甘草黃酮合酶Ⅱ催化甘草素特異性合成74′-二羥基黃酮

甘草黃酮合酶Ⅱ催化甘草素特異性合成7，4′-二羥基黃酮黃酮類化合物是植物次級代謝產(chǎn)物的主要種類之一，包括9000多種結(jié)構(gòu)[1]，分別屬于黃酮、黃烷酮、異黃酮、查爾酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、黃烷醇、花青素以及他們的衍生物。其中黃酮是指具有2-苯基苯并γ吡喃酮分子結(jié)構(gòu)且在2號和3號碳原子之間具有碳碳雙鍵的一類化合物（圖1），因具有抗氧化[2]、抗炎、抗癌[3-5]、防治心腦血管疾病[6]、預(yù)防肥胖和糖尿病[1]、抗凝血[7]等眾多藥理作用而受到人們的廣泛關(guān)注。例如，7,4′-二羥基黃酮（DHF）（圖1）是一種存在于甘草中的黃酮化合物[8]，具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛抗炎[9]、抗氧化[10]、抗真菌[11]、抑制嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生[11]、抑制MUC5A基因表達(dá)和黏液產(chǎn)生[10]等生理和藥理活性，在臨床治療和醫(yī)療保健領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

菌株名稱基因型YeastBY4742，MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0Yeast-F01BY4742，YPRCtau3::PTDH3-Gur.gene26505-TPGK1-leu2Yeast-F02BY4742，YPRCtau3::PTDH3-Gur.gene26116-TPGK1-leu2Yeast-F03BY4742，rDNA::PTDH3-Gur.gene26505-TPGK1-KanMXYeast-F04Yeast-F04，YPRCtau3::PTDH3-Gur.gene26505-TPGK1-leu2新窗口打開|下載CSV

1.2菌株培養(yǎng)

(1)大腸桿菌培養(yǎng)：挑取重組大腸桿菌單菌落，接種到含有適宜抗生素（100mg/L氨芐青霉素）的固體培養(yǎng)基上；過夜培養(yǎng)后挑取菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證；驗(yàn)證成功后挑取菌落接種到含有適宜抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證和擴(kuò)增目的基因表達(dá)盒。

(2)釀酒酵母培養(yǎng)：挑取重組釀酒酵母單菌落，接種到含有適宜抗生素和營養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基中；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d挑取菌落裂解后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證；驗(yàn)證成功后挑取正確單菌落接種到含有適宜抗生素和營養(yǎng)缺陷型的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，按照10%比例接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，添加底物進(jìn)行催化反應(yīng)。

1.3細(xì)胞催化反應(yīng)與活性檢測

將表達(dá)目的蛋白的釀酒酵母接種至3mlYPD液體培養(yǎng)基中30℃、250r/min培養(yǎng)24h得到種子液，按照10%的接種比例接種至30mlYPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h加入終濃度為1mmol/L的底物，在30℃、250r/min的條件下反應(yīng)48h后，萃取產(chǎn)物，測定細(xì)胞干重和產(chǎn)物濃度。細(xì)胞催化活性以1g/L的細(xì)胞干重（CDW）合成的7,4′-二羥基黃酮的濃度為衡量指標(biāo)，細(xì)胞催化效率以底物甘草素轉(zhuǎn)化率為衡量指標(biāo)。

1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分子動(dòng)力學(xué)模擬

利用AlphaFold2[32]進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，AutoDockVina[33]進(jìn)行分子對接（配體結(jié)構(gòu)下載于PubChem網(wǎng)站）；利用CHARMM-GUI網(wǎng)站（https://./）進(jìn)行拓?fù)湮募臉?gòu)建，最后采用Gromacs的CHARMM36（C36）力場進(jìn)行100ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，最終系統(tǒng)處于一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)。

1.5催化工藝優(yōu)化與強(qiáng)化

(1)目的基因過表達(dá)：使用不同釀酒酵母拷貝數(shù)位點(diǎn)（單拷貝位點(diǎn)YPRCtau3，多拷貝位點(diǎn)rDNA以及兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)整合）進(jìn)行外源基因整合構(gòu)建表2所示的工程菌，分別在酵母培養(yǎng)時(shí)間為12h時(shí)添加終濃度為1mmol/L的甘草素底物，在30℃、250r/min的條件下反應(yīng)48h，考察目的基因Gur.gene26505過表達(dá)對甘草素轉(zhuǎn)化率的影響。

(2)底物添加時(shí)間優(yōu)化：分別在酵母接種后的0~84h時(shí)添加終濃度為1mmol/L的甘草素底物，在30℃、250r/min的條件下反應(yīng)48h，考察不同底物添加時(shí)間對甘草素轉(zhuǎn)化率的影響。

