川芎及川芎中的活血作用成分對(duì)術(shù)后去負(fù)荷大鼠比目魚肌萎縮的影響

川芎及川芎中的活血作用成分對(duì)術(shù)后去負(fù)荷大鼠比目魚肌萎縮的影響

根據(jù)大量臨床數(shù)據(jù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在廢棄（不活躍、睡眠不良、航空航天等）狀態(tài)下大約10天，骨訓(xùn)會(huì)明顯減少。因此,尋找有效的預(yù)防和治療廢用性肌萎縮藥物,是臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)及航天醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域亟待解決的重要課題之一。肌梭是骨骼肌中一種感受肌肉長(zhǎng)度變化或牽拉刺激的梭形感受器,梭內(nèi)肌纖維可分為核袋與核鏈纖維兩種,核袋纖維(nuclearbagfiber)較長(zhǎng)、體積較大,赤道區(qū)有一膨大,內(nèi)含許多核故稱核袋,其代謝特點(diǎn)類似慢肌,屬氧化型纖維,核袋纖維又可分為核袋1(典型氧化型)和核袋2纖維(氧化酵解混合型),核袋1纖維是最長(zhǎng)的梭內(nèi)肌纖維,核袋2纖維是最粗的梭內(nèi)肌纖維;.核鏈纖維(Nuclearchainfibre)較短、體積較小,因細(xì)胞核沿肌纖維中軸排成鏈狀而得名,其代謝特點(diǎn)類似快肌,屬酵解型纖維。有研究表明,廢用狀態(tài)下的骨骼肌,由于肌梭的適宜刺激減少或消失,傳入中樞的沖動(dòng)減少,肌梭的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了退行性改變,能夠興奮肌梭的對(duì)抗性措施如間歇性伸展可延緩骨骼肌的廢用性萎縮。骨骼肌廢用會(huì)引起血液方面的問(wèn)題,如毛細(xì)血管內(nèi)血栓形成增加、微循環(huán)受損等可能進(jìn)一步加劇了肌肉的萎縮。因此,我們認(rèn)為能興奮肌梭的活血類藥物極有可能成為抗廢用性肌萎縮的理想藥物。我們課題組的先期研究已經(jīng)初步證實(shí)了能夠興奮肌梭的活血類藥物川芎嗪、川芎、當(dāng)歸等能不同程度地對(duì)抗大鼠比目魚肌的廢用性萎縮,但這些藥物中抗肌萎縮的藥效成分及藥效作用卻無(wú)人涉及。本研究主要對(duì)前期篩選出的川芎及川芎中起活血作用的兩種主要藥效成分(阿魏酸鈉與川芎嗪)對(duì)廢用性肌萎縮的影響進(jìn)行了比較研究,以探討川芎中抗肌萎縮的主要藥效成分及藥效作用,并從梭內(nèi)、外肌纖維MHCII型的表達(dá)水平和血液流變學(xué)角度對(duì)其抗廢用性肌萎縮的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。1方法1.1不同劑量組的劑量對(duì)主客觀的影響SD成年雌性大鼠42只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重200～235g。大鼠按體重配對(duì)原則隨機(jī)分為7組(n=6):正常對(duì)照組(CON),后肢去負(fù)荷組(HLU+W),川芎煎劑組(HLU+Lig),阿魏酸鈉高劑量組(HLU+SfH),阿魏酸鈉低劑量組(HLU+SfL),川芎嗪高劑量組(HLU+TmpH)和川芎嗪低劑量組(HLU+TmpL)。正常大鼠單籠飼養(yǎng);每日清晨后肢去負(fù)荷組按10ml/kgbw的劑量用溶媒灌胃;川芎煎劑組按1g·10ml/kgbw的劑量用川芎煎劑灌胃;阿魏酸鈉與川芎嗪的高、低劑量組分別以60mg·10ml/kgbw和30mg·10ml/kgbw的劑量用阿魏酸鈉與川芎嗪灌胃。川芎劑量的確定參照中國(guó)藥典,選取中等劑量作為川芎煎劑組;阿魏酸鈉和川芎嗪的劑量確定參照各藥品的說(shuō)明書,在臨床用藥的范圍內(nèi)選取有一定梯度的兩個(gè)劑量作為高、低劑量組。