穿山甲鱗片熒光PCR鑒定方法研究

北京理工大學(xué)珠海學(xué)院2016級(jí)本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)穿山甲鱗片熒光PCR鑒定方法研究 穿山甲鱗片熒光PCR鑒定方法研究摘要穿山甲作為全球非法貿(mào)易最嚴(yán)重的物種，正逐漸走向滅絕。因相傳穿山甲鱗片可治療許多病癥，人們趨之若鶩地大量捕殺穿山甲，市場(chǎng)流通著大量非法貿(mào)易的穿山甲鱗片。本實(shí)驗(yàn)采用與傳統(tǒng)鑒定穿山甲方法相比，鑒定效果更加精確、鑒定速度更加快的熒光定量PCR技術(shù)對(duì)穿山甲鱗片進(jìn)行定性測(cè)定。本次試驗(yàn)共有6組穿山甲的DNA樣品作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并設(shè)置6組非特異性樣品作為對(duì)照組，并將中華穿山甲質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，選取其中濃度為104為陽(yáng)性。不同于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察穿山甲鱗片、色譜儀檢測(cè)與普通PCR等方法，熒光PCR具有更高的靈敏度、特異性，其快速、高效的特點(diǎn)為結(jié)果帶來(lái)更加可靠的后盾。本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了4大組的實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室樣品檢測(cè)、特異性檢測(cè)、靈敏度檢測(cè)與重復(fù)性的測(cè)定。每一組都將會(huì)設(shè)置平行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)良好，樣品全部出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；非特異性的哺乳動(dòng)物樣品、陰性對(duì)照則全無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)；靈敏度測(cè)試試驗(yàn)中，熒光PCR能捕捉到稀釋倍數(shù)為10-8的DNA，是普通PCR靈敏度的兩倍；重復(fù)性中根據(jù)CT值計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)，結(jié)果都在5%以內(nèi)，具有相對(duì)較穩(wěn)定的擴(kuò)增。試驗(yàn)說(shuō)明，熒光PCR對(duì)穿山甲鱗片與其DNA的測(cè)定有相對(duì)可觀的優(yōu)勢(shì)。關(guān)鍵詞：引物設(shè)計(jì)；DNA提??；Real-time熒光定量PCR；穿山甲鱗片 StudyontheidentificationofpangolinscalesbyfluorescentPCR.AbstractAsthemostseriousspeciesintheworld,pangolinisbecomingextinct.Becauseitissaidthatpangolinscalescancuremanydiseases,peopleareflockingtokillalargenumberofpangolins,andalargenumberofillegallytradedpangolinscalesarecirculatinginthemarket.Inthisexperiment,comparedwiththetraditionalmethodofidentificationofpangolin,theidentificationeffectismoreaccurateandtheidentificationspeedisfaster.Inthisexperiment,sixgroupsofDNAsamplesofpangolinwereusedastheexperimentalobjects,andsixgroupsofnon-specificsampleswereusedasthecontrolgroup.Theplasmidofpangolinwasdilutedingradient,and104ofthemwereselectedaspositive.Differentfromthetraditionalmorphologicalobservationofpangolinscales,chromatographdetectionandcommonPCR,fluorescentPCRhashighersensitivityandspecificity,anditsfastandefficientcharacteristicsprovidemorereliablebackingfortheresults.Fourgroupsofexperimentswerecarriedoutinthisexperiment,includinglaboratorysampledetection,specificdetection,sensitivitydetectionandrepeatabilitydetection.Paralleltestswillbesetupforeachgroup.Insensitivitytest,fluorescentPCRcancaptureDNAwithdilutionratioof10-8,whichistwicethesensitivityofordinaryPCR.Inrepeatability,thestandarddeviationandcoefficientofvariationarecalculatedaccordingtoCTvalue,andtheresultsareallwithin5%,whichisrelativelystableAmplification.TheresultsshowedthatfluorescentPCRhadaconsiderableadvantageinthedeterminationofDNAandscalesofpangolin.Keywords:realtimefluorescencequantitativePCR;pangolinscales 目錄50071前言 前言1.1課題背景隨著人口的增長(zhǎng)，自然動(dòng)物棲息地不斷遭到破壞，人類的入侵和對(duì)自然棲息地的破壞加重，許多自然環(huán)境遭到摧毀。全球?qū)?dòng)物皮毛、象牙、野味和傳統(tǒng)中藥材的需求絲毫沒(méi)有減弱，許多動(dòng)物因此遭受滅頂之災(zāi)，甚至整個(gè)物種逐漸走向消亡。其中，穿山甲是其中一員。穿山甲是全世界非法貿(mào)易最嚴(yán)重的物種，穿山甲物種在人類的貪婪下，正逐漸走向滅亡。1.1.1穿山甲簡(jiǎn)介穿山甲現(xiàn)存有：印度穿山甲、菲律賓穿山甲、大穿山甲、馬來(lái)穿山甲、中華穿山甲、南非穿山甲、長(zhǎng)尾穿山甲和樹(shù)穿山甲8個(gè)種。他們是哺乳動(dòng)物中的一個(gè)相對(duì)較小的分類群，他們隸屬于鱗甲目、穿山科、穿山甲屬，現(xiàn)存8個(gè)種。根據(jù)2016年12月發(fā)布的CITES（國(guó)際瀕臨絕種動(dòng)植物貿(mào)易公約）公約附錄正式版，8個(gè)種已全數(shù)被其列入附錄Ⅰ。穿山甲的鱗片被許多人視為良藥，人們盲目地追崇著穿山甲鱗片的功效，也盲目地對(duì)穿山甲進(jìn)行大規(guī)模的圍獵。但事實(shí)上，大穿山甲鱗片的主要成分為角蛋白，和人類的指甲、馬蹄和大部分爬行動(dòng)物的鱗片的主要組成成分相同。根據(jù)一些傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的說(shuō)法，穿山甲鱗片有治療風(fēng)濕、感染、氣喘、癌癥等疾病的效果。需求供給來(lái)自亞洲野外非法捕捉，但近年來(lái)越來(lái)越多的報(bào)道來(lái)自非洲的穿山甲非法貿(mào)易，這意味著亞洲穿山甲種群已經(jīng)明顯下降?，F(xiàn)在想在內(nèi)陸找到野生穿山甲可能性已經(jīng)十分低[1]。1.1.2穿山甲現(xiàn)狀穿山甲作為唯一擁有全身鱗片的哺乳動(dòng)物，卻恰恰因?yàn)檫@一身的鱗片遭受人類的大肆追捕。因?yàn)槠渌幱脙r(jià)值以及食用價(jià)值而遭到人類的追捕狩獵，又因?yàn)槠浞敝车奶厥庑裕由蠗⒌乇蝗祟惼茐模沟闷湮锓N的繁衍面臨巨大的威脅，現(xiàn)已成了極度瀕危的物種。甚者，中華穿山甲是我國(guó)藥典中唯一的來(lái)源，違法犯罪分子更是對(duì)穿山甲虎視眈眈。即使國(guó)家對(duì)穿山甲的保護(hù)重視程度不斷增強(qiáng)，但依然有人鋌而走險(xiǎn)，高價(jià)出售或購(gòu)買(mǎi)穿山甲。每年海關(guān)都可以截獲大量走私的野生穿山甲，包括穿山甲活體、鱗片、肉塊等等穿山甲制作的產(chǎn)品。有數(shù)據(jù)顯示，在亞洲地區(qū)，想找到野生穿山甲已經(jīng)十分困難，又因其價(jià)值，刺激了非洲穿山甲的非法貿(mào)易。即使國(guó)家對(duì)穿山甲的保護(hù)重視程度不斷增強(qiáng)，但依然有人因?yàn)槠鋷?lái)的經(jīng)濟(jì)效益，藥用價(jià)值，食用價(jià)值等，從而鋌而走險(xiǎn)，高價(jià)出售或購(gòu)買(mǎi)穿山甲。每年海關(guān)都可以截獲大量走私的野生穿山甲，包括穿山甲活體、鱗片、肉塊等等穿山甲制作的產(chǎn)品。在海關(guān)查貨的物品中，常常有殘缺的肉塊或鱗片，無(wú)法從形態(tài)上進(jìn)行穿山甲物種的鑒定。甚至有人將摻假、造假穿山甲鱗片，將其他物質(zhì)摻入或直接制造出穿山甲鱗片進(jìn)行售賣(mài)。1.1.4穿山甲鑒定現(xiàn)狀目前鑒定的方法有普通PCR擴(kuò)增、形態(tài)學(xué)鑒定等。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定需要觀察甲片的紋理、質(zhì)地、斷面形態(tài)等來(lái)判斷其種類或是否為穿山甲甲片。但往往樣品會(huì)因各種原因影響其外觀，從而對(duì)鑒定帶來(lái)不便與難度。目前對(duì)于穿山甲的鑒定方面研究相對(duì)較少，對(duì)于辨別穿山甲的分子生物學(xué)水平的鑒定更加缺乏，然而DNA分子技術(shù)鑒定不會(huì)受到甲片的數(shù)量、形狀、狀態(tài)等影響，對(duì)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性等更加有優(yōu)勢(shì)。