復(fù)方莪術(shù)油抗菌作用的初步研究 中藥學(xué)專業(yè)

復(fù)方莪術(shù)油抗菌作用的初步研究目錄摘要 Ⅰ-Ⅱ1前言 前言莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)（CurcumaphaeocaulisVal.）、廣西莪術(shù)(CurcumakwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang)或溫莪術(shù)(CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling)的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有行氣破血，消積止痛的功效[1]。近幾年的研究表明，莪術(shù)的主要成分為莪術(shù)油、姜黃素及多糖類成分[2]。隨著對莪術(shù)油研究的不斷發(fā)展,發(fā)現(xiàn)其中的主要成分為莪術(shù)烯、新莪術(shù)二酮、異莪術(shù)醇、原莪術(shù)醇、去氧莪術(shù)酮、呋喃二莪術(shù)酮、蒎烯、樟烯、樟腦、異龍腦、龍腦、桉油精、吉馬酮、異呋吉馬酮等。其中莪術(shù)油中的莪術(shù)醇和莪術(shù)二酮為抗癌有效成分，在《中國藥典》2005版一部把吉馬酮作為莪術(shù)油定量的指標性成分。莪術(shù)二酮和吉馬酮是莪術(shù)油中含量較高的主要有效成分，其具有良好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓和鎮(zhèn)痛抗炎的作用，常作為莪術(shù)藥材及莪術(shù)油質(zhì)量控制的指標性成分。另外,莪術(shù)油中還含有對甲氧基桂皮酸乙酯,該成分具有抗菌作用。因此莪術(shù)油不僅具有治療肺癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥的功效，還具有消炎抗炎、止痛、抗血栓、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗氧化延緩衰老等功效[3-4]。有關(guān)文獻表明[5]，蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)、溫莪術(shù)三個品種的揮發(fā)油含量及化學(xué)成分大致相同，但不同產(chǎn)地的莪術(shù)，成分也有一定的差異，在李瑤[6]的研究中表明，蓬莪術(shù)中所提取的揮發(fā)油中不含有莪術(shù)二酮，溫莪術(shù)中莪術(shù)二酮的含量卻最高，而廣西莪術(shù)揮發(fā)油中β-欖香烯的含量相對較高，研究表明廣西莪術(shù)所含的揮發(fā)油均高于其他兩者，而本實驗選用廣西莪術(shù)作為提取莪術(shù)油的藥材。復(fù)方精油利用中草藥提取物作為日用品的原料，具有藥效穩(wěn)定，藥力持久，對皮膚作用溫和、刺激性小、安全性高、療效顯著等特點，符合人們生活所需且順應(yīng)性好。某些復(fù)方精油還能殺死空氣中的細菌，防止瘟疫擴散[7]。有研究表明以中藥植物精油為原料研發(fā)成為空氣消毒劑，可以應(yīng)用于醫(yī)院、爐管、飯店、家庭居室以及人群密集的公共場所消毒，其效果與家庭紫外消毒法、過氧乙酸熏蒸法相當(dāng)[8]。中草藥揮發(fā)油目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，比如用于跌打損傷的白花油、紅花油，用于治療痤瘡的茶樹精油等。近年來學(xué)術(shù)界對莪術(shù)油的研究較多，試圖多方面地開發(fā)莪術(shù)油的新劑型以最大化地發(fā)揮莪術(shù)油的藥用價值，但莪術(shù)油本身是混合物，其制劑的穩(wěn)定性、載藥量及其毒性到目前為止都未能完全研究清楚，有待作進一步探究和完善。有研究表明大劑量莪術(shù)煎液能在短時間內(nèi)使實驗大鼠的體重降低，造成肝損傷加重[9]；倘若每天給予足夠量大的莪術(shù)高蛋白粉末，在一周內(nèi)大鼠死亡率達100%。為了安全有效地發(fā)揮藥物的藥用價值，減少未知副作用的影響，可以把莪術(shù)油與其他稀釋劑混合制備成其他劑型或和其他精油復(fù)方配伍使用，一方面可以減少單方精油因濃度過高而對皮膚產(chǎn)生刺激性、減少毒副作用，另一方面通過揮發(fā)油與稀釋劑、輔助劑等相互混合使制劑相輔相成、相互作用、增強療效、增加適用性。為此，本次實驗把莪術(shù)油與其他固定比例的多種精油按一定的配比復(fù)方使用，探究復(fù)方莪術(shù)油的抗菌作用。目前市場上的復(fù)方莪術(shù)油品種稀少且以進口藥品居多，如：星加坡金波士萬應(yīng)莪術(shù)油、茂隆萬應(yīng)莪術(shù)油、茂隆莪術(shù)油、印尼蜂標莪術(shù)油等，價格昂貴，貨源難求，難以滿足國內(nèi)龐大的市場需求，本實驗在分析市面上常見的幾類復(fù)方莪術(shù)油處方及組方藥材的藥理研究文獻后，確定了以莪術(shù)、藿香、茶樹、迷迭香、尤加利、歐薄荷、天竺葵、檸檬草8種藥材的揮發(fā)油與基礎(chǔ)油橄欖油按一定的比例和組合方式進行混合，配置成若干個不同莪術(shù)比例的復(fù)方莪術(shù)油樣品，對其進行質(zhì)量分析、穩(wěn)定性評價和藥效評價，考察不同組方對細菌活性的影響及消腫、止癢等療效，以研發(fā)療效好，副作用少，質(zhì)量標準明確的復(fù)方莪術(shù)油應(yīng)用于日常生活中。