elisa技術在食品安全檢測與分析中的應用

elisa技術在食品安全檢測與分析中的應用

食品是人類生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎，而食品安全問題是人類健康和經(jīng)濟生活的一個重要問題。作為WTO的新成員,我國與世界各國間的貿(mào)易往來日益增加,食品安全已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)競爭力的關鍵因素,并在某種程度上制約了我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構和食品工業(yè)的戰(zhàn)略性調(diào)整。目前,全球食品安全形勢不容樂觀,主要表現(xiàn)為食源性疾病、惡性食品污染不斷上升和部分食品生產(chǎn)加工新技術與新工藝帶來新的危害。其中有的病例不多,但病死率高、社會影響大,如豬肉中的瘦肉精(鹽酸克倫特羅)殘留;有的引起眾多消費者急性發(fā)病乃至死亡,如腸出血性大腸桿菌O157:H7食物中毒;也有化學污染物造成廣泛的食品污染,對人體健康具有長期和嚴重的潛在健康危害,如二噁英、農(nóng)藥和獸藥殘留的污染等。對于目前一些公認的重要食源性危害(如:農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、抗生素殘留、重要有機物污染、生物毒素、食品添加劑和人獸共患疾病病原體等),在檢測技術方面,不少尚屬空白或不能夠完善,不能滿足食品安全控制的需要。因此,隨著經(jīng)濟的發(fā)展,大多數(shù)國家開始對食品的安全性問題提出更高的要求,檢測技術日益趨向于高技術化、系列化、速測化、便攜化和易商品化發(fā)展。即便是在各種新型檢測技術不斷涌現(xiàn)的今天,運用免疫學和生物工程技術所建立的酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)技術,即ELISA,因其操作程序的規(guī)范化、簡單化和檢測的高靈敏性,仍然表現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢并在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、重要有機物污染、生物毒素、食品添加劑和人獸共患疾病病原體的快速檢測和分析等食品安全性檢測領域中有著廣泛的發(fā)展前景。1elisa的生物檢測技術ELISA技術自本世紀70年代出現(xiàn)開始,就因其高度的準確性、特異性、適用范圍寬、檢測速度快以及費用低等優(yōu)點,而在臨床和生物疾病診斷與控制等領域中倍受重視,成為檢驗中最為廣泛應用的方法之一。特別是隨著蛋白質(zhì)分離純化技術和基因工程技術的不斷發(fā)展,各種高純度抗體、抗原和抗體復合物得以制備,單克隆抗體技術的應用,使得該診斷檢測技術在特異性、靈敏度和客觀性方面都有了大幅度的提高,并且在自動化免疫技術的推進之下進一步具有了精確的定量分析能力。由于ELISA的技術條件要求低、攜帶方便、常以試劑盒的形式出現(xiàn)且易商品化、操作簡便和經(jīng)濟實惠,它已成為一種應用最為廣泛和發(fā)展最為成熟的生物檢測與分析技術。ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。根據(jù)酶反應底物顯色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應的結果,使測定具有極高的靈敏度[1~4]。在應用中一般采用商品化的試劑盒進行測定,其特點是將抗原或抗體制成固相制劑,在與標本中抗體或抗原反應后,只需經(jīng)過固相的洗滌,就可以達到抗原抗體復合物與其他物質(zhì)的分離,簡化了操作步驟。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:(1)包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);(2)酶標記的抗原或抗體;(3)酶的底物;(4)陰性和陽性對照品(定性測定),參考標準品和控制血清(定量測定);(5)結合物及標本的稀釋液;(6)洗滌液;(7)酶反應終止液。結合物為酶標記的抗體(或抗原),是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物既保持了酶的催化活性,也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。在ELISA中,常用的酶為辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中,應用的酶有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶(AP)作為標記酶。酶標記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化兩種方法。酶結合物一般需經(jīng)離子交換層析或分子篩分離純化。隨著ELISA在生物檢測分析領域的廣泛應用,根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,逐漸演變出了幾種不同類型的檢測方法:(1)雙抗體夾心法測抗原或抗體;(2)間接法測抗體;(3)雙位點一步法;(4)競爭法;(5)捕獲法測IgM抗體;(6)ABS(avidinbiotinsystem)-ELISA法;(7)PCR-ELISA法;(8)斑點免疫酶結合試驗(DIA)等。