隨著科技發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定方法、設(shè)備等發(fā)展，開(kāi)始有研究人員將對(duì)穿山甲鑒定目光從傳統(tǒng)的方法，如：從形態(tài)觀察、離子色譜儀測(cè)定等向分子生物學(xué)鑒定方向轉(zhuǎn)移。1.2Real-Time熒光定量PCR技術(shù)本次實(shí)驗(yàn)選擇熒光定量PCR技術(shù)對(duì)穿山甲鱗片樣品進(jìn)行檢測(cè)。相比起普通PCR，熒光PCR具有較強(qiáng)的特異性，靈敏度也比較高，結(jié)果可靠、過(guò)程高效，并且比傳統(tǒng)的各式PCR更加節(jié)省時(shí)間。普通PCR中，在完成PCR的步驟之后，還需要進(jìn)行電泳檢測(cè)才能直觀地觀察到PCR擴(kuò)增的結(jié)果。熒光PCR更加直觀快速地展示擴(kuò)增結(jié)果，為檢測(cè)工作帶來(lái)便利。熒光定量PCR實(shí)際上是利用加入熒光基團(tuán)的體系，當(dāng)模板在設(shè)定的工作參數(shù)下開(kāi)始擴(kuò)增，熒光信號(hào)將被儀器捕捉。儀器對(duì)體系中熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)控，即可觀察到整個(gè)擴(kuò)增的過(guò)程。實(shí)時(shí)熒光PCR的應(yīng)用隨著分子生物學(xué)的發(fā)展也得到更多的重視與引用，在獸醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域都得到應(yīng)用和推廣。1.2.1TaqMan探針熒光定量PCR的原理TaqMan探針?lè)ㄖ兴褂玫奶结樈?jīng)過(guò)特殊處理，探針的5’端帶有熒光物質(zhì)，3’端有淬滅物質(zhì)。帶有特殊物質(zhì)的探針與引物一起加入至熒光定量PCR的體系中，特殊物質(zhì)的作用下，儀器將可對(duì)整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)與監(jiān)控。在擴(kuò)增的過(guò)程中，加入的探針還沒(méi)有被體系中的Taq酶分解時(shí)，5’端的熒光物質(zhì)受到3’端的淬滅物質(zhì)的制約，抑制其熒光物質(zhì)，體系則不會(huì)發(fā)出熒光，儀器不會(huì)捕捉到熒光信號(hào)。只有當(dāng)TaqMan探針被分解，5’端的熒光物質(zhì)將脫離3’端的淬滅物質(zhì)的抑制，發(fā)出熒光[2]。1.2研究?jī)?nèi)容與實(shí)驗(yàn)流程1.2.1研究目的與內(nèi)容為排除因穿山甲鱗片的形態(tài)、狀態(tài)等影響鑒定結(jié)果的不利條件，并且提高檢測(cè)效率與檢測(cè)結(jié)果可信度，本次實(shí)驗(yàn)選定利用熒光PCR技術(shù)對(duì)穿山甲鱗片在分子生物學(xué)水平進(jìn)行更精確、快速的鑒定。并且對(duì)熒光PCR技術(shù)在鑒定穿山甲NDA樣品中的特異性、靈敏性和重復(fù)性中的綜合評(píng)估。1.2.2實(shí)驗(yàn)流程圖1試驗(yàn)流程圖2引物和探針設(shè)計(jì)2.1穿山甲基因序列的查詢與比對(duì)在NCBI網(wǎng)站中搜索所需要的序列名稱，得到所需的馬來(lái)穿山甲、中華穿山甲、菲律賓穿山甲與印度穿山甲4種穿山甲的基因序列。亞洲主要分布著馬來(lái)穿山甲、中華穿山甲、印度穿山甲和菲律賓穿山甲4種，本次實(shí)驗(yàn)引物針對(duì)此4種穿山甲設(shè)計(jì)亞洲穿山甲的通用引物。利用DNAStar7.0軟件對(duì)4種穿山甲的基因序列進(jìn)行序列的比對(duì)。2.2引物設(shè)計(jì)比對(duì)了穿山甲的序列，研究其序列的異同點(diǎn)。下載PrimerPremier6，利用其軟件結(jié)合所得基因序列比對(duì)結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。雖然大多軟件有自動(dòng)篩選和搜索的功能，但為得到效果理想的引物，需要在軟件篩選的基礎(chǔ)上加上自己對(duì)其的判斷。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則篩選適合引物后，將引物復(fù)制至NCBI網(wǎng)站的BLAST中對(duì)其特異性進(jìn)行再次評(píng)估，若特異性良好，則可將引物序列送至公司制作合成。得到合成引物與探針，需要用已知的對(duì)應(yīng)擴(kuò)增序列作為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，檢測(cè)其是否可擴(kuò)增相應(yīng)的序列[3]。2.2.1引物設(shè)計(jì)原則上下引物的選取需要相對(duì)保守，以便可擴(kuò)增出所需要的基因片段。上下引物的長(zhǎng)度一般比較短，Tm值一般在50℃~60℃之間，并且引物之間的Tm值盡量接近，最好一致。注意G和C在引物序列中的占比（一般在30%~80%），應(yīng)避免大量相同堿基連續(xù)重復(fù)出現(xiàn)。注意避免引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。注意其是否有回文結(jié)構(gòu)。