elisa技術(shù)在食品安全檢測(cè)與分析中的應(yīng)用

elisa技術(shù)在食品安全檢測(cè)與分析中的應(yīng)用

食品是人類生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，而食品安全問題是人類健康和經(jīng)濟(jì)生活的一個(gè)重要問題。作為WTO的新成員,我國(guó)與世界各國(guó)間的貿(mào)易往來日益增加,食品安全已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵因素,并在某種程度上制約了我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和食品工業(yè)的戰(zhàn)略性調(diào)整。目前,全球食品安全形勢(shì)不容樂觀,主要表現(xiàn)為食源性疾病、惡性食品污染不斷上升和部分食品生產(chǎn)加工新技術(shù)與新工藝帶來新的危害。其中有的病例不多,但病死率高、社會(huì)影響大,如豬肉中的瘦肉精(鹽酸克倫特羅)殘留;有的引起眾多消費(fèi)者急性發(fā)病乃至死亡,如腸出血性大腸桿菌O157:H7食物中毒;也有化學(xué)污染物造成廣泛的食品污染,對(duì)人體健康具有長(zhǎng)期和嚴(yán)重的潛在健康危害,如二噁英、農(nóng)藥和獸藥殘留的污染等。對(duì)于目前一些公認(rèn)的重要食源性危害(如:農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、抗生素殘留、重要有機(jī)物污染、生物毒素、食品添加劑和人獸共患疾病病原體等),在檢測(cè)技術(shù)方面,不少尚屬空白或不能夠完善,不能滿足食品安全控制的需要。因此,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,大多數(shù)國(guó)家開始對(duì)食品的安全性問題提出更高的要求,檢測(cè)技術(shù)日益趨向于高技術(shù)化、系列化、速測(cè)化、便攜化和易商品化發(fā)展。即便是在各種新型檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)的今天,運(yùn)用免疫學(xué)和生物工程技術(shù)所建立的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)技術(shù),即ELISA,因其操作程序的規(guī)范化、簡(jiǎn)單化和檢測(cè)的高靈敏性,仍然表現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)并在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、重要有機(jī)物污染、生物毒素、食品添加劑和人獸共患疾病病原體的快速檢測(cè)和分析等食品安全性檢測(cè)領(lǐng)域中有著廣泛的發(fā)展前景。1elisa的生物檢測(cè)技術(shù)ELISA技術(shù)自本世紀(jì)70年代出現(xiàn)開始,就因其高度的準(zhǔn)確性、特異性、適用范圍寬、檢測(cè)速度快以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn),而在臨床和生物疾病診斷與控制等領(lǐng)域中倍受重視,成為檢驗(yàn)中最為廣泛應(yīng)用的方法之一。特別是隨著蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,各種高純度抗體、抗原和抗體復(fù)合物得以制備,單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用,使得該診斷檢測(cè)技術(shù)在特異性、靈敏度和客觀性方面都有了大幅度的提高,并且在自動(dòng)化免疫技術(shù)的推進(jìn)之下進(jìn)一步具有了精確的定量分析能力。由于ELISA的技術(shù)條件要求低、攜帶方便、常以試劑盒的形式出現(xiàn)且易商品化、操作簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,它已成為一種應(yīng)用最為廣泛和發(fā)展最為成熟的生物檢測(cè)與分析技術(shù)。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。根據(jù)酶反應(yīng)底物顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測(cè)定具有極高的靈敏度[1~4]。在應(yīng)用中一般采用商品化的試劑盒進(jìn)行測(cè)定,其特點(diǎn)是將抗原或抗體制成固相制劑,在與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)后,只需經(jīng)過固相的洗滌,就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離,簡(jiǎn)化了操作步驟。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:(1)包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體;(3)酶的底物;(4)陰性和陽性對(duì)照品(定性測(cè)定),參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清(定量測(cè)定);(5)結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液;(6)洗滌液;(7)酶反應(yīng)終止液。