2定量分析復雜過程抗體抗原反應所特有的專一性和敏感性,使得食品在未經(jīng)分離提取的情況下,即可進行定量定性分析,而一般的化學分析都必須經(jīng)過分離提取等復雜過程。近年來,該項技術在食品安全性檢測中正逐步得以推廣應用,如天然毒性物、農(nóng)藥殘留、微生物污染、食品成分和偽劣食品等方面的檢測分析。2.1黃曲霉素aat真菌毒素(mycotoxin)是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,其中的十幾種對人類危害較大,它們一般同時具有毒性強和污染頻率高的特點。其中毒性最大、致癌能力最強的是黃曲霉毒素(AFT)。它在自然界中分布十分廣泛,黃曲霉常常和其他多種微生物在一起,生長在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。自1977年抗黃曲霉素B1的單克隆問世,至今,幾乎所有重要真菌毒素(如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等)的ELISA檢測方法均已建立。在對黃曲霉素B1的檢測中,其檢測AFTB1的線性范圍0.25~5.0ng/ml,靈敏度為12.5Pg,整個測定過程僅為4h。另外該方法也正在被廣泛地應用于各種藻類和貝類毒素的檢測。2.2g/ml計算ELISA已成為許多國際權威分析機構(如AOAC)分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止,應用ELISA檢測食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA檢出下限為0.07μg/ml。其它殘留農(nóng)藥(Metolsulan,Fluroxypyr,Triclopyr和Benalaxyl等)的檢測結果均與色譜法測定的結果一致。從目前來看,盡管ELISA檢測限度還不能完全達到國外發(fā)達國家技術法規(guī)和限量標準的要求,而且抗體制備不易和不能同時完成多種農(nóng)藥殘留檢測等缺點,但是由于該技術具有樣本前處理簡單,純化步驟少,大量樣本分析時間短,適合于做成試劑盒現(xiàn)場篩選等優(yōu)點,使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)、蔬菜批發(fā)市場和海關配備,工商人員可隨身攜帶或建立固定的農(nóng)藥殘留速測點,隨時把殘毒超標的蔬菜、水果杜絕在食用之前。2.3沙門氏菌檢測結果準確可靠食品中的有害細菌數(shù)量達到一定數(shù)目,食用后會引起各種疾病。為了有效地控制其傳播,就必須有快速和可靠的檢測方法。目前有許多種方法,其中通過制備單克隆抗體分析食品中細菌的ELISA技術研究最多,檢測結果準確可靠。例如對沙門氏菌最低檢測量可達500CFU/g,僅需22h,比常規(guī)方法縮短了3~4d,與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應。此外以ELISA技術為基礎的全自動沙門氏菌檢測系統(tǒng),實現(xiàn)了整個過程的自動化,全程耗時僅為45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內(nèi)面,可以從前增菌液中吸附被檢的沙門氏菌,對于該系統(tǒng)來說,需要做的只是加樣。在對李斯特氏菌的快速檢測中,利用三株針對單核細胞增生李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗,以夾心ELISA法,在48h內(nèi),可從人工模擬肉中檢測下限為5CFU/g樣品。2.4elisa法檢測肉品中的免疫活性ELISA在肉類食品品質(zhì)檢測中的應用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測兩個方面。腸道疾病的爆發(fā)和動物性食品有很大關系,而肉食品加熱煮制不當是引起該疾病爆發(fā)的一個主要原因。在加熱過程中一些成分的含量會降低,而一些產(chǎn)物的濃度會提高。當用蛋白質(zhì)做指示劑時,可制備抗體,這種抗體對單一蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有專一性,這樣它就可以指示蛋白質(zhì)在加熱過程中變化。因而ELISA作為商業(yè)上快速判定分析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對乳酸脫氫酶(LDH)的免疫檢測。其次是對摻入異種肉的檢測,利用多克隆抗體對血清白蛋白的ELISA法,對鮮肉進行摻假檢測。幾種以單克隆抗體為基礎的ELISA反應已得到應用。它們可以檢測出1%~2%的摻假率。目前在商業(yè)上,ELISA已可以檢測十多種動物肉,該方法已為USDA(UnitedStateDepartmentofAgriculture)使用。同時,ELISA技術也可以利用對熱穩(wěn)定的肌肉抗原來檢測加熱處理后的肉摻假情況。目前,該技術可以檢測6種家畜熟肉制品,但是在部分肉類之間存在交叉反應,如豬肉同羊肉和鹿肉、雞肉與火雞肉。2.5實際檢測生產(chǎn)中的應用利用ELISA技術測定動物性食品中有害殘留成分只是近幾年的事。隨著研究的深入,由原樣品的復雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過程,加速了其在實際檢測中的應用。特別是對豬肉、禽肉和水產(chǎn)品中重要禁用獸藥殘留(激素和興奮劑)的檢測。