1.2藥品、藥品與藥品川芎煎劑的制備:生藥在蒸餾水中浸泡30min后中火煎1h,煎液用紗布過(guò)濾,同樣方法再次煎藥30min后過(guò)濾,兩次濾液合并,濃縮至適當(dāng)?shù)膭┝?放置于4℃冰箱中保存。川芎生藥采購(gòu)于西安市怡康醫(yī)藥超市。磷酸川芎嗪和阿魏酸鈉為商業(yè)上通用藥品。磷酸川芎嗪(Ligustrazinephosphatetablets),北京燕京藥業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H11021964。阿魏酸鈉(Sodiumferulatetablets),成都亨達(dá)藥業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H51023583。1.3懸吊籠的飼養(yǎng)大鼠尾部懸吊14天,用醫(yī)用膠布粘貼于大鼠干凈尾部的后半部,固定尾部,膠布另一頭連接在懸吊籠頂部可360°旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)接環(huán)上,保持大鼠身體與水平面呈30°,前肢著地自由活動(dòng),自由飲食飲水。大鼠單籠飼養(yǎng),懸吊籠寬30cm、長(zhǎng)35cm、高45cm,四壁為有機(jī)玻璃。飼養(yǎng)室室溫20～25℃,人工控制室內(nèi)照明,每晝夜均保持12h光照與黑暗的循環(huán)交替。1.4組織切片的制備肌肉樣品的制備:動(dòng)物經(jīng)3%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔麻醉后解剖,迅速取出左后肢比目魚肌,電子天平(Sartorius,BS210S,德國(guó))稱重、記錄(精確到0.1mg),然后取比目魚肌中段約5mm,投入4%的多聚甲醛中固定12h,接著轉(zhuǎn)移樣品到30%的蔗糖溶液中靜置3h,用O.C.T包埋劑(Tissue-Tek○R,美國(guó))于適當(dāng)?shù)臏囟认麓怪卑窠M織塊,在零下25℃的冰凍切片機(jī)(Leica,CM1850,Wetzlar,德國(guó))中以10μm的厚度連續(xù)切片,組織切片粘貼在用多聚賴氨酸(10g/L)處理過(guò)的載玻片上。血液樣品的制備:將麻醉后的大鼠胸腔打開,從心臟取血約5ml,放入肝素抗凝試管中,輕輕搖動(dòng)使血液與肝素充分混合。1.5比目魚肌的制備使用抗快肌纖維的抗體MY32(Boster,BM0096,武漢,中國(guó)),以免疫組織化學(xué)的方法分析肌纖維MHCII型表達(dá)的變化。將組織切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的山羊血清于37℃封閉30min;滴加一抗,切片于37°C下孵育2h,PBS沖洗3～5min;滴加二抗后37℃下孵育1h,PBS沖洗3～5min;滴加SABC(SABC試劑盒,Boster,SA2001,武漢,中國(guó))后37℃下孵育30min;用氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色;經(jīng)過(guò)酒精脫水和二甲苯透明后,用樹膠封片,觀察顯色反應(yīng)。比目魚肌I型和II型肌纖維的比例可以以一種肌纖維個(gè)數(shù)與總肌纖維個(gè)數(shù)的比例表示,對(duì)一個(gè)區(qū)域內(nèi)的肌纖維進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。肌纖維橫截面積的測(cè)量(每種肌纖維個(gè)數(shù)不小于100個(gè))采用Motic系統(tǒng)(MoticImagesPlus2.