結(jié)合物為酶標(biāo)記的抗體(或抗原),是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物既保持了酶的催化活性,也保持了抗體(或抗原)的免疫活性。在ELISA中,常用的酶為辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中,應(yīng)用的酶有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國(guó)產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。國(guó)外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶(AP)作為標(biāo)記酶。酶標(biāo)記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化兩種方法。酶結(jié)合物一般需經(jīng)離子交換層析或分子篩分離純化。隨著ELISA在生物檢測(cè)分析領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件,逐漸演變出了幾種不同類型的檢測(cè)方法:(1)雙抗體夾心法測(cè)抗原或抗體;(2)間接法測(cè)抗體;(3)雙位點(diǎn)一步法;(4)競(jìng)爭(zhēng)法;(5)捕獲法測(cè)IgM抗體;(6)ABS(avidinbiotinsystem)-ELISA法;(7)PCR-ELISA法;(8)斑點(diǎn)免疫酶結(jié)合試驗(yàn)(DIA)等。2定量分析復(fù)雜過程抗體抗原反應(yīng)所特有的專一性和敏感性,使得食品在未經(jīng)分離提取的情況下,即可進(jìn)行定量定性分析,而一般的化學(xué)分析都必須經(jīng)過分離提取等復(fù)雜過程。近年來,該項(xiàng)技術(shù)在食品安全性檢測(cè)中正逐步得以推廣應(yīng)用,如天然毒性物、農(nóng)藥殘留、微生物污染、食品成分和偽劣食品等方面的檢測(cè)分析。2.1黃曲霉素aat真菌毒素(mycotoxin)是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其中的十幾種對(duì)人類危害較大,它們一般同時(shí)具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)。其中毒性最大、致癌能力最強(qiáng)的是黃曲霉毒素(AFT)。它在自然界中分布十分廣泛,黃曲霉常常和其他多種微生物在一起,生長(zhǎng)在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。自1977年抗黃曲霉素B1的單克隆問世,至今,幾乎所有重要真菌毒素(如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等)的ELISA檢測(cè)方法均已建立。在對(duì)黃曲霉素B1的檢測(cè)中,其檢測(cè)AFTB1的線性范圍0.25~5.0ng/ml,靈敏度為12.5Pg,整個(gè)測(cè)定過程僅為4h。另外該方法也正在被廣泛地應(yīng)用于各種藻類和貝類毒素的檢測(cè)。2.2g/ml計(jì)算ELISA已成為許多國(guó)際權(quán)威分析機(jī)構(gòu)(如AOAC)分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止,應(yīng)用ELISA檢測(cè)食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA檢出下限為0.07μg/ml。其它殘留農(nóng)藥(Metolsulan,Fluroxypyr,Triclopyr和Benalaxyl等)的檢測(cè)結(jié)果均與色譜法測(cè)定的結(jié)果一致。從目前來看,盡管ELISA檢測(cè)限度還不能完全達(dá)到國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家技術(shù)法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)的要求,而且抗體制備不易和不能同時(shí)完成多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)等缺點(diǎn),但是由于該技術(shù)具有樣本前處理簡(jiǎn)單,純化步驟少,大量樣本分析時(shí)間短,適合于做成試劑盒現(xiàn)場(chǎng)篩選等優(yōu)點(diǎn),使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)、蔬菜批發(fā)市場(chǎng)和海關(guān)配備,工商人員可隨身攜帶或建立固定的農(nóng)藥殘留速測(cè)點(diǎn),隨時(shí)把殘毒超標(biāo)的蔬菜、水果杜絕在食用之前。2.3沙門氏菌檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠食品中的有害細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定數(shù)目,食用后會(huì)引起各種疾病。為了有效地控制其傳播,就必須有快速和可靠的檢測(cè)方法。目前有許多種方法,其中通過制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的ELISA技術(shù)研究最多,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。