高脂飼料誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝模型的建立

高脂飼料誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝模型的建立

人類飲食結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致非酒精性肝疾病的發(fā)病率逐年增加。非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)包括:單純性脂肪變性、脂肪性肝炎和肝硬化3個(gè)病理階段。脂肪性肝炎為預(yù)后較差的一個(gè)階段,可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌,目前尚無(wú)明顯有效的治療方法。動(dòng)物模型在探索疾病的發(fā)病機(jī)制、評(píng)價(jià)診斷方法、篩選防治藥物等領(lǐng)域均有重要作用。近年來(lái),許多學(xué)者利用試驗(yàn)動(dòng)物復(fù)制非酒精性脂肪肝病理模型并對(duì)其進(jìn)行了大量的研究,取得了許多成果。其中C57BL/6J小鼠對(duì)高脂較敏感,是理想的建模動(dòng)物。本試驗(yàn)采用高脂飼料和高脂與四氯化碳聯(lián)合誘導(dǎo),并比較了兩種誘導(dǎo)方法以及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)非酒精性脂肪肝的變化與進(jìn)程的影響,目的是探索建立較理想動(dòng)物模型的方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1性別間的年齡近交系C57BL/6J小鼠,SPF級(jí),9~10周齡,共60只,雄性。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):scxk黑2006-009。1.1.2藥物和試劑所用藥品為分析純由天津虔誠(chéng)偉業(yè)科技發(fā)展有限公司提供,生化試劑盒由南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司提供,油紅O試劑由Sigma公司提供。1.1.3儀器1.2方法1.2.1高脂肪飼料的制備高脂飼料:15%豬油,1%膽固醇,0.5%膽鹽,15%糊精,68.5%基礎(chǔ)飼料。豬油是由市場(chǎng)購(gòu)買的經(jīng)檢驗(yàn)合格的動(dòng)物脂肪熬制所得。1.2.4精性脂肪性肝疾病診斷指南判斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)中華肝病學(xué)會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》(2010年修訂版)。計(jì)量資料用X±S表示,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),用SAS9.1軟件統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。2結(jié)果與分析2.1對(duì)小鼠體重、肝指數(shù)的影響試驗(yàn)過(guò)程中,與對(duì)照組小鼠相比,高脂組和復(fù)合組小鼠毛發(fā)油膩、凌亂。食量減少,對(duì)外界刺激的反應(yīng)較遲鈍。與對(duì)照組小鼠相比,高脂組和復(fù)合組小鼠體重均呈下降趨勢(shì),且差異極顯著(P<0.01);肝指數(shù)上升,第4周差異顯著,6~8周差異極顯著(P<0.01)。復(fù)合組與高脂組相比,第8周肝指數(shù)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。見(jiàn)表1。2.2正常小鼠肝索組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果肉眼觀察,8周時(shí),正常組小鼠肝臟外觀呈紅褐色,表面光滑,邊緣銳利,質(zhì)軟有彈性;高脂組與復(fù)合組小鼠肝臟腫大易碎、包膜稍緊張、邊緣圓鈍、呈棕黃色、切面有油膩感,且膽囊變色。結(jié)果如中插彩版圖1所示。光鏡下,正常組小鼠肝細(xì)胞正常,肝索排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)正常。高脂組4周,脂肪變性的肝細(xì)胞占2/3以上,呈魚網(wǎng)狀,8周可見(jiàn)氣泡樣變與凋亡的肝細(xì)胞,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。復(fù)合組4周時(shí),脂肪變性的肝細(xì)胞占2/3以上,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。8周時(shí),有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)灶,出現(xiàn)纖維化和大量氣泡樣變的肝細(xì)胞。油紅O染色可見(jiàn),8周時(shí)高脂組比復(fù)合組小鼠肝臟的橘紅色脂滴廣泛,復(fù)合組中肝臟的肝竇擴(kuò)張。見(jiàn)中插彩版圖2~9。2.3復(fù)合組與脂組tg含量比較4周時(shí),高脂組和復(fù)合組血清中TG和T-CHO水平均顯著高于對(duì)照組。8周時(shí)高脂組TG含量又顯著高于復(fù)合組(P<0.05)。4周時(shí),高脂組和復(fù)合組小鼠血清中的轉(zhuǎn)氨酶明顯升高,其中GPT水平均顯著高于對(duì)照組,且保持較平穩(wěn)的高水平。復(fù)合組中GOT、GGT水平與高脂組也有顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。