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.6紅細(xì)胞壓積測(cè)定將樣品血液加入到1ml的壓積管中,以3000r/min離心30min,記錄紅細(xì)胞壓積數(shù)值。另取血樣0.8ml,用粘度計(jì)(YDA-IV(C),北京,中國(guó))測(cè)量高、中、低三個(gè)切變率下的全血粘度,剩余血樣同理離心后取血漿0.8ml,測(cè)定血漿粘度。1.7單因素方差分析及組間分析用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),所有結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)的方式表達(dá)。進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)后,用Student-Newman-Keul檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析。方差不齊時(shí),運(yùn)用ANOVA-Dunnett’sT3的方法進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1術(shù)后去負(fù)荷導(dǎo)致大鼠體重下降14天造模過(guò)程中,正常對(duì)照組體重增幅最大,各造模組大鼠體重在初期均有一定的下降,從第5天起體重逐漸增加,造模結(jié)束時(shí)體重接近或超過(guò)造模前體重,各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比,14天后肢去負(fù)荷導(dǎo)致比目魚肌濕重和肌重體重比分別下降了49.8%和50.9%(P<0.01);各灌藥組使后肢去負(fù)荷大鼠比目魚肌濕重和肌重體重比有一定程度的增加,但均無(wú)顯著性差異(表1)。2.2阿魏酸鈉對(duì)iii型肌纖維橫截面積的影響14天后肢去負(fù)荷,使大鼠比目魚肌肌纖維橫截面積與正常組相比發(fā)生了極其顯著的下降(P<0.01)。與后肢去負(fù)荷組相比,高劑量的阿魏酸鈉和川芎嗪分別使I型肌纖維橫截面積增加了37.3%和39.4%(P<0.05),使II型肌纖維橫截面積分別增加了45.2%和42.4%(P<0.01);同時(shí),阿魏酸鈉低劑量組使II型肌纖維橫截面積增加了29.8%(P<0.05)。其余各組對(duì)I型和II型肌纖維橫截面積無(wú)明顯影響(P>0.05,圖1)。2.3mhciii型的表達(dá)水平根據(jù)MHC表達(dá)水平的不同,比目魚肌肌纖維可分為兩種類型,I型(陰性)與II型(陽(yáng)性)肌纖維。14天后肢去負(fù)荷使比目魚肌肌纖維MHCII型的表達(dá)水平比正常對(duì)照組增加了22.6%(P<0.01);川芎煎劑組能有效抑制后肢去負(fù)荷所引起的肌纖維MHCII型表達(dá)的增加(P<0.01),其余各灌藥組的抑制作用更加顯著(P<0.01),高、低劑量組的阿魏酸鈉和川芎嗪均使肌纖維MHCII型的表達(dá)水平接近于正常對(duì)照組(P<0.01,圖2)。2.4核鏈纖維的陰性反應(yīng)正常對(duì)照組比目魚肌肌梭內(nèi)核袋1纖維的MHCII的表達(dá)呈陰性,核袋2纖維呈陰性或弱陽(yáng)性,核鏈纖維大多呈陽(yáng)性,但也有少量肌梭中有一條核鏈纖維的MHCII表達(dá)呈陰性;與正常對(duì)照組相比,后肢去負(fù)荷使核袋2纖維MHCII的陽(yáng)性表達(dá)個(gè)數(shù)明顯增加,核鏈纖維的MHCII表達(dá)則完全轉(zhuǎn)變?yōu)殛?yáng)性,核袋1纖維的陰性反應(yīng)不變;川芎及其兩種主要藥效成分使后肢去負(fù)荷大鼠核袋2纖維MHCII的陽(yáng)性表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?