引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)無(wú)非特異性擴(kuò)增和明顯引物的二聚體出現(xiàn)。2.2.2探針的設(shè)計(jì)原則參考引物設(shè)計(jì)原則中第1、3、4、5點(diǎn)。需在探針的5’端標(biāo)記一個(gè)熒光物質(zhì)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅物質(zhì)。探針盡量向上游的引物靠近。2.3引物探針5’端熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM進(jìn)行標(biāo)記，3’端由BHQ1熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。探針與引物由珠海輝睿生物科技有限公司進(jìn)行合成。表2-1亞洲穿山甲引物序列與探針序列引物/探針序列5’→3’ManisSp73FATCCCACTACTACACACATCAAManisSp73RAAGAGTCAGAAGATAGTTTGGCManisSp73PFAM-ACAACGAACTATGATATTCCGACCCC-BHQ13樣品處理本次實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)有3份現(xiàn)成的穿山甲DNA樣品，所以本次提取只需要提取3份樣品。DNA提取是實(shí)驗(yàn)流程的重要一環(huán)，DNA的提取效果，是否被污染等直接影響實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果。3.1材料與設(shè)備3.1.1實(shí)驗(yàn)試劑組織DNA提取試劑盒（D3396-02）購(gòu)自O(shè)MEGA公司。表3-1DNA提取試劑清單試劑數(shù)量規(guī)格EDTA0.5mol/L組織DNA提取試劑盒（D3396-02）TLBuffer

（TL緩沖液）60mlOBProteaseSolution（OB蛋白酶溶液）4×1.4mlBLBuffer（BL緩沖液）60mlHBCBuffer（HBC緩沖液）80mlDNAWashBuffer（DNA洗滌緩沖液）3×20mlElutionBuffer（洗脫液）120mlDNAMiniColumns（微型DNA收集柱）200個(gè)2mlCollectionTubes（收集管）400個(gè)無(wú)水乙醇3.1.2主要儀器表3-2DNA提取所需儀器實(shí)驗(yàn)儀器儀器型號(hào)廠家干浴鍋DryBlockHeater4IKA冷凍離心機(jī)3-18KSIGMA移液槍Research®plusEppendorf3.2實(shí)驗(yàn)步驟開(kāi)始取樣前，先打開(kāi)干浴鍋，調(diào)整溫度至70℃，并取1mlElutionBuffer放置干浴鍋中加熱到70℃預(yù)備。本次實(shí)驗(yàn)需要提取DNA樣品一共3份：穿山甲骨頭，穿山甲鱗片2號(hào)，穿山甲鱗片3號(hào)。以上3份樣品以下簡(jiǎn)稱樣品。其余樣品已經(jīng)有現(xiàn)成DNA樣品，無(wú)需重復(fù)提取。3.2.1取樣用小剪刀剪下適量樣品，放入1.5ml的離心管中。為脫鈣效果和酶解可充分作用在樣品，穿山甲骨頭盡量剪碎，兩份穿山甲鱗片樣品盡量剪薄、碎。3.2.2樣品脫鈣向樣品中加入EDTA1ml后，放入55℃干浴鍋中加熱，將其放置隔夜（≥10h）。EDTA是較為溫和的脫鈣螯合劑，對(duì)樣品組織破壞小，可維持組織中的核物質(zhì)等。但其對(duì)組織的滲透性相對(duì)較差，作用緩慢，需要長(zhǎng)時(shí)間的作用。為其脫鈣效果，樣品取樣時(shí)應(yīng)盡量將樣品處理得薄、碎，并且通過(guò)恒溫加熱作用來(lái)提高其脫鈣效果。3.2.3樣品的DNA提取將脫鈣完成的樣品離心1min，倒去上清液。向沉淀加入200μl的TLBuffer和25μl的OBProteaseSolution。加熱，置于55℃的干浴鍋中，靜置。在12000轉(zhuǎn)，4℃條件下，離心5min。取上清液，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中。加入220μlBLBuffer后，放置于調(diào)溫70℃至的干浴鍋中，恒溫加熱10min。此時(shí)：將ElutionBuffer取足量（根據(jù)樣品數(shù)量計(jì)算使用量，并預(yù)留比需要量多一些的量以防萬(wàn)一）至離心管中，同時(shí)放至70℃干浴鍋中加熱，待后續(xù)步驟使用再取出。取出，加入220μl無(wú)水乙醇。將上述混合液加入到藍(lán)色收集柱中，并將收集柱套入2ml收集管中，做好相應(yīng)標(biāo)記。離心1min，（離心條件與4.相同）。離心后，濾液將落到2ml的收集管中。取出，倒去濾液（收集管可重復(fù)使用），向收集柱中加入500μlHBCBuffer。離心30s，倒去濾液。將收集柱套入新的2ml收集管中。將700μl經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇稀釋的DNAWashBuffer加入至收集柱中。離心30s（離心條件與4.相同），倒去濾液（重復(fù)使用收集管）。重復(fù)一次步驟12~13。為干燥收集柱，倒去濾液后需再次離心2min。