3高脂飼料對(duì)小鼠肝指數(shù)的影響非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除過(guò)量飲酒和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)量沉積,是一類獲得性的代謝應(yīng)激相關(guān)性肝病。為深入研究非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制,建立一個(gè)與人類病變相似的動(dòng)物模型極為重要。目前國(guó)內(nèi)外主要采用高脂飼喂Wistar或SD大鼠,或是膽堿-蛋氨酸缺乏飲食(MCD)C57BL/6J小鼠模型。前者炎癥的產(chǎn)生和造模時(shí)間較長(zhǎng),后者可以較快復(fù)制模型,但模型中血清TG和肝指數(shù)下降,且由于缺少膽堿和蛋氨酸成分,不符合人類實(shí)際的飲食情況。人類生活中高脂飲食是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝主要因素,而使用的一些藥物或是攝入的毒性物質(zhì)也在損傷肝臟。本試驗(yàn)采用高脂飲食和復(fù)合誘導(dǎo)兩種造模方法。試驗(yàn)中高脂組和復(fù)合組肝指數(shù)顯著高于正常組?？紤]到高脂飼料較油膩,小鼠采食量下降,所以體重下降。相比體重的變化,其肝指數(shù)的變化更有意義。試驗(yàn)中小鼠沒(méi)有表現(xiàn)肥胖癥狀,但有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,人類體重正常時(shí)也存在發(fā)生NAFLD。試驗(yàn)中病理組織檢驗(yàn)結(jié)果,經(jīng)判定符合建模標(biāo)準(zhǔn)。高脂組在4周時(shí),已形成明顯的脂肪變性,在8周時(shí)有少量炎性細(xì)胞。由于四氯化碳的作用,復(fù)合組較高脂組有明顯的炎性浸潤(rùn),且肝臟損傷明顯。并且兩組中膽囊出現(xiàn)不同程度變化,出現(xiàn)炎癥。膽囊炎和膽結(jié)石在非酒精性脂肪肝病也時(shí)常發(fā)生。高脂組與復(fù)合組TG含量不穩(wěn)定,總體呈升高趨勢(shì)。8周時(shí),高脂組顯著高于復(fù)合組。高脂組與復(fù)合組T-CHO含量都明顯高于正常組,且在4~8周較穩(wěn)定。兩組造模結(jié)果符合NAFLD中的高脂血癥。試驗(yàn)中給予高脂飼料的小鼠TG與T-CHO呈上升趨勢(shì),這與NAFLD患者中甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)水平明顯高于對(duì)照組的文獻(xiàn)報(bào)道相符。試驗(yàn)4~8周高脂組和復(fù)合組GPT含量明顯高于正常組,符合建模標(biāo)準(zhǔn)。血清GPT升高是反映肝臟損傷的標(biāo)志之一,在GPT、GOT及GGT等肝酶中,GPT與肝臟脂肪聚集關(guān)系最為密切,并且文獻(xiàn)報(bào)道GPT的升高可能會(huì)早于NAFLD。復(fù)合組的GOT含量較高脂組要高,且在8周時(shí),顯著高于高脂組。這與肝細(xì)胞損傷程度有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道,血清GOT增高與NAFLD的進(jìn)展性肝纖維化相關(guān)?？梢?jiàn)CCl4在誘導(dǎo)過(guò)程中,促進(jìn)了肝損傷和纖維化的進(jìn)程,也證實(shí)了外界的毒性物質(zhì)促進(jìn)非酒精性脂肪肝的發(fā)展。模型組中血清酶學(xué)指標(biāo)的升高與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致,符合日常檢測(cè)的NAFLD患者血清酶學(xué)指標(biāo)[8、10]。本試驗(yàn)在考慮高脂飼料與化學(xué)性物質(zhì)作用的因素下,結(jié)合以上各種分析,高脂組在高脂誘導(dǎo)4周后,得到的模型已符合人體NAFLD的主要特征。且得到的生化指標(biāo)可作為進(jìn)一步研究的參考。復(fù)合組中合用了化學(xué)性誘導(dǎo)物質(zhì),主要考慮實(shí)際生活中,人們不可避免地會(huì)接觸到各種化學(xué)毒性物質(zhì)。四氯化碳可促使肝臟的炎癥和纖維化,與高脂合用對(duì)非酒精性脂肪肝疾病進(jìn)程有促進(jìn)作用。復(fù)合組8周可以考慮作為NAFLD的肝臟纖維化病變模型。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究發(fā)病機(jī)制及有效防止藥物奠定了基礎(chǔ)。RM2135切片機(jī),冷凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司),英諾華自動(dòng)生化儀。1.2.2小鼠肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定小鼠按隨機(jī)原則分為正常組、高脂組和高脂復(fù)合四氯化碳組(復(fù)合組),每組20只。所有動(dòng)物適應(yīng)飼喂1周后,正常組飼喂普通飼料,高脂組飼喂高脂飼料,復(fù)合組除飼喂高脂飼料外,首次每只小鼠以0.72mL/100g劑量皮下注射CCl4溶液,以后每周1次以0.42mL/100g劑量皮下注射40%的CCl4-植物油(V/V)溶液,連續(xù)3周。各組分別于第4、6、8周,取5只小鼠進(jìn)行稱重剖殺,取血分離血清,剖檢,取肝臟稱濕重;取肝組織固定,分別進(jìn)行H.E.染色和油紅O染色,做病理學(xué)檢查。1.2.3病理組織學(xué)檢測(cè)一般檢查:試驗(yàn)期間每周稱小鼠體量1