本實驗研究的復(fù)方莪術(shù)油是一種能夠殺菌止癢、消炎消腫、活血祛瘀、抗炎鎮(zhèn)痛、驅(qū)風(fēng)化濕的外用制劑，可用于筋骨扭傷、跌打損傷、蚊蟲咬傷、感冒頭痛等癥狀，具有用途廣泛，藥效顯著，對皮膚作用溫和、刺激性小、安全性高等特點，作為一種家居必備生活用品仍有很大的發(fā)展空間。2材料與儀器2.1材料表2-1實驗材料明細表材料規(guī)格生產(chǎn)廠家廣西莪術(shù)-廣西玉林市中藥材專業(yè)市場橄欖油250mL唯你油脂商鋪藿香油10mL阿芙精油官方旗艦店茶樹油10mL阿芙精油官方旗艦店迷迭香精油10mL重慶高島化妝品商行精油尤加利精油10mL阿芙精油官方旗艦店檸檬草精油10mL重慶高島化妝品商行精油歐薄荷精油10mL重慶高島化妝品商行精油天竺葵精油10mL重慶高島化妝品商行精油金黃色葡萄球菌-廣東藥科大學(xué)微生物實驗室大腸埃希氏菌-廣東藥科大學(xué)微生物實驗室曲霉菌-廣東藥科大學(xué)微生物實驗室營養(yǎng)瓊脂原料-杭州微生物試劑有限公司營養(yǎng)肉湯原料-杭州微生物試劑有限公司2.2試驗儀器與設(shè)備表2-2實驗儀器與設(shè)備儀器型號生產(chǎn)廠家紫外分光光度計UV754N上海佑科儀器儀表有限公司搖擺式高速萬能粉碎機DFY-300C溫嶺市林大機械有限公司水浴恒溫振蕩器SHA-BA金壇市宏華儀器廠立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50FAS上海申安醫(yī)療器械廠數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱HPX-9162MBE上海博迅實業(yè)有限公司電子天平Y(jié)P502N上海精密科學(xué)儀器有限公司3實驗方法3.1莪術(shù)鑒別與檢查3.1.1性狀鑒別在挑選購買廣西莪術(shù)時，觀察廣西莪術(shù)的性狀特征、聞氣、嘗味并對其進行一定的描述。3.1.2定性鑒別熒光鑒別法是根據(jù)中藥的某些成分在紫外光燈下能產(chǎn)生特定的熒光鑒別來鑒別中藥的一種方法。對于鑒別人員、鑒別環(huán)境及設(shè)備均無特殊要求，操作方法簡便易行。將莪術(shù)橫切面置于紫外光燈（365nm）下觀察其熒光顏色[10]；分別將5g莪術(shù)粉末置于水中、2mol/LNaOH、2mol/LHCL溶液中浸泡適當(dāng)時間，蘸取適量的莪術(shù)水浸液、2mol/LNaOH浸液、2mol/LHCL浸液于濾紙上，在紫外光燈（254nm和365nm）下觀察其熒光顏色。3.1.3吸光度檢查依據(jù)《中國藥典》2015年版中對莪術(shù)的檢查：取本品中粉30mg，精密測定，置具塞錐形瓶中，加氯仿10mL，浸泡24h，濾過，濾液移置10mL的量瓶中，補加氯仿至刻度，搖勻，照紫外-可見分光光度法測定在242nm波長處的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)。3.2莪術(shù)油的制備及優(yōu)化3.2.1粒徑的優(yōu)化本實驗把適量的莪術(shù)用搖擺式高速萬能粉碎機研磨成粗粉，過10、20、30、40目篩，取70g粉置于1000mL圓底燒瓶中，加入3~4粒沸石，加入8倍水量，按照《中國藥典》揮發(fā)油測定法甲法項下測定，（如圖3-1裝置所示）調(diào)節(jié)電熱套到最高溫度至沸騰狀態(tài)后降低溫度，保持微沸狀態(tài)蒸餾足夠時間至揮發(fā)油量不再增加，放置0.5h后讀取揮發(fā)油量，同時計算提取率。將提取的莪術(shù)油收集于棕色小瓶中，加入適量無水硫酸鈉除去殘余水分，備用。莪術(shù)油提取率見公式(3-1)：QUOTEY=vm×100%(公式3-1)式中Y為揮發(fā)油提取率；v為揮發(fā)油體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。圖3-1水蒸氣蒸餾提取裝置3.2.2料液比的優(yōu)化將莪術(shù)粉碎過30目篩，取50g粉置于1000mL的圓底燒瓶中，分別加6、8、10、12倍水量，如上操作，調(diào)節(jié)溫度保持微沸狀態(tài)蒸餾足夠時間至揮發(fā)油量不再增加，放置0.5h后讀取揮發(fā)油量，同時計算提取率。將提取的莪術(shù)油收集于棕色小瓶中，加入適量無水硫酸鈉除去殘余水分，備用。3.2.3加熱溫度的優(yōu)化本實驗主要采用水蒸氣蒸餾法提取莪術(shù)油，但由于水蒸氣蒸餾法受熱溫度較高，物料與水接觸時間較長，有可能使揮發(fā)油的某些成分發(fā)生化學(xué)分解，如莪術(shù)二酮會不可逆地分解為莪術(shù)內(nèi)脂，降低揮發(fā)油的質(zhì)量，導(dǎo)致提取率較低，對其藥理作用產(chǎn)生一定的影響，故控制好電熱套的加熱溫度對莪術(shù)揮發(fā)油的提取至關(guān)重要。將莪術(shù)粉碎過30目篩，取70g粉置于1000mL的圓底燒瓶中，加入8倍水量，分別維持電熱套的加熱溫度為100℃、110℃、120℃、130℃如上操作，保持微沸狀態(tài)蒸餾足夠時間至揮發(fā)油量不再增加，放置0.5h后讀取揮發(fā)油量，同時計算提取率，并觀察揮發(fā)油的顏色。將提取的莪術(shù)油收集于棕色小瓶中，加入適量無水硫酸鈉除去殘余水分，備用。