將藍(lán)色收集柱轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，向收集柱中加入100μl已提前預(yù)熱的ElutionBuffer。在室溫下靜置2min后，離心1min。取濾液，扔掉收集柱，將1.5ml離心管做好標(biāo)記，放至-20℃冰箱中保存[4]。由于鱗片中DNA提取率不高，則取樣時(shí)采取一式多份。為保提取DNA濃度不會(huì)過(guò)低，影響熒光PCR結(jié)果，則最后僅加入一次ElutionBuffer。4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器①主要試劑本次實(shí)驗(yàn)使用的2×SuperstarPremixplus-UNG試劑是生產(chǎn)于珠海寶銳生物科技有限公司。2×SuperstarPremixplus-UNG由：PCRBuffer、UNG、dNTPs、Mgcl2、穩(wěn)定劑、SuperstartTaqplus等物質(zhì)組成。其中，為防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中PCR的非特異性擴(kuò)增與污染，體系中加入了UNG酶，其可消除較高的U-DNA產(chǎn)物，與Taq酶一起保護(hù)整個(gè)反應(yīng)體系防止體系被污染[5]。表4-1亞洲穿山甲熒光PCR反應(yīng)體系試劑體系（25μl）2×SuperstarPremixplus-UNG12.5Primer1（10p）1Primer2（10p）1TaqManProbe1TemplateDNA5ddH2O4.5②主要儀器表4-2體系配置所需儀器實(shí)驗(yàn)儀器儀器型號(hào)廠家小型離心機(jī)S1010ESclLogex手掌型離心機(jī)LX-100海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠4.2中華穿山甲質(zhì)粒的梯度稀釋本次實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒由上海滸生物科技有限公司合成，未使用前放置在-20℃冰箱內(nèi)保存。將質(zhì)粒取出，放置室溫等待質(zhì)粒融化。期間準(zhǔn)備好1.5ml離心管9支，分別標(biāo)記：1~9號(hào)，共9個(gè)濃度。第一支離心管中加入90μlddH2O，其余管中加入450μlddH2O。質(zhì)粒充分融化后，需上下?lián)u勻，放入微型離心機(jī)中離心10s。從中抽10μl原液加入1號(hào)管中，用移液槍吹打?qū)⑵浠旌暇鶆?。再?gòu)?號(hào)管中抽取50ml溶液加入到2號(hào)管中，再次用移液槍吹打，混合均勻。重復(fù)上述步驟，完成質(zhì)粒的梯度稀釋。為防止質(zhì)粒的污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要在通風(fēng)良好的地方進(jìn)行稀釋。表4-3質(zhì)粒梯度稀釋編號(hào)原液12345678910稀釋倍數(shù)110-110-210-310-410-510-610-710-810-910-10濃度10101091081071061051041031021014.3熒光PCR的樣品檢驗(yàn)4.3.1反應(yīng)體系的配制對(duì)實(shí)驗(yàn)室穿山甲的樣品：穿山甲骨、穿山甲鱗片2號(hào)、穿山甲鱗片3號(hào)、大穿山甲、小穿山甲、穿山甲c進(jìn)行樣品檢測(cè)。利用稀釋倍數(shù)為10-6的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，加入ddH2O作為陰性對(duì)照。如下表中添加試劑進(jìn)行配制。配制時(shí)，需要注意污染。樣品需最后加入。表4-4穿山甲樣品的熒光PCR反應(yīng)體系序號(hào)樣品名稱2×SuperstarPremixplus-UNG（μl）Primer1（10p）（μl）Primer2（10p）（μl）TemplateDNA（μl）TaqManProbe（μl）ddH2O（μl）1穿山甲骨12.511114.52穿山甲鱗片2號(hào)12.511114.53穿山甲鱗片3號(hào)12.511114.54大穿山甲12.511114.55小穿山甲12.511114.56穿山甲c12.511114.5陰性10-612.511114.5陽(yáng)性ddH2O12.511114.54.4熒光PCR的特異性測(cè)試穿山甲屬于哺乳動(dòng)物綱鱗甲目，由于其物種分類的特殊性，鱗甲目?jī)H有穿山甲一科的物種，則選取同屬哺乳動(dòng)物的樣品作為特異性測(cè)試的對(duì)照模板。本次選用對(duì)照樣品為：兔子、鼠、牦牛、豬、鹿、羊共6組。所有對(duì)照樣品為實(shí)驗(yàn)室作為陽(yáng)性對(duì)照的DNA。