對(duì)核鏈纖維MHCII的表達(dá)水平無(wú)明顯影響(圖3)。2.5灌藥對(duì)小鼠血漿粘度的影響與正常對(duì)照組相比,14天后肢去負(fù)荷使三個(gè)切變率下的全血粘度均不同程度地升高,其中低切變率下的全血粘度增加了29.1%(P<0.01),血漿粘度增加了1.8%,紅細(xì)胞壓積降低了5.1%,但均無(wú)顯著性差異;各灌藥組能降低后肢去負(fù)荷大鼠在三個(gè)切變率下的全血粘度,其中對(duì)低切變率下全血粘度降低的作用最為明顯(P<0.01,圖4);高劑量的阿魏酸鈉和川芎嗪能抑制血漿粘度升高和紅細(xì)胞壓積降低的趨勢(shì)(圖2)。3藥品中抗廢用活性成分的篩選廢用條件下,骨骼肌的形態(tài)、功能和能量代謝類型都會(huì)發(fā)生一定的變化。出現(xiàn)肌肉重量減輕、肌纖維橫截面積減少,肌肉收縮強(qiáng)度和力量降低等肌肉萎縮癥狀,且抗重力肌較非抗重力肌萎縮程度大。根據(jù)收縮特性與代謝類型的不同,骨骼肌可分為慢肌與快肌兩種,慢肌以I型肌纖維為主,主要通過(guò)有氧氧化獲取能量,快肌中II型肌纖維較多,主要通過(guò)糖酵解途徑代謝。研究證實(shí),慢肌肌纖維的肌球蛋白重鏈(MHC)主要為I型,快肌肌纖維的MHC主要為II型,比目魚肌是典型的抗重力肌(慢肌),廢用條件下,其肌纖維MHCII型的比例會(huì)明顯增加,I型肌纖維比例明顯減少,出現(xiàn)I型(氧化型)向II型(酵解型)肌纖維的轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)中,14天后肢去負(fù)荷使大鼠比目魚肌濕重、肌重體重比、肌纖維橫截面積均明顯降低,且梭外肌纖維MHCII型的表達(dá)水平顯著升高,出現(xiàn)I型向II型肌纖維的轉(zhuǎn)化,說(shuō)明后肢去負(fù)荷使大鼠比目魚肌發(fā)生了明顯萎縮。川芎中含有多種有效成分,其中阿魏酸鈉與川芎嗪具有抗血小板聚集、舒張血管、增加冠狀血管血流量等作用,是川芎中起活血作用的主要藥效成分。本實(shí)驗(yàn)中川芎及其兩種主要藥效成分均能抑制廢用引起的梭外肌纖維MHCII型表達(dá)水平的升高,高劑量的阿魏酸鈉和川芎嗪還能對(duì)抗廢用引起的I型與II型肌纖維橫截面積的減小,且低劑量的阿魏酸鈉也能對(duì)抗廢用引起的II型肌纖維橫截面積的減小,顯然,阿魏酸鈉和川芎嗪對(duì)抗廢用性肌萎縮的藥效優(yōu)于川芎,以阿魏酸鈉尤為突出。這一結(jié)果提示,川芎中抗廢用性肌萎縮的主要有效成分可能是其中起活血作用的藥效成分阿魏酸鈉和川芎嗪,且這兩種藥物在被選作抗肌萎縮藥物時(shí),應(yīng)選用較高劑量方能奏效。前已述及,骨骼肌廢用會(huì)引起毛細(xì)血管內(nèi)血栓形成增加、微循環(huán)受損以及血粘度升高等血液方面的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)中,后肢去負(fù)荷14天使大鼠在低切變率下全血粘度明顯升高,feiyon三種藥物均能顯著降低后肢去負(fù)荷大鼠的全血粘度;且高劑量的阿魏酸鈉和川芎嗪還能抑制廢用引起的血漿粘度升高和紅細(xì)胞壓積降低趨勢(shì)。顯然,三種藥物的活血化瘀作用有效地改善了廢用骨骼肌的血液灌注,協(xié)同其對(duì)紅細(xì)胞壓積的提升作用,提高了血液的運(yùn)氧能力、改善了骨骼肌的血供,從而抑制了廢用條件下肌纖維代謝類型從有氧氧化型(I)向糖酵解類型(II)的轉(zhuǎn)變,抑制了II型肌纖維比例的明顯升高,這可能是川芎及其兩種主要藥效成分阿魏酸鈉和川芎嗪對(duì)抗廢用性肌萎縮的重要機(jī)制之一。另一方面,實(shí)驗(yàn)顯示,后肢去負(fù)荷14天會(huì)引起梭內(nèi)肌纖維MHCII的陽(yáng)性表達(dá)增多,出現(xiàn)類似梭外肌的I型向