uplc法同時(shí)測(cè)定側(cè)柏炭中5種黃酮類化合物

uplc法同時(shí)測(cè)定側(cè)柏炭中5種黃酮類化合物

側(cè)柏葉是柏樹(shù)科植物的側(cè)柏（l.）franch干燥的枝和葉，味道鮮美，具有冷血止血的功效。側(cè)柏炭為其制炭炮制品,亦為中藥中傳統(tǒng)的止血藥,傳統(tǒng)止血方十灰散中重要組成藥味之一。側(cè)柏炭中所含主要成分為黃酮類化合物,目前測(cè)定指標(biāo)成分多為槲皮苷或槲皮素,均采用HPLC法。測(cè)定成分單一,不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。筆者曾采用HPLC法測(cè)定側(cè)柏炭中楊梅素、槲皮苷、槲皮素、山柰酚和穗花杉雙黃酮,但是分析時(shí)間較長(zhǎng),一次需要70min以上。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)技術(shù),建立了同時(shí)測(cè)定側(cè)柏炭中這些黃酮類化合物的方法,可在25min左右完成一次色譜分析。此方法快捷、準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,可較全面地控制側(cè)柏炭中黃酮類成分,為其質(zhì)量控制提供參考。1儀器分析結(jié)果WatersAcquity超高效液相色譜儀,配有二極管陣列(DAD)檢測(cè)器。H66025T型超聲清洗機(jī)(無(wú)錫超聲電子設(shè)備廠),Librorael—40SM電子分析天平(精確到0.01mg)。槲皮苷(批號(hào)111538-200403)、槲皮素(批號(hào)100081-200406)(中國(guó)藥品生物制品檢定所),山柰酚、穗花杉雙黃酮(上海順勃生物工程技術(shù)有限公司),楊梅素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)。甲醇(色譜純),水(高純水)。其他試劑為分析純。10批側(cè)柏葉生品均購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng),并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為柏科植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝鞘及葉,見(jiàn)表1。2方法和結(jié)果2.1側(cè)柏碳樣品的制備取側(cè)柏葉50g,溫度為280℃,炒制5min,即得。2.2混合對(duì)照品溶液分別精密稱取對(duì)照品楊梅素、槲皮苷、槲皮素和山柰酚適量,加甲醇溶解并稀釋,制成質(zhì)量濃度分別為325.60、319.20、1122.00、315.20μg/mL的混合對(duì)照品溶液。精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品適量,加DMSO溶解,再加甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度為486.80μg/mL的穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液。2.3超聲處理工藝取側(cè)柏炭粉末約3g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇50mL,超聲處理(工作頻率40kHz,功率250W)1h,濾過(guò);濾渣同法超聲處理1次,濾過(guò),合并濾液,蒸干,殘?jiān)眉状既芙?轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,即得。2.4流動(dòng)相柱溫度1.WatersBEHC18柱(50mm×2.1mm,1.7mm);流動(dòng)相為0.05%甲酸水溶液-甲醇,梯度洗脫,見(jiàn)表2;體積流量0.2mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量2μL;檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。在此色譜條件下,各成分之間分離情況良好,見(jiàn)圖1。2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸分析分別精密吸取混合對(duì)照品溶液及穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液各1mL,置于10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度。用倍比稀釋的方法以甲醇制成系列對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下,分別進(jìn)樣2μL,每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)3針,測(cè)定峰面積值。以峰面積平均值與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見(jiàn)表2。將混合對(duì)照品溶液用甲醇不斷進(jìn)行稀釋后分析,得到5個(gè)成分的LOD值(S/N≈2~3)和LOQ值(S/N≈10),結(jié)果見(jiàn)表3。2.6峰面積法測(cè)定結(jié)果取批號(hào)081110-1側(cè)柏炭粉末制備的供試品溶液,進(jìn)樣2μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別記錄峰面積,計(jì)算,結(jié)果楊梅素、槲皮苷、槲皮素、山柰酚和穗花杉雙黃酮峰面積的RSD分別為2.02%、3.15%、1.94%、1.74%、2.15%。2.7溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)081110-1側(cè)柏炭粉末制備的供試品溶液,于0、1、2、4、6、8h分別進(jìn)樣2μL,按上述色譜條件分析,分別記錄峰面積,計(jì)算,結(jié)果楊梅素、槲皮苷、槲皮素、山柰酚和穗花杉雙黃酮峰面積的RSD分別為1.23%、3.30%、2.34%、1.90%、1.83%,表明供試品溶液中5種黃酮類化合物在8h內(nèi)穩(wěn)定。2.8加樣回收率試驗(yàn)取批號(hào)081110-1的側(cè)柏炭粉末6份,每份1.5g,精密稱定,置于50mL具塞錐形瓶中,分別加入混合對(duì)照品溶液(含楊梅素325.6μg/mL、槲皮苷159.6μg/mL、槲皮素1122.0μg/mL、山柰酚157.6μg/mL、穗花杉雙黃酮486.8μg/mL)1mL,制備供試品溶液,進(jìn)樣2μL,按上述色譜條件測(cè)定,分別計(jì)算回收率。結(jié)果楊梅素、槲皮苷、槲皮素、山柰酚和穗花杉雙黃酮的平均回收率分別為98.52%、99.01%、97.87%、97.88%、96.85%,RSD分別為1.75%、3.98%、2.38%、2.29%、1.89%。2.9各進(jìn)樣測(cè)定取10批側(cè)柏炭適量,分別制備供試品溶液,各進(jìn)樣2μL,以各成分峰面積按外標(biāo)法對(duì)其中的楊梅素、槲皮苷、槲皮素、山柰酚和穗花杉雙黃酮進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。3超高效液相色譜法的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)使用DAD為檢測(cè)器,經(jīng)過(guò)比較,在360nm處所示色譜峰數(shù)目較多,分離較好,基線較平穩(wěn),因此選用360nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。中藥中化學(xué)成分復(fù)雜,往往含有結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同的多種成分?；瘜W(xué)成分研究既是基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題,也是中藥現(xiàn)代化的核心問(wèn)題。超高效液相色譜具有高分離度、高分析速度和高靈敏度,能夠