如瘦肉精酶聯(lián)免疫檢測法,基于抗原抗體反應進行競爭性抑制測定,不僅可作為一個定性篩選過程,也可以進一步進行定量測定。檢測靈敏度可達到0.5×10-9,完全達到我國農(nóng)業(yè)部目前的l×10-9監(jiān)督檢測標準。酶聯(lián)免疫法作為克倫特羅殘留量的篩選方法具有操作簡便、準確快速的特點,適用于大量樣品的測定,并可能成為國家標準檢測方法。2.6elisa法檢測bse的蛋白表達海綿狀病毒(BSE)是牛的一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,它與人群發(fā)生變異型克雅氏病(VCJD)有關。對于該病病原,普遍認為是由一種蛋白質(zhì)性的感染顆粒也稱朊蛋白,是一種病理性細胞朊蛋白(PRPSC),由正常的細胞朊蛋白(PRPC)轉(zhuǎn)變而來。蛋白酶核心位點的抗體應用于檢測正常及BSE動物腦組織PRPC的含量,對于天然組織,兩組差異很小,但經(jīng)加熱及異硫氰酸胍處理后,ELISA可將牛腦勻漿物中BSE特異性的PrPSc與PrPc區(qū)分開來,無明顯臨床癥狀的BSE感染動物可被檢出,經(jīng)對朊蛋白Western印跡法檢測牛及羊朊病毒蛋白的靈敏度、特異性及可靠性進行分析,證明該方法是有效的。此外,在禽流感病毒檢測方面,我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應用,建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術,已形成試劑盒生產(chǎn)能力。2.7金屬硫蛋白hg金屬硫蛋白遍存于自然界,細菌、植物、動物以及人類機體中,是一類對重金屬離子有很強親和力含豐富的半胱氨酸(約1/3),不含芳香族氨酸和組氨基酸的低分子量蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白含有大量的巰基(-SH),能與Hg、Cd、Cu、Ag等重金屬離子結合掩蔽金屬的毒性,對細胞內(nèi)的金屬離子有重要的解毒作用。生物細胞,在環(huán)境受重金屬污染(Cu、Hg、Cd、Pb、Zn與金屬離子)的情況下,可被誘導合成出大量的金屬硫蛋白,且在一定范圍內(nèi)成正比,是一項對金屬污染具特異性的指標。用純化的金屬硫蛋白對兔進行免疫,兔抗血清純化后并標記辣根過氧化酶,可實現(xiàn)對食品中重金屬污染的超微量檢測。2.8食品的生物活性測定ELISA技術同時可以用于食品中其它成分的檢測,如:(1)檢測某些特定的轉(zhuǎn)移基因表達蛋白,以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分;(2)食品中營養(yǎng)素的測定,最小檢出限可達0.05ng/g;(3)通過合成不同異黃酮的羥酸半抗原,分析植物中含量很低的雌激素;(4)也可用于檢測食品加工過程中的酶(磷酸丙糖異構酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)含量的變化等。3食品安全性檢測技術的必要性隨著科學的發(fā)展與社會的進步,食品安全性問題越來越多地危害著人類的生活與生產(chǎn)。尋求能滿足以下幾個方面特點的食品快速檢測與分析方法已成為食品安全性監(jiān)測的新課題:(1)高靈敏度,可達到10億萬分之一,甚至更低;(2)高特異性;(3)寬適用范圍,可測定各類食品;(4)低檢測的費用;(5)易商品化。這些問題的解決無疑是食品安全與衛(wèi)生事業(yè)的一次新革命。目前用于食品安全性檢測的方法有很多[14~17],多為ELISA檢測技術(ELISA檢測技術對試劑的選擇性高,很難同時分析多種成分;對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應;分析低分子量或不穩(wěn)定的化合物有一定的困難等缺陷)、微生物學方法(Microbialassay:很難篩選到對同類抗生素的不同藥敏性的特異菌株,且只能定性不能準確定量,易受其他抗菌藥物的影響)、薄層色譜法(TLC:必須進行較為復雜的樣品預處理和抽提,不能定量,靈敏度低)、氣相色譜法和高效液相色譜法(GC&HPLC:需復雜的樣品預處理,設備昂貴、檢測費用高,難以推廣使用)、PCR技術和核酸探針技術(在實驗過程中易受到污染)等。這些方法雖各有其缺點和局限性,相比之下,在實際應用中只有ELISA檢測技術才能在最大程度上同時滿足食品安全性監(jiān)測課題中所要求的上述五個必要條件。所以說,在食品衛(wèi)生監(jiān)測領域中ELISA檢測技術泛必將成為引起世界各國的廣泛重視和深入研究的食品快速檢測與分析方法之一。4elisa在食品監(jiān)測領域的應用基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展,為生物酶標分析技術提供了新的技術思路和模式,彌補了其在實際應用中存在的一些缺陷和技術局限性,使其具有更為廣泛的檢測范圍、更高靈敏度與特異性和更精確的定量能力,從而使ELISA技術以新的姿態(tài)出現(xiàn)在食品監(jiān)測領域中。系列化、標準化、商品化和多功能化的新型ELISA試劑盒產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)。結合近幾年該免疫測定技術的研究動向?qū)ζ浒l(fā)展趨勢提出幾點個人看法。4.1elisa檢測通過基因工程技術可以快速、批量地生產(chǎn)出具有高度免疫原性的重組抗原,用來替代某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì),進一步地擴大了ELISA檢測分析范圍