3.3復(fù)方精油抗菌實驗方法3.3.1復(fù)方精油的組方成分參考市場上幾種復(fù)方莪術(shù)油的配比及經(jīng)文獻調(diào)研初步固定部分精油的配比為藿香油（2%）茶樹油（2%）歐薄荷油（2%）迷迭香油（1%）尤加利油（1%）天竺葵油（1%）檸檬草油（1%），在配置過程中，僅改變莪術(shù)油和橄欖油的含量，橄欖油作為基礎(chǔ)油視為無關(guān)變量，隨莪術(shù)油含量的改變而改變，最終使所有精油含量和為100%。當(dāng)復(fù)方精油復(fù)合后，應(yīng)用強力攪拌機攪拌以混合均勻，備用。表3-1所用植物精油基本情況種Species科Family屬Cenus主要有效成分主要作用莪術(shù)姜科姜黃屬莪術(shù)油、姜黃素及多糖類成分抗菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤、益智和延緩衰老Curcumazedoaria(Christm.)RoscgingiberifamiliaTurmeric廣藿香唇形科-黃酮類成分、廣藿香醇、廣藿香酮抗炎鎮(zhèn)痛解熱、抗病原微生物，保護胃腸運動[11-12]PogostemoncablinLabiatae-橄欖橄欖科橄欖屬單不飽和脂肪酸對皮膚無刺激性，有利于傷口愈合創(chuàng)面恢復(fù)，防止皮膚粗糙[13]Canariumalbum(Lour.)RaeuschRamusoliueuirentisCanariumindicum茶樹桃金娘科白千層屬揮發(fā)油、三萜、鞣質(zhì)、脂肪酸等抗菌、抗炎、除螨、

鎮(zhèn)咳、抗氧化、抗腫瘤[14]Camelliasinensis(L.)O.Ktze.MyrtaceaeMelaleuca迷迭香唇形科-萜烯類、二萜酚類酚酸類和黃酮類抗氧化、抗病毒、抗菌抗炎、抗血栓[15]RosmarinusofficinalisLabiatae-尤加利桃金娘科-桉油醇、芳香烯、樟腦、茴香萜、柚油萜促進新組織構(gòu)建、降低體溫、抗病毒、改善偏頭痛[16]EucalyptusMyrtaceae-檸檬草禾本科香茅屬檸檬醛、香葉醛、橙花醛、香葉醇抗炎、止痛、殺菌、防蟲以及調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[17]Cymbopogoncitratus(DC.)Stapf.

ApiaceaeLemongrassgenus歐薄荷唇形科薄荷屬胡薄荷醇、薄荷腦和薄荷酮鎮(zhèn)痛、止癢作用、抗病毒、殺菌、利膽、止咳作用[18]PeppermintLabiataeMenthaspicata天竺葵牻牛兒苗科天竺葵屬香茅醇,a一旅烯,芳樟醇抗菌、驅(qū)蚊、對螨蟲有驅(qū)避作用[19]PelargoniumhortorumGeraniaceaePelargoniumappendiculatum3.3.2抗菌實驗準備儀器準備將培養(yǎng)皿、試管、移液管、槍頭、濾紙片（5mm）、玻璃棒、接種環(huán)、涂布棒、鑷子等用牛皮紙包裹后放置于立式壓力蒸汽滅菌器中進行濕熱高壓滅菌（121℃，30min）后備用。培養(yǎng)基準備在本實驗中應(yīng)用的主要培養(yǎng)基為：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于血瓊脂基礎(chǔ)和傳代；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基用于一般細菌培養(yǎng)、轉(zhuǎn)種、復(fù)壯、增菌等。具體成分和配制方法見表3-2。表3-2培養(yǎng)基的分類和配制方法名稱成分使用方法營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10.0g；牛肉3.0g；粉：5.0g；氯化鈉5.0g；瓊脂15.0g；PH值7.3±0.1稱取本品3.3克，加熱攪拌溶解于100mL蒸餾水中，用牛皮紙封口，121℃高壓滅菌15min，待溫度降至70℃以下裝置高溫滅菌的培養(yǎng)皿和試管中，經(jīng)冷卻后作為固體培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基用。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基蛋白胨10.0g；牛肉浸粉3.0g；氯化鈉5.0g；pH值7.2±0.2稱取本品18.0g,加熱溶解于1000mL蒸餾水中,分別裝于三角瓶或試管,用牛皮紙封口，121℃高壓滅菌15min后裝置高溫滅菌的試管中密封待用。注：配置好的培養(yǎng)基應(yīng)用兩層牛皮紙封口包好，以避免雜菌的污染。菌懸液準備金黃色葡萄球菌：為革蘭氏陽性細菌，金黃色，球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。是兒童中最常見的致病菌，是毛囊炎、燙傷樣皮膚綜合癥、蜂窩組織炎及外科創(chuàng)傷感染的病因[20]。大腸埃希氏菌：為革蘭氏陰性菌，短桿狀且為兼性厭氧菌，直徑1μm左右，周身鞭毛，能運動，無芽孢。大腸桿菌常會引起腹瀉、痢疾、頭痛，發(fā)燒、惡心、嘔吐等癥狀[21-22]。曲霉菌：常見的為黃曲霉菌，其菌落生長較快，結(jié)構(gòu)疏松，不同的曲霉菌有不同的形狀和顏色，大多為表面灰綠色，背面無色或略呈褐色，曲霉菌常導(dǎo)致角膜炎和眼內(nèi)炎，偶見引起鞏膜炎、結(jié)膜炎及淚囊炎[23-24]。本實驗所用到的細菌或真菌的菌種，已經(jīng)采用平板分區(qū)劃線法分離培養(yǎng)保存于微生物實驗室中。制作菌懸液時，首先配置好營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，121℃高壓蒸汽滅菌30min，其余玻璃器皿等121℃干熱滅菌30min。