大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

肝移植作為治療末期肝疾病的有效方法已得到社會的廣泛認(rèn)可，但肝移植后的不足已成為肝移植的瓶頸。目前許多邊緣性供肝被越來越多地用于臨床,如老年供肝、脂肪肝供肝等;但早期研究表明,脂肪肝作為供肝與移植術(shù)后原發(fā)性移植物無功能及早期移植物功能低下的發(fā)生明顯相關(guān),其主要原因是移植物缺血再灌注損傷程度較重。本研究旨在建立穩(wěn)定大鼠非酒精性脂肪肝模型,為進(jìn)一步研究脂肪肝供肝缺血再灌注損傷等實(shí)驗(yàn)提供可靠的動物模型。1材料和方法1.1材料表面1.1.1源聚生物科技有限公司、丙硫氧芐啶-市售板油豬膽鹽(批號070411)、膽固醇(批號070630)均購自上海源聚生物科技有限公司,丙硫氧嘧啶(批號070601)產(chǎn)自上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司,豬油為市售板油自制。1.1.2高脂肪食品的制備基礎(chǔ)飼料89.3%,豬油6%,膽固醇4%,豬膽鹽0.5%,丙硫氧嘧啶0.2%;經(jīng)機(jī)器生產(chǎn)壓制成條狀。1.2方法1.2.1動物中心分組雄性SD大鼠(清潔級)20只,體重(190±10)g,購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物中心許可證號SYXK(蘇)2002-0013)。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為2組,每組10只。A組(對照組)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)4周,B組(模型組)給予高脂飼料喂養(yǎng)4周;兩組自由飲用自來水。1.2.2肝臟病理組織病理學(xué)檢查大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食過夜,自由飲水。稱重后采用1%戊巴比妥50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,腹部正中大十字切口進(jìn)腹,游離肝臟,自下腔靜脈采血4~5ml,37℃恒溫60min,1500r/min離心5min,取上清置于EP管中,-70℃冰箱保存待測肝功能,在大鼠抽血后仍存活時(shí)迅速切下肝臟,稱重后置于10%甲醛溶液中固定,石蠟包埋切片,HE染色,普通光鏡下進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。1.2.3病理組織學(xué)檢測一般情況:大鼠皮毛色澤、行動和食量、糞便等。肝功能:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG),按羅氏生化試劑盒操作步驟,在羅氏MODULARDPE血清工作站上測定。病理學(xué)觀察:肝臟脂肪變性程度由兩位病理科醫(yī)生對切片HE染色結(jié)果進(jìn)行盲法評分分級。脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn):低倍鏡下,肝細(xì)胞脂肪變性占肝小葉1/3~1/2者為輕度脂肪肝;占肝小葉1/2~3/4者為中度脂肪肝;占肝小葉3/4以上或者肝細(xì)胞彌漫脂肪性變性呈漁網(wǎng)狀者為重度脂肪肝。肝指數(shù)測定:肝臟切取后濾紙吸干表面水分后稱其濕重,計(jì)算肝指數(shù):。1.3統(tǒng)計(jì)處理計(jì)量資料用表示,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為有顯著性差異。2結(jié)果2.1高脂飼料的飼養(yǎng)在造模過程中,對照組大鼠生長及生活狀況正常;模型組動物高脂飼料喂養(yǎng)1周后精神萎靡,食欲不振,毛色光澤暗淡,體重增加緩慢,隨著時(shí)間推移,毛色部分呈蠟黃樣。2.2肝功能實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明兩組大鼠肝功能ALT、ALB無顯著性差異,模型組TG水平顯著高于對照組(表1)。2.3肝體重、肝指數(shù)的公式模型組肝重及肝指數(shù)顯著高于對照組,體重顯著低于對照組(表2)。2.4肝竇變窄,肝索解離模型組:3只表現(xiàn)為輕度脂肪肝,7只表現(xiàn)為中度脂肪肝。脂肪變性的肝細(xì)胞腫脹呈圓形,以小葉周圍最為明顯,胞漿內(nèi)充滿大小不等脂肪空泡,將細(xì)胞核擠于一邊,肝竇變窄,肝索解離(圖1)。對照組:肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,肝竇清晰可見,肝索排列整齊,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央(圖2)。