(3)催化時(shí)間優(yōu)化：將酵母培養(yǎng)最優(yōu)時(shí)間，添加終濃度為1mmol/L的甘草素底物，在30℃、250r/min的條件下反應(yīng)12~96h，考察不同催化時(shí)間對甘草素轉(zhuǎn)化率的影響，確定最佳催化時(shí)間。

(4)過程強(qiáng)化：在以上最佳工藝下，每隔12h分別補(bǔ)加終濃度分別為初始培養(yǎng)基濃度的酵母粉、蛋白胨、葡萄糖，考察培養(yǎng)基成分強(qiáng)化對催化過程中甘草素轉(zhuǎn)化率的影響。

1.6HPLC和LC-MS分析檢測

取1ml反應(yīng)液加入2倍體積乙酸乙酯混勻萃取，吸取1ml萃取液，蒸干，加入1ml甲醇重新溶解，用0.22μm的有機(jī)濾頭過濾到進(jìn)樣瓶中，采用Agilent1260高效液相色譜測定濃度。檢測條件：色譜柱為AgilentPoroshell120EC-C18(2.7μm，3.0×100mm)；流動(dòng)相A為0.1%(體積)的甲酸水溶液；流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫，1~20min：(20%B~100%B(體積))，20~25min：(100%B(體積))，25~26min:(100%B~20%B(體積))，26~30min：(20%B(體積))；流速為0.5ml/min；柱溫35℃；紫外吸收檢測器波長為325nm。

質(zhì)譜檢測采用島津液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS-8040），液相條件與HPLC相同，質(zhì)譜條件：霧化氣流速N23.0L/min，電噴霧離子源（ESI），加熱塊溫度400℃，Q3正離子掃描模式，m/z測定范圍100~400，測定時(shí)間0~30min，掃描速度909u/s。

2結(jié)果與分析

2.1基于轉(zhuǎn)錄組分析的甘草黃酮合酶挖掘

由于脹果甘草的基因組尚未解析，為了獲得甘草的FNSⅡ建立了脹果甘草的轉(zhuǎn)錄組分析方案。以已報(bào)道的大豆來源的FNSⅡ(CYP93B16)[21]為模板對脹果甘草轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行氨基酸序列同源比對分析共獲得214條候選序列。序列同源比對分析發(fā)現(xiàn)只有四條基因：Gur.gene26505、Gur.gene26116、Gur.gene26926、Gur.gene26365與CYP93B16[21]的氨基酸序列相似度在45%以上（表3），且將214條候選序列與已知功能的甘草[34]、大丁草[35]、苜蓿[36]等來源的CYP93B家族的細(xì)胞色素P450（表4）構(gòu)建分子進(jìn)化樹（圖3）表明這四條基因均屬于CYP93B家族的細(xì)胞色素P450。因此，Gur.gene26505、Gur.gene26116、Gur.gene26926和Gur.gene26365被確定為具有潛在功能的黃酮合酶。同時(shí)，分子進(jìn)化樹也表明Gur.gene26505屬于黃酮合酶Ⅱ分支可催化黃烷酮只生成黃酮[21]，而Gur.gene26116、Gur.gene26926和Gur.gene26365屬于黃酮2位羥化酶（F2H）分支催化黃烷酮生成黃酮和2-羥基黃烷酮[34]（圖4）。

表3候選基因信息

Table3Candidategenesinformation

基因名稱核酸序列長度/bp與CYP93B16氨基酸序列相似度/%Gur.gene26505157277Gur.gene26116159351Gur.gene26926122147Gur.gene26365157245新窗口打開|下載CSV

表4不同來源CYP93B家族的基因

Table4CYP93Bfamilyofgenesfromdifferentplants

名稱植物來源GenBank類型文獻(xiàn)CYP93B1刺果甘草P93149黃酮2位羥化酶[34]CYP93B2大丁草AAD39549黃酮合酶Ⅱ[35]CYP93B3金魚草BAA84071黃酮合酶Ⅱ[34]CYP93B4矮牽牛BAA84072黃酮合酶Ⅱ[34]CYP93B5翠菊AAF04115黃酮合酶Ⅱ[21]CYP93B6紫蘇BAB59004黃酮合酶Ⅱ[26]CYP93B11苜蓿ABC86159黃酮2位羥化酶[36]CYP93B12苜蓿DQ335809黃酮合酶Ⅱ[36]CYP93B13三花龍膽B(tài)AD91809黃酮合酶Ⅱ[37]CYP93B14山柳菊ACB56919黃酮合酶Ⅱ[38]CYP93B16大豆FJ767774黃酮合酶Ⅱ[21]CYP93B17六倍利BAF49323黃酮合酶Ⅱ[39]CYP93B18茶樹ACH99109黃酮合酶Ⅱ[21]新窗口打開|下載CSV