滅菌完畢，取出營養(yǎng)肉湯，待稍冷后，于超凈工作臺中，點燃酒精燈，用已經(jīng)高溫滅菌的接種環(huán)于酒精燈上灼燒2~3s，待冷卻后，在相應(yīng)細菌的培養(yǎng)基中挑取2~3個單個菌落放入營養(yǎng)肉湯中，稍振搖，瓶口在酒精燈外焰處旋轉(zhuǎn)一圈，密塞，于恒溫水浴振蕩器中37℃振蕩培養(yǎng)24h，即得大腸桿菌菌懸液，金黃色葡萄球菌菌懸液，曲霉菌懸液。放入冰箱中于4℃保存?zhèn)溆谩?.3.3抑菌圈實驗涂布棒、玻璃培養(yǎng)皿、槍頭、燒杯、試管等用牛皮紙包好，高溫滅菌。滅菌完畢后，于超凈工作臺中，點燃酒精燈（注：接種環(huán)必須經(jīng)過酒精燈高溫灼燒待冷卻后方可接觸菌液，避免溫度過高使供試菌失活）。配置少量營養(yǎng)肉湯供稀釋菌液使用，用微量移液槍吸取定量菌懸液于試管中，再加入營養(yǎng)肉湯將菌液稀釋10倍，搖勻，吸取100μL稀釋液置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中央，并用涂布棒均勻涂布于培養(yǎng)基四周以確保細菌能均勻生長；然后用鑷子夾取5mm的圓形濾紙片平整地貼放于培養(yǎng)基中，一個培養(yǎng)基中貼放4~5片濾紙片；再用移液槍移取若干已配置好的不同比例的復(fù)方莪術(shù)油樣品或各種單方精油5μL滴加在濾紙片上，待精油被濾紙充分吸收后，將培養(yǎng)基倒平板移至37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h后觀察實驗結(jié)果，并用游標卡尺測量抑菌圈的大小。抑菌圈大小與抑菌活性、敏感程度的關(guān)系如表3-3。每種單方精油以及每份不同比例的復(fù)方莪主油重復(fù)試驗3次，記錄數(shù)據(jù)。表3-3抑菌圈大小與抑菌活性敏感程度的關(guān)系抑菌圈直徑(mm)抑菌活性敏感程度≤7.0-無菌作用7.0~9.0+低度敏感10.0~15.0++中度敏感≥15.0+++高度敏感3.4復(fù)方莪術(shù)油的質(zhì)量評價3.4.1外觀性狀取3個批次起最佳抑菌作用的復(fù)方莪術(shù)油5mL于透明的膠管中，觀察并記錄其外觀性狀、黏度等方面，并對其進行描述。3.4.2離心實驗取適量復(fù)合精油微乳液，分別置于離心管中，3000r/min下離心15min后取出，觀察復(fù)合精油是否出現(xiàn)分層或渾濁現(xiàn)象。3.4.3體驗反饋將復(fù)方配置好的莪術(shù)精油裝于5mL的透明膠管中，邀請20個易被蚊蟲叮咬的同學(xué)協(xié)助，分兩組，每組10人，A組為用藥組即被咬后涂抹復(fù)方莪術(shù)油，B組為空白對照組即被咬后涂抹蒸餾水，并請求他們配合在使用前用工具尺測出被蚊蟲叮咬腫了的部分的直徑大小以及使用復(fù)方莪術(shù)油1min、2min、3min后的直徑大小，記錄數(shù)據(jù)。4實驗結(jié)果4.1莪術(shù)鑒別和檢查結(jié)果4.1.1莪術(shù)的性狀鑒別經(jīng)觀察本實驗使用的莪術(shù)呈類圓形或卵形的厚片。外表皮灰黃色至灰棕色，有時可見環(huán)節(jié)或須根痕。切面黃綠色，偶有黃棕色，內(nèi)皮層環(huán)紋明顯，散在“筋脈”小點，對光觀察晶瑩剔透，有光澤，氣微香，味微苦而辛。因此判斷本實驗使用的莪術(shù)為廣西莪術(shù)。且經(jīng)我校中藥學(xué)院王長福教授鑒定為廣西莪術(shù)。4.1.2莪術(shù)的定性鑒別結(jié)果莪術(shù)橫切面在紫外光燈下觀察顯淡紫色熒光；在紫外光燈下，莪術(shù)水浸液顯藍紫色熒光，2mol/LNaOH浸出液顯淺黃色熒光，2mol/LHCL浸出顯深褐色熒光。4.1.3莪術(shù)紫外檢查結(jié)果表4-1廣西莪術(shù)的吸光度檢查結(jié)果廣西莪術(shù)吸光度A11.05220.94830.93540.97250.998由測定結(jié)果可知，廣西莪術(shù)的吸光度均不低于0.45，符合《中國藥典》對莪術(shù)吸光度的規(guī)定，判斷廣西莪術(shù)為合格品。4.2莪術(shù)油的制備及優(yōu)化結(jié)果4.2.1粒徑的優(yōu)化結(jié)果表4-2粉碎度對提取率的影響水平（目）得油量（mL）提取率（%）100.761.09201.011.44301.281.83401.251.78實驗結(jié)果如表4-2所示。實驗表明粉碎10目提取率為1.09%，20目提取率為1.44%，30目提取率為1.83%，40目提取率為1.78%，在實驗過程發(fā)現(xiàn)藥材適當(dāng)?shù)姆鬯橛欣谔岬綋]發(fā)油的提取率，但若粉碎得過細，底部越容易燒焦，且會產(chǎn)生較多的泡沫影響揮發(fā)油的質(zhì)量。故在優(yōu)化過程中莪術(shù)粉碎過篩應(yīng)選擇30目篩。4.2.2料液比的優(yōu)化結(jié)果表4-3投料比對提取率的影響料液比得油量（mL）提取率（%）1:60.450.901:80.891.781:100.881.761:120.871.74注：1:6指1g的莪術(shù)粉加入6倍的水量，1:8、1:10、1:12亦如此。