3大鼠非酒精性肝損傷模型的制備目前認(rèn)為脂肪肝的發(fā)病機(jī)制主要為:(1)進(jìn)入肝內(nèi)的脂肪酸過多,TG的合成超過將其轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟的能力;(2)肝內(nèi)脂肪酸β氧化障礙,肝內(nèi)脂肪酸利用減少,TG合成增加;(3)VLDL的合成及分泌障礙,肝臟內(nèi)源性TG不能運(yùn)出肝臟;(4)肝臟合成TG能力增強(qiáng)及脂蛋白代謝酶的活性下降。上述因素造成過多的脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)沉積,從而造成肝細(xì)胞脂肪變性。當(dāng)肝內(nèi)脂質(zhì)超過肝臟濕重的5%即定義為脂肪肝。組織學(xué)檢查是判斷肝脂肪變性的金標(biāo)準(zhǔn),但切片的厚度及染色的方法對其檢測和分級有一定的影響,不同的染色方法所得到的結(jié)論差別較大,有研究報(bào)道,連續(xù)對83個(gè)供肝進(jìn)行檢測,脂肪變性的比例用蘇丹Ⅲ染色為49%,甲苯胺藍(lán)為47%,冰凍切片為39%,HE染色為21%。但目前最廣泛應(yīng)用的方法仍為HE染色,且根據(jù)低倍光鏡下肝細(xì)胞受累程度將其分為三度,肝細(xì)胞脂肪變性占肝小葉1/3~1/2者為輕度脂肪肝;占肝小葉1/2~3/4者為中度脂肪肝;占肝小葉3/4以上或者肝細(xì)胞彌漫脂肪性變性呈漁網(wǎng)狀者為重度脂肪肝;但大多數(shù)肝移植中心采用分級標(biāo)準(zhǔn)為輕度(<30%肝細(xì)胞受累)、中度(30%~60%)和重度(>60%)。本研究仍采用HE染色后低倍光鏡觀察的脂肪肝診斷方法及分級標(biāo)準(zhǔn)。理想的動物模型應(yīng)具備與人類疾病特征相似;病變有一定的發(fā)展過程;形成率高,死亡率低,重復(fù)性好;造模方法簡便易行等優(yōu)點(diǎn)。目前國內(nèi)外已建立多種大鼠非酒精性脂肪肝動物模型,可以歸納為下述幾種實(shí)驗(yàn)性動物模型。(1)遺傳性肥胖大鼠,目前國外文獻(xiàn)報(bào)道較多的是Zucker大鼠(fa/farat),其為遺傳性瘦素基因缺乏鼠,可發(fā)生高胰島素血癥、胰島素抵抗而自發(fā)形成糖尿病、肥胖和脂肪肝。其主要用于并發(fā)代謝綜合征的脂肪肝研究,不適用于后天營養(yǎng)障礙所致脂肪肝的研究,而且在國內(nèi)其來源困難、售價(jià)高、在造模過程中死亡率較高。(2)藥物/毒物性脂肪肝模型,四環(huán)素等藥物通過干擾線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或抑制β氧化從而降低脂肪酸的代謝、誘發(fā)肝細(xì)胞脂肪變性。一些工業(yè)毒物,如四氯化碳(CCl4)、黃磷、二甲基亞硝胺(DMNA)、二乙基亞硝胺(DEN)等可通過自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)途徑導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠肝細(xì)胞損傷和脂肪變,具有簡便、快速的優(yōu)點(diǎn);但其發(fā)病機(jī)制、病理、病理生理改變與人類常見脂肪肝類型差異較大,且此類脂肪肝模型中肝臟損傷嚴(yán)重、肝功能明顯異常、實(shí)驗(yàn)動物死亡率高,不適于作為肝移植供體。(3)營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型,HarlanTeklad實(shí)驗(yàn)室采用膽堿-蛋氨酸缺乏飲食(CMDD飼料)喂養(yǎng)大鼠14天即可誘發(fā)肝脂肪變性,其為國際上經(jīng)典的大鼠非酒精性脂肪肝模型,但價(jià)格昂貴。目前國內(nèi)外多采用給雄性Wistar或Sprague-Dawley(SD)大鼠飼以高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+1%~2%膽固醇、10%豬油或5%蛋黃粉)8~12周后可形成中至重度大泡性肝脂肪變,伴ALT增高,脂肪肝復(fù)制率100%,其方法簡便,死亡率低,復(fù)制率高,缺點(diǎn)是造模時(shí)間較長。亦有采用大鼠禁食48h后飼以高糖高淀粉飲食,2天后即誘發(fā)形成輕至中度的脂肪變性,造模時(shí)間短,但肝功能損害明顯。甚至有采用高脂液體飼料灌胃、全胃腸外營養(yǎng)、全胃腸內(nèi)營養(yǎng)等脂肪肝造模方法,盡管脂肪肝復(fù)制率高,但操作煩瑣,限制其推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食4周成功復(fù)制大鼠非酒精性脂肪肝模型,方法簡單易行,一般實(shí)驗(yàn)室均可以進(jìn)行;同時(shí)血清生化檢查證明大鼠輕度脂肪肝變性時(shí)甘油三酯水平明顯高于正常組,但肝功能ALT、ALB與對照組相比無顯著性差異,表明模型建立是成功的。本實(shí)驗(yàn)為了縮短脂肪肝建模時(shí)間,在飼料中添加了