。微囊制備方法（1）界面沉淀法是一種簡(jiǎn)單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。（2）界面聚合法有機(jī)溶液中添加表面活性劑使之乳化形成油包水結(jié)構(gòu),再用單體分子在界面聚合,達(dá)到包埋目的的一種方法。

（3）原位聚合沒有界面發(fā)生的聚合反應(yīng)成膜2021/9/3040A乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機(jī)溶媒中充分乳化。B表面聚合：將含有疏水性單體的有機(jī)溶媒加入到上述乳化液中，發(fā)生聚合反應(yīng)，生成的薄膜把酶包圍起來形成微型膠囊球。C清洗：反應(yīng)完成后，用有機(jī)溶劑洗去未反應(yīng)的剩余單體1界面聚合法2021/9/3041微膠囊的制備（example)-原位聚合NaCS(SodiumCelluloseSulphate）纖維素硫酸鈉

PDMDAAC(PolydimethyldiallylammoniumChloride，聚二甲基二烯丙基氯化銨這兩種物質(zhì)均是能溶于水的聚電解質(zhì)。NaCS是聚陰離子化合物，PDMDAAC為聚陽離子化合物，當(dāng)這兩種帶不同電荷的物質(zhì)混合時(shí)，在兩者的界面發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成多聚電解質(zhì)復(fù)合體（PEG，PolyelectrolyteComplexe，形成了一層半透膜。

2021/9/3042NaCS-PDMDAAC微膠囊制備的反應(yīng)過程示意圖

2021/9/3043固定化酶的制法及其特性比較

特性制備方法共價(jià)鍵結(jié)合法離子結(jié)合法物理吸附法包埋法制法難易易難酶活力高高高低底物特異性易變不變不變不變結(jié)合能力強(qiáng)中弱弱再生不可可能可能不可交聯(lián)法難中易變強(qiáng)不可2021/9/3044固定化酶的保存方法使用時(shí)固定化酶的保存是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)。1真空冷凍干燥保存（長(zhǎng)期保存）2低溫保存3多孔玻璃的無機(jī)質(zhì)載體比纖維素等的有機(jī)質(zhì)載體更適于長(zhǎng)期保存。4無機(jī)質(zhì)載體中，以重氮結(jié)合法制備的固定化酶具有較好的保存性。2021/9/3045(三)固定化酶特性固定化后酶會(huì)發(fā)生(１)（載體－＞酶）

構(gòu)象變化微擾立體屏蔽酶特異性(Km)穩(wěn)定性以及最適溫度(２)（載體－＞底物）

分配效應(yīng)擴(kuò)散效應(yīng)最適pH變化2021/9/3046立體屏蔽：是由于載體的孔隙太小，或是由于固定化的方式與位置不當(dāng)，給酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心造成了空間障礙，因而底物與效應(yīng)物無法和酶接觸，從而影響酶活性的一種效應(yīng)。這種效應(yīng)也難于定量描寫，多見于包埋，吸附法或共價(jià)偶聯(lián)法。微擾：是由于載體的親水、疏水性質(zhì)和介質(zhì)的介電常數(shù)等直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)能力的一種效應(yīng)。這種效應(yīng)更難于定量描寫和預(yù)見，但是通過改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)可作出判斷與調(diào)節(jié)。2021/9/3047空間障礙效應(yīng)(立體屏蔽)固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制(因?yàn)檩d體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障)，使酶分子的活性基團(tuán)不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的分子活性中心對(duì)底物的定位作用,所造成的對(duì)固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為空間障礙效應(yīng)。

2021/9/3048分配效應(yīng)由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個(gè)環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效應(yīng)。

2021/9/3049擴(kuò)散限制效應(yīng)酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了擴(kuò)散阻力：

1）、外擴(kuò)散阻力是底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會(huì)使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。

2）內(nèi)擴(kuò)散阻力是指底物分子達(dá)到固相酶表面后傳遞到酶活性部位時(shí)的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散阻力。

2021/9/3050固定化酶的特性具體表現(xiàn)在如下特性：穩(wěn)定性(一般升高)

1)固定化后的酶與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形。

2)抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性最適溫度變化（一般升高，但有些酶仍然會(huì)降低，如烷基化固定的氨基?；福┳钸mpH（受底物影響和載體影響發(fā)生偏移動(dòng)）底物特異性（由于空間障礙妨礙底物接觸而影響Km值）2021/9/3051固定化酶最適pH變化底物

（擴(kuò)散限制）如酸性底物停留在酶分子周圍，使酶表面pH降低，需要升高溶液pH值才能達(dá)到原來最優(yōu)pH

－氫離子

底物滯留在酶表面降低宏觀H+(升高pH)2021/9/3052固定化酶最適pH變化載體（分配效應(yīng)）陰離子載體要達(dá)到自由酶表面氫離子水平（最優(yōu)pH）,必須升高宏觀溶液中OH濃度,減少分配進(jìn)入載體的氫離子2021/9/3053二細(xì)胞的固定化細(xì)胞固定化所用的方法固定化細(xì)胞的特性1、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體積小的生產(chǎn)菌集合體2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用。3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。4、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng)。2021/9/3054(一)細(xì)胞固定化所用的方法吸附法（依據(jù)細(xì)胞特性選擇吸附載體）

(1)酵母（負(fù)電荷）多孔陶瓷和塑料(2)霉菌（菌絲體長(zhǎng)）金屬網(wǎng)絲(3)植物細(xì)胞中孔纖維外壁(4)動(dòng)物細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）容器壁2021/9/3055細(xì)胞固定化所用的方法包埋法

包埋實(shí)質(zhì)上是酶周圍聚合(連接)的過程(1)溫度誘導(dǎo)的交聯(lián)瓊脂（機(jī)械強(qiáng)度差，擴(kuò)散困難）甲叉菜膠明膠(2)離子誘導(dǎo)交聯(lián)海藻酸鈣(3)光等誘導(dǎo)的交聯(lián)

1)聚丙烯酰胺

2)光交聯(lián)樹脂（聚氨酯預(yù)聚物，光敏劑，光）

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2.4%左右的卡拉膠，70℃溶解,再冷卻到42℃,+10%左右的細(xì)菌菌體(預(yù)熱到42℃）

迅速混合均勻

4℃冰箱放置大約30min

取出后切成3×3mm的小顆粒

Example:卡拉膠包埋2021/9/3057Example

海藻