實驗結(jié)果如表4-3所示，實驗表明料液比為1:6時的提取率為0.90%，1:8時的提取率為1.78%，1:10時的提取率為1.76%，1:12時的提取率為1.74%，隨著料液比的增加，揮發(fā)油在水中的的濃度降低，可減少藥材粉末對揮發(fā)油的吸附，有利于揮發(fā)油的提取，使揮發(fā)油提取率也增加，但當(dāng)比例到達1:10時，隨著料液比的增加，揮發(fā)油提取率增加的幅度并不明顯，故為節(jié)約資源，在優(yōu)化提取的過程中我們選擇加入8倍水量。4.2.3加熱溫度的優(yōu)化結(jié)果表4-4溫度對提取率的影響溫度（℃）得油量（mL）提取率（%）顏色1000.901.29棕黃色1101.281.83棕黃色1201.261.80墨綠色1301.301.86黑褐色實驗結(jié)果如表4-4所示，實驗表明100℃提取率為1.29%，110℃提取率為1.83%，120℃提取率為1.80%，130℃提取率為1.86%；經(jīng)過多次的調(diào)溫提取發(fā)現(xiàn)：當(dāng)溫度調(diào)節(jié)在110℃時，所提取的莪術(shù)油為棕黃色，氣味芳香，醒神通鼻；當(dāng)溫度調(diào)節(jié)在120℃左右時，所提取的莪術(shù)油為墨綠色，微有糊焦味，且圓底燒瓶底部有結(jié)塊現(xiàn)象；當(dāng)溫度調(diào)節(jié)在130℃時，所提取的莪術(shù)油為黑色，味道刺鼻發(fā)臭，且圓底燒瓶底部糊焦，猜測此時揮發(fā)油的化學(xué)成分發(fā)生了一定的變化；而當(dāng)溫度低于100℃，提取率較低，耗時較長，浪費資源。由于溫度對揮發(fā)油的質(zhì)量影響較大，使某些成分不可逆地分解轉(zhuǎn)化為其他成分，故在此實驗優(yōu)化提取的過程中我們優(yōu)先考慮提取溫度為110℃，以提取品質(zhì)良好、化學(xué)成分穩(wěn)定的莪術(shù)油。圖4-1棕黃色(110℃)圖4-2墨綠色(120℃)圖4-3黑褐色(130℃)4.3抑菌試驗結(jié)果單方精油對三種供試菌抑菌作用的實驗結(jié)果如表4-5所示：表4-5單方精油對供試菌的抑菌圈直徑大小供試菌抑菌圈直徑（mm）莪術(shù)油藿香油茶樹油迷迭香尤加利檸檬草歐薄荷天竺葵金葡117.9610.8310.2713.7813.9717.469.599.78金葡217.6810.4310.4815.6414.3217.539.549.82金葡317.7310.6710.4514.9814.2617.549.659.80曲霉111.7815.95--13.576.837.729.63曲霉212.8816.62--13.637.247.819.56曲霉314.9416.55--13.567.257.849.60大腸1大腸2大腸3表4-6單方精油對供試菌的抑菌圈平均直徑大小供試精油抑菌圈直徑（mm）莪術(shù)油金黃色葡萄球菌曲霉菌大腸埃希氏菌莪術(shù)油17.79±0.21+++13.20±2.27++-藿香油10.64±0.28++16.37±0.52+++-茶樹油10.40±0.16++--迷迭香精油14.80±1.32++--尤加利精油14.18±0.51++13.59±0.05++-檸檬草精油17.51±0.06+++7.11±0.34+-歐薄荷精油9.59±0.08+7.79±0.09+-天竺葵精油9.80±0.03+9.60±0.05+-注：“-”表示為對供試菌不起抑菌作用，“+”“++”“+++”表示精油對細菌的敏感程度。實驗表明：(1)所有的單方精油對金黃色葡萄球菌菌均起抑菌作用，其中莪術(shù)油和檸檬草精油顯高度敏感作用，茶樹油、迷迭香精油、尤加利精油顯中度敏感作用，而歐薄荷精油和天竺葵精油顯低度敏感作用；(2)除了茶樹精油和迷迭香精油對曲霉菌不起抑菌作用外，其他精油對曲霉菌均起一定的抑菌作用；其中，莪術(shù)油和尤加利精油顯中度敏感作用，檸檬草精油、歐薄荷精油、天竺葵精油顯低度敏感作用，而藿香精油則顯高度敏感作用；(3)所有的單方精油在大腸埃希菌培養(yǎng)基中都不顯抑菌圈現(xiàn)象，初步判斷所有精油對大腸埃希菌都不起抑菌作用。采用控制變量法探究莪術(shù)油含量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%時對金黃色葡萄球菌、曲霉菌兩種供試菌抑菌作用的影響。在僅改變莪術(shù)油的含量（橄欖油作為該配方中的基礎(chǔ)油視為無關(guān)變量，其在復(fù)方精油中的占比隨莪術(shù)油含量的改變而改變），在嚴格控制其他精油的量固定不變情況下，探究莪術(shù)油含量的高低對供試菌抑菌作用的影響，實驗結(jié)果如表4-7所示：表4-7各比例對供試菌的抑菌圈直徑大小莪術(shù)油含量(%)抑菌圈直徑金黃色葡萄球菌曲霉菌12312308.038.127.927.397.527.437.477.517.4648.288.288.227.597.647.5768.398.428.367.797.877.9288.568.578.497.978.127.97109.769.289.378.348.298.32128.068.428.39表4-8各比例對供試菌的抑菌圈平均直徑大小莪術(shù)油含量抑菌圈平均直徑（mm）金黃色葡萄球菌曲霉菌0%8.02±0.14+7.44±0.10+2%8.14±0.01+7.48±0.04+4%8.26±0.05+7.60±0.05+6%8.39±0.04+7.86±0.09+8%8.54±0.06+8.06±0.14+10%9.47±0.60+8.21±0.19+12%8.23±0.26+8.32±0.16+注：其他精油的固定配比參考了市場上幾種復(fù)方莪術(shù)油的成分含量以及文獻研究所得。