表4-5特異性實(shí)驗(yàn)熒光PCR反應(yīng)體系序號(hào)樣品名稱2×SuperstarPremixplus-UNG（μl）Primer1（10p）（μl）Primer2（10p）（μl）TemplateDNA（μl）TaqManProbe（μl）ddH2O（μl）1穿山甲骨12.511114.52穿山甲鱗片2號(hào)12.511114.53穿山甲鱗片3號(hào)12.511114.54大穿山甲12.511114.55小穿山甲12.511114.56穿山甲c12.511114.5陰性10-612.511114.5陽(yáng)性ddH2O12.511114.57兔子12.511114.58鼠12.511114.59豬12.511114.510牦牛12.511114.511羊12.511114.512鹿茸12.511114.54.5熒光PCR的靈敏度測(cè)試①7個(gè)梯度濃度靈敏度測(cè)試本次采用：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共7組梯度濃度的質(zhì)粒作為測(cè)試靈敏度的模板，每個(gè)濃度做3個(gè)平行測(cè)試來(lái)探究其靈敏度。②5個(gè)梯度濃度靈敏度測(cè)試由①得為10-4~10-7的擴(kuò)增效果明顯，相對(duì)靈敏，則為進(jìn)一步確認(rèn)其靈敏度，取濃度為10-6~10-10共5個(gè)濃度梯度再次測(cè)試其靈敏度。本次實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度梯度做5個(gè)平行，增加可信度[6]。表4-6靈敏度實(shí)驗(yàn)熒光PCR反應(yīng)體系序號(hào)樣品名稱2×SuperstarPremixplus-UNG（μl）Primer1（10p）（μl）Primer2（10p）（μl）TemplateDNA（μl）TaqManProbe（μl）ddH2O（μl）110-412.511114.5210-512.511114.5310-612.511114.5410-712.511114.5510-812.511114.5610-912.511114.5710-1012.511114.54.4重復(fù)性反應(yīng)體系體系配制見(jiàn)表4-4。將穿山甲的6組樣品重復(fù)做平行測(cè)試，所得的ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)的計(jì)算，利用此數(shù)值來(lái)評(píng)價(jià)體系的穩(wěn)定與重復(fù)性的優(yōu)劣。5熒光定量PCR上機(jī)實(shí)驗(yàn)5.1實(shí)驗(yàn)儀器表5-1Real-Time熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器儀器型號(hào)廠家熒光定量PCR儀QuantStudio7Flex美國(guó)ABI5.2熒光PCR的反應(yīng)條件參數(shù)設(shè)定根據(jù)所使用的體系說(shuō)明書(shū)、引物的各項(xiàng)參數(shù)以及第一次試運(yùn)行時(shí)所得結(jié)果綜合考量，對(duì)反應(yīng)條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得以下反應(yīng)條件：表5-2反應(yīng)條件參數(shù)循環(huán)溫度℃時(shí)間502min955min5cycles9515s5030s7230s40cycles9515s5530s5.3上機(jī)步驟先將電腦打開(kāi)，等待其開(kāi)機(jī)完畢后，再將熒光定量PCR儀與程序打開(kāi)。點(diǎn)擊PCR儀器面板右下方的按鈕，以彈出樣品放置抽屜。將樣品放進(jìn)儀器中，明確樣品擺放位置，以方便在操作頁(yè)面標(biāo)記樣品位置。完成放置后將抽屜關(guān)閉。在電腦操作頁(yè)面中填好文件名，檢查實(shí)驗(yàn)類型、試劑類型等基本參數(shù)選擇正確。“TargerName”設(shè)定為Mains，“SampleName”中需根據(jù)樣品放置位置，在相應(yīng)孔位編輯樣品名稱。本次實(shí)驗(yàn)試劑不包含“ROX”，需改選為“None”設(shè)定程序（根據(jù)表XX），設(shè)定于最后55℃時(shí)收集熒光信號(hào)。運(yùn)行前保存本次所有設(shè)定，設(shè)為模板Manis，為之后使用節(jié)省一定時(shí)間保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，點(diǎn)擊左上方“Save”保存文件。點(diǎn)擊“StartRUN”開(kāi)始運(yùn)行運(yùn)行結(jié)束根據(jù)需要保存數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，使用完畢的樣品需要用密封袋密封后丟棄，并依次關(guān)閉儀器與電腦電源。6實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析6.1熒光PCR的樣品檢驗(yàn)如圖，熒光定量PCR擴(kuò)增后，6組樣品與陰性都出現(xiàn)了較為明顯的“S”型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照則沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，熒光信號(hào)值幾乎沒(méi)有變化。因樣品：大穿山甲，小穿山甲，穿山甲c是實(shí)驗(yàn)室原有DNA樣品，已經(jīng)確定為穿山甲DNA樣品。所以本次實(shí)驗(yàn)使用同一套引物與探針，并在同一體系、同一反應(yīng)參數(shù)下，6組樣品皆有明顯的“S”型擴(kuò)增曲線，這表明樣品：穿山甲骨、穿山甲鱗片2號(hào)與穿山甲鱗片3號(hào)在DNA提取步驟正確，切DNA提取正確。