圖3

圖3進(jìn)化樹分析

Fig.3Evolutionarytreeanalysis

圖4

圖4黃酮合酶Ⅱ和黃酮2位羥化酶功能比較

Fig.4ComparisonofflavonoidsynthaseⅡandflavonoid2-hydroxylase

2.2候選黃酮合酶的催化功能表征

為了表征4個(gè)候選基因的功能，通過對甘草根的總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建其cDNA文庫。以cDNA文庫為模板，成功擴(kuò)增了Gur.gene26505和Gur.gene26116基因并測序驗(yàn)證序列正確。構(gòu)建其釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，分別命名為Yeast-F01和Yeast-F02。通過外源添加甘草素的方式進(jìn)行細(xì)胞催化反應(yīng)，檢測結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明重組菌Yeast-F01在外源添加了底物甘草素之后，以甘草素為底物特異性生成了7,4′-二羥基黃酮，而Yeast-F02的產(chǎn)物峰除7,4′-二羥基黃酮之外還有兩個(gè)產(chǎn)物峰（2-羥基甘草素及其互變異構(gòu)體）[34]（圖5）。表明Gur.gene26505可催化甘草素特異性合成7,4′-二羥基黃酮，屬于新的甘草黃酮合酶Ⅱ，而Gur.gene26116的產(chǎn)物較多、特異性較差，屬于黃酮2位羥化酶。

圖5

圖5甘草黃酮合酶Ⅱ候選基因的功能表征

Fig.5FunctionalcharacterizationofcandidategenesofflavonesynthaseⅡ

為了表征2個(gè)工程菌（Yeast-F01和Yeast-F02）合成7,4′-二羥基黃酮的能力，分別添加相同濃度（1mmol/L）的甘草素反應(yīng)48h測定7,4′-二羥基黃酮的產(chǎn)量。以1g的干細(xì)胞合成的7,4′-二羥基黃酮質(zhì)量（mg）為衡量指標(biāo)對2個(gè)工程菌株的合成能力進(jìn)行了評估。結(jié)果如圖6所示，表達(dá)Gur.gene26505的工程菌Yeast-F01底物轉(zhuǎn)化率達(dá)17.44%，同時(shí)其細(xì)胞催化活性達(dá)3.4mg/g，是Yeast-F02細(xì)胞催化活性的2倍。因此，表達(dá)Gur.gene26505的工程菌Yeast-F01除了具有產(chǎn)物特異性的優(yōu)點(diǎn)之外其催化活性也高，但是其底物轉(zhuǎn)化率相對較低。

圖6

圖6工程菌合成7,4′-二羥基黃酮能力評估

(細(xì)胞催化活性(mg/g)=7,4′-二羥基黃酮的濃度(mg/L)/細(xì)胞干重(g/L)；甘草素轉(zhuǎn)化率(%)=7,4′-二羥基黃酮的濃度(mmol/L)/甘草素初始添加量(mmol/L)）

Fig.6Evaluationoftheabilityofengineeringbacteriatosynthesize7,4-dihydroxyflavone

2.3黃酮合酶Ⅱ（Gur.gene26505）特異性催化機(jī)理探究

為了探究Gur.gene26505和Gur.gene26116催化甘草素產(chǎn)物差異的原因，利用AlphaFold2對Gur.gene26505和Gur.26116的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，并將中間羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素與其進(jìn)行分子對接和100ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬（圖7），發(fā)現(xiàn)Gur.gene26505的蛋白結(jié)構(gòu)中312位天冬氨酸的氧原子與2-羥基甘草素3號位的氫原子形成了氫鍵相互作用可將其奪走，并且315位蘇氨酸的氫原子與2-羥基甘草素2號位的羥基氧原子形成了氫鍵相互作用[圖8(a)]，使其容易離去從而生成碳碳雙鍵得到最終產(chǎn)物7,4′-二羥基黃酮；Gur.gene26116結(jié)構(gòu)中同樣具有300位天冬氨酸和303位蘇氨酸的脫水活性中心，使其具有合成7,4′-二羥基黃酮的能力，但是其117位的大位阻苯丙氨酸殘基處在一個(gè)柔性loop結(jié)構(gòu)上[圖8(d)]，由于柔性loop往里收縮導(dǎo)致117位的苯丙氨酸靠近羥化中心阻礙了羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素的位置轉(zhuǎn)變[圖8(b)]，從而使部分羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素?zé)o法進(jìn)入脫水中心導(dǎo)致Gur.gene26116產(chǎn)物復(fù)雜。相反，Gur.gene26505活性口袋附近特有的剛性結(jié)構(gòu)β片層[圖8(c)]使大位阻苯丙氨酸殘基翻轉(zhuǎn)至羥化中心下方，消除了羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素進(jìn)入脫水中心的阻力，進(jìn)而發(fā)生C2-C3位的脫水反應(yīng)特異性生成7,4′-二羥基黃酮[圖8(a)]。