圖4-1曲霉菌的抑菌結(jié)果圖4-2金葡萄球菌的抑菌結(jié)果注：標記a為單方莪術(shù)精油，b莪術(shù)油含量為6%，c莪術(shù)油含量為8%,，d莪術(shù)油含量為為10%，e莪術(shù)油含量為為12%。實驗表明：(1)復(fù)方精油經(jīng)過不同比例的配比后對金黃色葡萄球菌和曲霉菌都顯低度敏感作用，和各種單方精油對比，其敏感度均有不同程度的下降，對皮膚的刺激性減弱；(2)在保證其他精油不變的情況下改變莪術(shù)油的用量，隨著莪術(shù)油的含量增加，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用也增加，當(dāng)所加的莪術(shù)量為12%時，抑菌作用反而有所下降，其抑菌效果顯示和4%的用量相當(dāng)；(3)隨著莪術(shù)油的含量增加，對曲霉菌的抑菌作用持續(xù)增加。4.4復(fù)方莪術(shù)油的質(zhì)量評價結(jié)果4.4.1外觀性狀描述結(jié)果為復(fù)方莪術(shù)精油外觀澄清透明、微有香氣、黏度舒適均勻、為淡黃色的液體。4.4.2離心實驗離心結(jié)果為：離心后所得復(fù)方莪術(shù)油外觀澄清透明，無分層、絮狀物、沉淀、渾濁等現(xiàn)象，表明復(fù)方莪術(shù)油經(jīng)高速離心后能保持穩(wěn)定。4.4.3體驗反饋表4-9上藥時間對紅腫部位的影響組別直徑大小(mm)上藥前上藥1min上藥2min上藥3minA組0.930.950.920.870.870.900.910.830.490.570.560.521.561.431.010.821.331.41.411.290.530.470.470.430.720.730.670.530.710.640.450.341.481.431.411.032.640.672.420.672.070.511.760.49B組0.961.071.371.370.480.480.460.331.030.450.340.730.730.671.371.381.41.390.910.900.910.921.491.471.471.470.370.370.350.34使用SPSS22數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，結(jié)果如表4-10所示：表4-10成對樣本檢驗組別成對差分tSig.(雙側(cè))均值標準差均值的標準誤差分的95%置信區(qū)間下限上限A組上藥前–A組上藥3min0.294000.310710.098250.071730.516272.992260.01515A組上藥1min–A組上藥3min0.252000.233370.073800.085060.418943.414700.00769A組上藥2min–A組上藥3min0.146000.116260.036760.062840.229163.971330.00325在A組中，通過對比上藥前與上藥后3min叮咬部位的直徑大小發(fā)現(xiàn)P=0.02<0.05，拒絕原假設(shè)，認為使用復(fù)方莪術(shù)油前與使用后3min存在顯著差異；通過對比上藥后1min與上藥后3min叮咬部位的直徑大小發(fā)現(xiàn)P=0.01<0.05，拒絕原假設(shè)，認為使用復(fù)方莪術(shù)油1min后和3min后存在顯著差異；同理比較上藥后2min和3min叮咬部位的直徑大小發(fā)現(xiàn)P=0.003<0.05,認為使用復(fù)方莪術(shù)油2min和3min后存在顯著差異。而在B組實驗中，發(fā)現(xiàn)P>0.05，線性相關(guān)程度較弱，沒有顯著的線性變化。5實驗結(jié)論經(jīng)實驗證明，提取莪術(shù)油的最佳條件為：粒徑大小過30目，料液比為1:8，加熱溫度在110℃。在其他精油配比一定的情況下，加入10%的莪術(shù)精油配成的復(fù)方莪術(shù)油配比為橄欖油(80%)莪術(shù)油(10%)藿香油(2%)茶樹油(2%)歐薄荷油(2%)迷迭香油(1%)尤加利油(1%)天竺葵油(1%)檸檬草油(1%)所得的對金黃色葡萄球菌和曲霉菌的抑菌效果最佳，且穩(wěn)定性良好。由有效量的莪術(shù)油與其他精油復(fù)合搭配使用，具有行氣活血、消積止痛、活血化瘀、去腐生肌增強機體免疫的功能,且具有良好的殺菌抑菌作用。液體橙黃透明，攜帶、使用方便,局部無刺激性,不影響皮膚正常生理功能。實驗表明，在使用復(fù)方莪術(shù)油后，對紅腫部位的直徑大小具有正相關(guān)作用，其對叮咬部位的直徑大小的影響明顯強于蒸餾水組，且數(shù)據(jù)分析表明用藥后3min能有效防止紅腫部位的直徑大小增大，發(fā)揮明顯的藥效作用，具有消腫止癢的功效，并且在一定程度上能趨蚊蟲叮咬，緩解紅腫熱痛的癥狀。6實驗討論6.1莪術(shù)油的制備及優(yōu)化本實驗研究發(fā)現(xiàn)，不同批次、不同季節(jié)購買的生藥莪術(shù)，在同樣的提取條件下提取的莪術(shù)油的顏色、氣味、提取率均有些許差異，市場上部分的藥材在加工過程中可能會熏硫、醋制等使藥材失去其本身原始的特征、或以其他產(chǎn)地的藥材冒充道地藥材使得提取的揮發(fā)油紫色、混有難聞味道等影響揮發(fā)油的質(zhì)量，故在挑選藥材時嚴格把關(guān)，挑選優(yōu)質(zhì)的廣西莪術(shù)。