其中陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增曲線，表明整個(gè)操作流程，包括體系的配制、加樣、上機(jī)等操作都無(wú)明顯操作失誤導(dǎo)致體系或樣品被污染。注：圖中2為：穿山甲鱗片2號(hào)；3為：穿山甲鱗片3號(hào)；N為：陰性對(duì)照；P為：陽(yáng)性對(duì)照；c為：穿山甲c；da為：大穿山甲；gu為：穿山甲骨；xiao為：小穿山甲圖6-1熒光PCR樣品檢測(cè)結(jié)果6.2靈敏度測(cè)試結(jié)果①7個(gè)梯度靈敏度測(cè)試本次實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒梯度濃度進(jìn)行測(cè)試，共7組，每一梯度做3組平行。由圖像可觀察到，前4個(gè)梯度濃度擴(kuò)增性良好，出現(xiàn)清晰的“S”型曲線圖，到稀釋10-8時(shí)，圖像有些擴(kuò)散，稀釋至10-9與10-10時(shí)，3組平行中僅僅只能擴(kuò)增得出一條曲線。圖6-2熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果①表6-1熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果表①稀釋倍數(shù)平行（組）得到擴(kuò)增曲線條數(shù)（陽(yáng)性數(shù)量）陽(yáng)性占比（%）10-43310010-5310010-6310010-7310010-8310010-9133.3310-10133.33②5個(gè)梯度濃度靈敏度測(cè)試為進(jìn)一步確認(rèn)其靈敏度，取濃度為10-6~10-10共5個(gè)濃度梯度再次測(cè)試其靈敏度。由圖像得，依然是從稀釋倍數(shù)10-8開(kāi)始“S”曲線有擴(kuò)散的傾向，但仍然全部都有擴(kuò)增曲線。稀釋至10-9時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)部分有擴(kuò)增曲線，有些沒(méi)有擴(kuò)增成功。稀釋倍數(shù)為10-10的質(zhì)粒在本次實(shí)驗(yàn)完全沒(méi)有熒光信號(hào)，即沒(méi)有擴(kuò)增。圖6-3熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果②表6-2熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果②稀釋倍數(shù)平行（組）得到擴(kuò)增曲線條數(shù)（陽(yáng)性數(shù)量）陽(yáng)性占比（%）10-65510010-7510010-8510010-924010-1000兩次靈敏度檢測(cè)結(jié)果都在濃度為10時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的現(xiàn)象，即本體系測(cè)試的靈敏度到稀釋倍數(shù)為10-8時(shí)開(kāi)始接近其檢測(cè)極限，往后的濃度降低，檢測(cè)結(jié)果也越不穩(wěn)定。但相比起普通PCR檢測(cè)方法，熒光PCR靈敏度顯現(xiàn)出更加優(yōu)秀的優(yōu)點(diǎn)。一般，普通PCR僅僅能檢測(cè)到稀釋倍數(shù)到10-4的樣品，而熒光PCR普遍能做到檢測(cè)到稀釋倍數(shù)為10--8的樣品，普通PCR的靈敏度僅僅只是熒光PCR的一半[7]。6.3熒光PCR特異性的驗(yàn)證本組實(shí)驗(yàn)采用6份穿山甲DNA樣品、陽(yáng)性與兔、鼠、豬、羊、牦牛、鹿共6組的DNA實(shí)驗(yàn)室樣品作為對(duì)照。如圖6-4可見(jiàn)，以6份穿山甲DNA為模板時(shí)，都出現(xiàn)了“S”型曲線，表明監(jiān)測(cè)到其出現(xiàn)熒光信號(hào)的累積，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。而非穿山甲的另外6份樣品中，熒光信號(hào)始終沒(méi)有變化，表示沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增。圖6-4熒光PCR特異性如圖6-5，圖6-6，圖6-7，非穿山甲DNA樣品的6組設(shè)計(jì)2組平行試驗(yàn)與圖6-4中非特異性樣品擴(kuò)增結(jié)果比對(duì)，全部都沒(méi)有出現(xiàn)熒光信號(hào)堆積的現(xiàn)象，即表明，此次試驗(yàn)所用的穿山甲引物與探針僅與穿山甲源性的樣品有特異性結(jié)合，僅擴(kuò)增穿山甲的DNA。引物無(wú)法與除穿山甲以外的物種DNA有特異性結(jié)合。3組擴(kuò)增結(jié)果熒光定量PCR的特異性相對(duì)良好。圖6-5非特異性樣品對(duì)照組圖6-6非特異性樣品平行1組圖6-7非特異性樣品平行2組6.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果與分析選取3組穿山甲DNA樣品為模板：穿山甲鱗片2號(hào)、穿山甲鱗片3號(hào)、穿山甲C、陽(yáng)性（稀釋倍數(shù)為10-6）、陰性共5組進(jìn)行組間與組內(nèi)的對(duì)比估算其重復(fù)性。