例如對(duì)沙門氏菌最低檢測(cè)量可達(dá)500CFU/g,僅需22h,比常規(guī)方法縮短了3~4d,與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應(yīng)。此外以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動(dòng)沙門氏菌檢測(cè)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了整個(gè)過程的自動(dòng)化,全程耗時(shí)僅為45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內(nèi)面,可以從前增菌液中吸附被檢的沙門氏菌,對(duì)于該系統(tǒng)來說,需要做的只是加樣。在對(duì)李斯特氏菌的快速檢測(cè)中,利用三株針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗,以夾心ELISA法,在48h內(nèi),可從人工模擬肉中檢測(cè)下限為5CFU/g樣品。2.4elisa法檢測(cè)肉品中的免疫活性ELISA在肉類食品品質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測(cè)兩個(gè)方面。腸道疾病的爆發(fā)和動(dòng)物性食品有很大關(guān)系,而肉食品加熱煮制不當(dāng)是引起該疾病爆發(fā)的一個(gè)主要原因。在加熱過程中一些成分的含量會(huì)降低,而一些產(chǎn)物的濃度會(huì)提高。當(dāng)用蛋白質(zhì)做指示劑時(shí),可制備抗體,這種抗體對(duì)單一蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有專一性,這樣它就可以指示蛋白質(zhì)在加熱過程中變化。因而ELISA作為商業(yè)上快速判定分析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)的免疫檢測(cè)。其次是對(duì)摻入異種肉的檢測(cè),利用多克隆抗體對(duì)血清白蛋白的ELISA法,對(duì)鮮肉進(jìn)行摻假檢測(cè)。幾種以單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA反應(yīng)已得到應(yīng)用。它們可以檢測(cè)出1%~2%的摻假率。目前在商業(yè)上,ELISA已可以檢測(cè)十多種動(dòng)物肉,該方法已為USDA(UnitedStateDepartmentofAgriculture)使用。同時(shí),ELISA技術(shù)也可以利用對(duì)熱穩(wěn)定的肌肉抗原來檢測(cè)加熱處理后的肉摻假情況。目前,該技術(shù)可以檢測(cè)6種家畜熟肉制品,但是在部分肉類之間存在交叉反應(yīng),如豬肉同羊肉和鹿肉、雞肉與火雞肉。2.5實(shí)際檢測(cè)生產(chǎn)中的應(yīng)用利用ELISA技術(shù)測(cè)定動(dòng)物性食品中有害殘留成分只是近幾年的事。隨著研究的深入,由原樣品的復(fù)雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過程,加速了其在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。特別是對(duì)豬肉、禽肉和水產(chǎn)品中重要禁用獸藥殘留(激素和興奮劑)的檢測(cè)。如瘦肉精酶聯(lián)免疫檢測(cè)法,基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定,不僅可作為一個(gè)定性篩選過程,也可以進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定。檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.5×10-9,完全達(dá)到我國(guó)農(nóng)業(yè)部目前的l×10-9監(jiān)督檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。酶聯(lián)免疫法作為克倫特羅殘留量的篩選方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速的特點(diǎn),適用于大量樣品的測(cè)定,并可能成為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。2.6elisa法檢測(cè)bse的蛋白表達(dá)海綿狀病毒(BSE)是牛的一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,它與人群發(fā)生變異型克雅氏病(VCJD)有關(guān)。對(duì)于該病病原,普遍認(rèn)為是由一種蛋白質(zhì)性的感染顆粒也稱朊蛋白,是一種病理性細(xì)胞朊蛋白(PRPSC),由正常的細(xì)胞朊蛋白(PRPC)轉(zhuǎn)變而來。蛋白酶核心位點(diǎn)的抗體應(yīng)用于檢測(cè)正常及BSE動(dòng)物腦組織PRPC的含量,對(duì)于天然組織,兩組差異很小,但經(jīng)加熱及異硫氰酸胍處理后,ELISA可將牛腦勻漿物中BSE特異性的PrPSc與PrPc區(qū)分開來,無明顯臨床癥狀的BSE感染動(dòng)物可被檢出,經(jīng)對(duì)朊蛋白Western印跡法檢測(cè)牛及羊朊病毒蛋白的靈敏度、特異性及可靠性進(jìn)行分析,證明該方法是有效的。