藥材的粉碎粒度、浸泡時間、料液比、蒸發(fā)量與蒸發(fā)速度等都會影響揮發(fā)油的提取率，且在大量生產(chǎn)中，揮發(fā)油的提取率相對較低，若想大規(guī)模生產(chǎn)莪術(shù)油，在生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境允許的條件下，應(yīng)選用超臨界流體萃取(SFC)提取。在王地[24]研究中發(fā)現(xiàn)，正交試驗提取莪術(shù)油最佳的工藝條件為：粉碎度40~80目，加水量40倍，蒸餾時間2h，與本實驗的實驗結(jié)果相差較大，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，王地的研究中，其粉碎度幅較小，而加水量增幅相對較大，而本實驗粉碎度幅較大，加水量增幅較小，因此得出的實驗結(jié)果相差相對較大。后期可細化篩選條件，適當(dāng)?shù)馗淖兎鬯槎雀：退吭龇?，進一步探究最佳的提取工藝。6.2抑菌實驗在黃輝鋒[25]的研究中表明莪術(shù)油對大腸埃希菌也有一定的抑制作用，在經(jīng)過了反復(fù)的實驗發(fā)現(xiàn)，不僅莪術(shù)油對大腸埃希菌沒有抑菌作用，而且其他精油對大腸埃希菌也沒有預(yù)想的實驗結(jié)果。造成上述的原因可能有二：(1)所接種的大腸埃希菌活性失活，在培養(yǎng)基中根本沒有存活的細菌，莪術(shù)油乃至其他精油對大腸埃希菌有抑菌作用也無法體現(xiàn)出來；(2)在王影[22]的研究中發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌極易產(chǎn)生耐藥性，可通過重復(fù)用藥或者基因突變、基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生。但本實驗在做了大腸桿菌的產(chǎn)氣實驗的背景下斷定：供試菌仍能產(chǎn)氣，并沒有失活，故推斷此菌種可能經(jīng)過多代繁衍復(fù)制后發(fā)生基因突變、產(chǎn)生耐藥性，使莪術(shù)油等其他精油對其的抑菌作用可能消失。參考文獻國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:274-275.朱凱.中藥廣西莪術(shù)的化學(xué)成分研究[D].沈陽藥科大學(xué),2008.展曉日,曾昭武,孟凡莉,等.莪術(shù)油藥學(xué)研究進展[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,10(05):454-458.王德立.中藥莪術(shù)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(11):3240-3258.王琰,王慕鄒.中藥莪術(shù)的質(zhì)量研究[C]全國藥物分析優(yōu)秀論文交流會.1999.李瑤,吳建華,謝艷華.莪術(shù)油的研究進展[J].陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2017,40(03):118-121.ShinobuGocho,J.Antibact,AntifungAgents.1988,19(7):329-34.StammatiA,BonsiP,ZuccoF,etal.Toxicityofselectedplantvolatilesinmicrobialandmammalianshort-termassays[J].Food&ChemicalToxicology,1999,37(8):813-823.陳斌,孫克偉,劉明德,等.莪術(shù)對免疫性肝纖維化大鼠肝細胞膜功能的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2003,23(1):7-8.劉葆琴,劉雅伶.百種中藥不同溶媒浸出液的熒光鑒別[J].醫(yī)教研究,1991(1):26-28.曾慶錢,蔡岳文,嚴振,等.廣藿香精油的殺蟲作用及其活性成分分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2006,15(3):21-25.成珍.初榨橄欖油中酚醛抗菌、抗氧化和抗炎的研究進展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綜述植物精油的研究進展中藥揮發(fā)油又稱為精油，是一類在常溫下能揮發(fā)的、可隨水蒸氣蒸餾的、與水不相混的油狀液體的總稱，廣泛存在于植物藥的各個部位。近年人們對揮發(fā)油的藥理活性進行了更多的研究，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油具有抗過敏活性、酶抑制活性、抗炎活性、抗突變和抗癌活、，抗微生物活性、抗病毒活性、驅(qū)蟲活性、抗氧化活性及鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)等諸多藥理活性和用途[1]。如篙子油、丁香烯、梓檬草油對GST具有抑制作用;也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油具有抗腫瘤、抗病毒、殺蟲抗菌、降壓、消炎、平喘、止咳等作用[2]；對皮膚和結(jié)締組織、神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴循環(huán)、動靜脈循環(huán)系統(tǒng)、腦脊髓神經(jīng)組織、臟腑及內(nèi)外分泌腺及心理健康均有醫(yī)療保健功效[3]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，比如大家都比較熟悉的用于跌打損傷的白花油、紅花油，用于治療痤瘡的茶樹精油等等。