圖7

圖7Gur.gene26505和Gur.gene26116分子動(dòng)力學(xué)模擬的均方根偏差數(shù)據(jù)

Fig.7TherootmeansquaredeviationdataformoleculardynamicssimulationsofGur.gene26505andGur.gene26116

圖8

圖8Gur.gene26505特異性催化機(jī)理

Fig.8SpecificcatalyticmechanismofGur.gene26505

2.4高效合成7，4′-二羥基黃酮的細(xì)胞催化工藝

為了實(shí)現(xiàn)7,4′-二羥基黃酮的高效合成，采取了目的基因Gur.gene26505過表達(dá)，優(yōu)化甘草素添加時(shí)間、催化時(shí)間以及強(qiáng)化細(xì)胞生長過程的策略。首先選擇可催化甘草素特異性合成7,4′-二羥基黃酮的Gur.gene26505分別構(gòu)建了其在釀酒酵母的單拷貝、多拷貝位以及單拷貝和多拷貝位點(diǎn)同時(shí)整合的重組菌Yeast-F01、Yeast-F03和Yeast-F04，外源添加相同濃度（1mmol/L）的甘草素反應(yīng)48h測定甘草素的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖9(a)所示，隨著Gur.gene26505整合位點(diǎn)拷貝數(shù)的增加，底物轉(zhuǎn)化率逐漸升高，Gur.gene26505過表達(dá)的重組菌株Yeast-F04轉(zhuǎn)化率上升至29.40%，是重組菌Yeast-F03和Yeast-F01的1.5倍和1.7倍，表明過表達(dá)Gur.gene26505可以一定程度提高底物轉(zhuǎn)化率。

圖9

圖9條件優(yōu)化提高底物轉(zhuǎn)化率

Fig.9Conditionaloptimizationtoimprovesubstrateconversion

其次，考察了不同底物添加時(shí)間、催化時(shí)間對底物轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明隨著底物添加時(shí)間點(diǎn)的延后，底物轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢，在0~36h之內(nèi)添加底物時(shí)底物轉(zhuǎn)化率維持在25%以上，其中在6h時(shí)底物轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到33.57%[圖9(b)]。另外發(fā)現(xiàn)隨著催化反應(yīng)時(shí)間的延長，底物甘草素的轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)上升趨勢，最高達(dá)50.20%[圖9(c)]，但是后期84~96h幾乎趨于平穩(wěn)并且細(xì)胞干重在60h之后不再增加，細(xì)胞的生長狀態(tài)和生物量限制了底物轉(zhuǎn)化率的進(jìn)一步上升。

因此，基于酵母細(xì)胞生長狀態(tài)對底物轉(zhuǎn)化率的影響，為了使得整個(gè)催化過程酵母全細(xì)胞具有高的生物量進(jìn)一步提高底物轉(zhuǎn)化率，對培養(yǎng)基成分酵母粉、蛋白胨、葡萄糖進(jìn)行過程添加強(qiáng)化菌體生長，從接種開始每隔12h分別添加培養(yǎng)基成分至其初始濃度，結(jié)果[圖9(d)]表明酵母粉的過程添加會(huì)促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長，同時(shí)使底物的轉(zhuǎn)化率提高，最高轉(zhuǎn)化率在84h可以達(dá)到76.67%，并且縮短了催化的時(shí)間，提高了催化工藝的效率。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，0~36h內(nèi)添加底物以及通過強(qiáng)化菌體生長都可提高底物轉(zhuǎn)化率的原因在于，這些策略可以使細(xì)胞具有良好的生長狀態(tài)，從而為Gur.gene26505催化的反應(yīng)（圖2）提供充足的輔因子NADPH的供應(yīng)，從而提高底物轉(zhuǎn)化率。同時(shí)，過表達(dá)Gur.gene26505和延長反應(yīng)時(shí)間也為催化過程提供了充足的催化劑和底物識別反應(yīng)的時(shí)間。因此最佳催化