此外,在禽流感病毒檢測(cè)方面,我國(guó)已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用,建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù),已形成試劑盒生產(chǎn)能力。2.7金屬硫蛋白hg金屬硫蛋白遍存于自然界,細(xì)菌、植物、動(dòng)物以及人類機(jī)體中,是一類對(duì)重金屬離子有很強(qiáng)親和力含豐富的半胱氨酸(約1/3),不含芳香族氨酸和組氨基酸的低分子量蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白含有大量的巰基(-SH),能與Hg、Cd、Cu、Ag等重金屬離子結(jié)合掩蔽金屬的毒性,對(duì)細(xì)胞內(nèi)的金屬離子有重要的解毒作用。生物細(xì)胞,在環(huán)境受重金屬污染(Cu、Hg、Cd、Pb、Zn與金屬離子)的情況下,可被誘導(dǎo)合成出大量的金屬硫蛋白,且在一定范圍內(nèi)成正比,是一項(xiàng)對(duì)金屬污染具特異性的指標(biāo)。用純化的金屬硫蛋白對(duì)兔進(jìn)行免疫,兔抗血清純化后并標(biāo)記辣根過氧化酶,可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中重金屬污染的超微量檢測(cè)。2.8食品的生物活性測(cè)定ELISA技術(shù)同時(shí)可以用于食品中其它成分的檢測(cè),如:(1)檢測(cè)某些特定的轉(zhuǎn)移基因表達(dá)蛋白,以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分;(2)食品中營(yíng)養(yǎng)素的測(cè)定,最小檢出限可達(dá)0.05ng/g;(3)通過合成不同異黃酮的羥酸半抗原,分析植物中含量很低的雌激素;(4)也可用于檢測(cè)食品加工過程中的酶(磷酸丙糖異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)含量的變化等。3食品安全性檢測(cè)技術(shù)的必要性隨著科學(xué)的發(fā)展與社會(huì)的進(jìn)步,食品安全性問題越來越多地危害著人類的生活與生產(chǎn)。尋求能滿足以下幾個(gè)方面特點(diǎn)的食品快速檢測(cè)與分析方法已成為食品安全性監(jiān)測(cè)的新課題:(1)高靈敏度,可達(dá)到10億萬分之一,甚至更低;(2)高特異性;(3)寬適用范圍,可測(cè)定各類食品;(4)低檢測(cè)的費(fèi)用;(5)易商品化。這些問題的解決無疑是食品安全與衛(wèi)生事業(yè)的一次新革命。目前用于食品安全性檢測(cè)的方法有很多[14~17],多為ELISA檢測(cè)技術(shù)(ELISA檢測(cè)技術(shù)對(duì)試劑的選擇性高,很難同時(shí)分析多種成分;對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng);分析低分子量或不穩(wěn)定的化合物有一定的困難等缺陷)、微生物學(xué)方法(Microbialassay:很難篩選到對(duì)同類抗生素的不同藥敏性的特異菌株,且只能定性不能準(zhǔn)確定量,易受其他抗菌藥物的影響)、薄層色譜法(TLC:必須進(jìn)行較為復(fù)雜的樣品預(yù)處理和抽提,不能定量,靈敏度低)、氣相色譜法和高效液相色譜法(GC&HPLC:需復(fù)雜的樣品預(yù)處理,設(shè)備昂貴、檢測(cè)費(fèi)用高,難以推廣使用)、PCR技術(shù)和核酸探針技術(shù)(在實(shí)驗(yàn)過程中易受到污染)等。這些方法雖各有其缺點(diǎn)和局限性,相比之下,在實(shí)際應(yīng)用中只有ELISA檢測(cè)技術(shù)才能在最大程度上同時(shí)滿足食品安全性監(jiān)測(cè)課題中所要求的上述五個(gè)必要條件。所以說,在食品衛(wèi)生監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中ELISA檢測(cè)技術(shù)泛必將成為引起世界各國(guó)的廣泛重視和深入研究的食品快速檢測(cè)與分析方法之一。4elisa在食品監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展,為生物酶標(biāo)分析技術(shù)提供了新的技術(shù)思路和模式,彌補(bǔ)了其在實(shí)際應(yīng)用中存在的一些缺陷和技術(shù)局限性,使其具有更為廣泛的檢測(cè)范圍、更高靈敏度與特異性和更精確的定量能力,從而使ELISA技術(shù)以新的姿態(tài)出現(xiàn)在食品監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中。系列化、標(biāo)準(zhǔn)化、商品化和多功能化的新型ELISA試劑盒產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)。結(jié)合近幾年該免疫測(cè)定技術(shù)的研究動(dòng)向?qū)ζ浒l(fā)展趨勢(shì)提出幾點(diǎn)個(gè)人看法。4.1elisa檢測(cè)通過基因工程技術(shù)可以快速、批量地生產(chǎn)出具有高度免疫原性的重組抗原,用來替代某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì),進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大了ELISA檢測(cè)分析范圍