而日常生活中，精油多有適宜的香味,作為添香劑、醫(yī)藥中的香料[4]或有效成分添加應(yīng)用于日用品和化妝品種，最常見的就是香水、花露水等;也會利用其揮發(fā)性強的特點，通過鼻腔、呼吸道、皮膚等進入人體，達到舒緩精神，消腫祛痛的功效，醫(yī)學(xué)之父希波克拉底曾在古雅典遭受瘟疫襲擊時，讓民眾在街頭燃燒有香味的植物，利用植物的揮發(fā)性成分，殺死空氣中的細菌，防止瘟疫擴散[5]。我國國地大物博、植物藥種類繁多，植物藥精油資源相當(dāng)豐富，為植物精油的開發(fā)利用提供了有利的條件。但是，精油作為植物精華提取物，濃度較高，直接使用多少存在皮膚刺激性，造成精油在日常中應(yīng)用的限制，且功效單一，所含成分復(fù)雜，張麗艷[6]等人對此還創(chuàng)新性地提出了利用中藥配伍的原理對具有這一類作用的植物進行復(fù)配以達到增效減毒的目的。利用多種精油復(fù)合配比，制得用途廣泛，既天然低刺激，又外觀適宜、性質(zhì)穩(wěn)定的精油成分的復(fù)方莪術(shù)油，具有相當(dāng)市場前景且滿足廣大人群需求，與市面上出現(xiàn)的莪術(shù)油有一定的競爭力。1精油的提取方法提取植物精油的方法有很多，目前主要采用水蒸氣蒸餾法、浸取法和冷壓法進行提取[7]。采用浸取法提取是，根據(jù)溶媒不同，又分為油脂吸附法、溶劑萃取法和超臨界流體萃取法[8]。在對植物精油成分及活性進行研究時，常采用水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法及超臨界流體萃取法提取精油。其中尤以水蒸氣蒸餾和超臨界流體萃取為最佳，所獲精油提取率和純度均較其他方法高。但由于超臨界流體萃取法設(shè)備屬高壓設(shè)備，投資較大，在實驗室中廣泛使用仍有一定的局限，故在實驗室中我們多用水蒸氣蒸餾法提取。水蒸氣蒸餾法提取植物精油的基本原理是油水共沸。植物精油中有許多成分，沸點各不相同，其中多數(shù)成分的沸點在100℃左右。水蒸汽蒸餾法就是利用了精油的這一特點，使與植物汁液混合的水在化成水蒸汽時帶著精油分子一起蒸發(fā)出植物表面，然后經(jīng)冷卻回流到油水分離器中，精油與水自然分層，精油浮于水層上。圓底燒瓶中損失的水分也會隨著冷凝回流的過程而得到補充，如此循環(huán)操作以提取藥材中大部分的揮發(fā)油，但最大的缺點就是溫度過高，油水接觸時間較長，揮發(fā)油成分容易遭到破壞。2精油的抑菌研究概述近幾年的研究表明，許多植物精油殺菌譜廣，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、病原真菌等均有一定的殺菌活性。其殺菌廣譜性以及強殺菌活性使其能夠開發(fā)層為消毒殺菌藥劑。侯華民、張興等人研究了植物精油的熏蒸殺菌效果[9]，發(fā)現(xiàn)植物精油具有開發(fā)成為消毒劑的潛力。廣州浩盈貿(mào)易有限公司以幾種中藥植物精油為原料研發(fā)成功空氣消毒劑[10]，可以應(yīng)用于醫(yī)院、爐管、飯店、家庭居室以及人群密集的公共場所消毒，其效果與家庭紫外小消毒法、過氧乙酸熏蒸法相當(dāng)。相比其他消毒方法和消毒藥劑，植物精油氣味芳香，對皮膚和粘膜刺激性小，具有很好的發(fā)展前景。再者，植物精油無論是一單種植物精油還是以多種植物精油混合物作為制劑，它們都具有良好的抑菌活性。另外，許多植物精油具有多種生物活性，即具有殺蟲活性，也具有抑菌活性。植物精油的這些特點為其開發(fā)利用提供了有利的條件。但植物精油中化學(xué)成分復(fù)雜多樣，而真正具有抑菌作用的化合物可能僅為其中一種或其中，各化合物間也可能存在復(fù)雜的拮抗或增效作用，這就需要對精油中的活性化合物進行分離并鑒定其結(jié)構(gòu)，為復(fù)合精油的開發(fā)提供必要的資源。抑菌實驗用于測定抑菌劑在體外抑制微生物生長的效能。雖然已報道的抑菌方法有很多,但是由于操作中的影響因素很多如植物的類型、精油提取方法的多樣性、菌體的差異性、培養(yǎng)基的差異性及培養(yǎng)條件的不同等等,因此現(xiàn)在還沒有一個統(tǒng)一的實驗操作標準。目前,精油體外抑菌的實驗方法大體上分為瓊脂擴散法和稀釋法兩種。瓊脂擴散法是抑菌實驗中最常用的方法[9]。瓊脂擴散法就是利用化合物可以在瓊脂中擴散,使化合物擴散到的地方的微生物生長受到抑制,從而出現(xiàn)透明圈,初步判斷該化合物有無抗菌活性.原理相同只是化合物載體不同.大致分為三種：濾紙片法、牛津杯法和瓊脂炔法。2.1濾紙片法將化合物溶劑滴加到濾紙片上,然后將濾紙片貼到涂有微生物的固體培養(yǎng)基上,使化合物擴散。2.2牛津杯法先在平皿底部倒一薄層水瓊脂,等凝結(jié)后放上牛津杯,再倒入混有微生物的培養(yǎng)基,凝固后將牛津杯取出,是培養(yǎng)基上形成孔,然后將化合物溶解加入到孔中,使之?dāng)U散。2.3瓊脂塊法待微生物在固體培養(yǎng)基上生長好后,將具體下方的瓊脂切塊取下,放到涂有微生物的固體培養(yǎng)基上,使化合物擴散.3植物精油的發(fā)展前景很多學(xué)者在植物精油的理化性質(zhì)、生物活性、作用機理等方面已做了不少工作,今后植物精油產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展不應(yīng)僅僅局限于傳統(tǒng)的醫(yī)藥、食品、日用化學(xué)等某一領(lǐng)域或某一方向應(yīng)用,應(yīng)走多學(xué)科、多方向