通過(guò)所得的CT值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)估與測(cè)試[8]。①組間對(duì)比圖像圖6-8重復(fù)性試驗(yàn)第一組實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像圖6-9重復(fù)性試驗(yàn)第二組實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像圖6-10重復(fù)性試驗(yàn)第三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像②組內(nèi)對(duì)比圖像圖6-8組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果：表6-3重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)模板名稱CT值平均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)（%）組間225.03825.350102740.3357994041.324647111225.706225.306320.23719.928821560.2785219551.397583668319.856319.694c16.01816.404797870.342968532.090659897c16.523c16.673P26.56726.196546550.6729295252.568771894P25.420P26.603組內(nèi)227.17426.855975470.4414609841.643809159226.352227.042321.52021.231990810.2762679141.301187045320.969321.207c17.45917.325460430.1314040250.758444633c17.196c17.321P27.57126.855975470.4446906041.65583486P25.706P25.306組間+組內(nèi)226.103039110.8963009633.433703484320.580406190.7556681843.671784596c16.865129150.5551969363.291981528P26.634840970.7005397492.630163064由數(shù)據(jù)可得，組間對(duì)比時(shí)，變異系數(shù)范圍在：1.32%~2.57%；組內(nèi)對(duì)比時(shí)，變異系數(shù)在0.76%~1.66%之間；一共每一樣品共進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，變異系數(shù)在2.63%~3.67%之間。以上變異系數(shù)都小于5%，即所進(jìn)行的熒光PCR檢測(cè)對(duì)于穿山甲源的檢測(cè)具有相對(duì)較理想的重復(fù)性，其結(jié)果都相對(duì)穩(wěn)定。

7總結(jié)本實(shí)驗(yàn)以6組不同的穿山甲DNA為模板，以6組不同的哺乳動(dòng)物作為非特異性的對(duì)照組，先對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，利用梯度稀釋的質(zhì)粒對(duì)熒光PCR進(jìn)行靈敏度的測(cè)試，選取梯度稀釋倍數(shù)為10-6作為每一次實(shí)驗(yàn)中所需要的陽(yáng)性。最后選取3組穿山甲樣品作為重復(fù)性試驗(yàn)的樣品，連同陽(yáng)性與陰性共做了6次平行。有3組穿山甲樣品需要進(jìn)行DNA的提取，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明DNA的提取效果可觀。在實(shí)驗(yàn)室樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，6組樣品皆出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，并且其CT值在正常范圍之內(nèi)。說(shuō)明該引物與反應(yīng)參數(shù)的設(shè)定合理。在特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，該引物對(duì)穿山甲有良好特異性，平行組的3組非特異性樣品都沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，且6組穿山甲DNA為模板的體系中則都出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，結(jié)果表明，熒光PCR的特異性相對(duì)理想。在靈敏度試驗(yàn)中，對(duì)質(zhì)粒梯度稀釋，進(jìn)行兩組的檢測(cè)，每組都設(shè)有平行試驗(yàn)以增加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度。第一組試驗(yàn)是檢測(cè)稀釋倍數(shù)10-4~10-10，每個(gè)樣設(shè)有3個(gè)平行試驗(yàn)