骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在犬氣管移植中誘導(dǎo)軟骨再生的實(shí)驗(yàn)研究

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在犬氣管移植中誘導(dǎo)軟骨再生的實(shí)驗(yàn)研究

用帶蒂視網(wǎng)膜包裹移植段的氣管，加速其再血管化是一種相對(duì)成熟的氣管移植方法。骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為成骨或成軟骨細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)在大網(wǎng)膜促進(jìn)氣管體再血管化的基礎(chǔ)上,將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2分別植入自體氣管段、同種異體氣管段和深低溫冷凍后的同種異體氣管段,比較其誘導(dǎo)軟骨再生的作用,進(jìn)一步探尋更可靠的氣管移植方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)藥劑選用健康成年雜種犬54只,雌性18只,雄性36只;體重18～24kg,均由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科提供。將實(shí)驗(yàn)犬隨機(jī)分為自體移植組、異體移植組、冷凍后的異體移植組,每組18只。1.1.2山-重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍骨科研究所提供。Ⅰ型膠原為胃蛋白酶消化新鮮牛腱經(jīng)純化后獲得的Ⅰ型膠原溶液,凍干保存?zhèn)溆谩?.2方法1.2.1型膠原的制備參照文獻(xiàn)方法,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2干粉63mg與I型膠原630mg溶于適量滅菌水中,持續(xù)攪拌至兩者混勻,等分為21份,凍干,環(huán)氧乙烷消毒,密封保存?zhèn)溆?每份含重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2各3mg,Ⅰ型膠原30mg。1.2.2血清體積分?jǐn)?shù)以M199為培養(yǎng)基,在潔凈工作臺(tái)內(nèi)配制冷凍液,其成分為胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為0.2,二甲基亞砜(100g/L),海藻糖(1g/L),青霉素(50mg/L),鏈霉素(50mg/L)和兩性霉素B(2.5mg/L)。1.2.3降溫處理將供體氣管放入無(wú)菌生物冷凍袋,使氣管浸沒(méi)于冷凍液中,置于4℃冰箱冷平衡4h,再于程控降溫儀的冷凍箱中程序降溫,降溫速率1℃/min,溫度降至-80℃后投入液氮中保存8周,移植前將冷凍袋從液氮中取出,置于37℃恒溫水浴箱內(nèi),輕輕搖動(dòng),使氣管段均勻快速解凍復(fù)溫備用。1.2.4發(fā)生蛋白-2/膠原緩沖溶液系統(tǒng)速眠新按0.15mg/kg體質(zhì)量肌內(nèi)注射麻醉。實(shí)驗(yàn)犬取仰臥位固定,氣管插管,機(jī)械通氣,常規(guī)消毒鋪單。沿頸部正中線做一長(zhǎng)約10cm切口,顯露頸段氣管,從環(huán)狀軟骨下第5個(gè)氣管環(huán)處起,向下切取4個(gè)氣管環(huán)的氣管段,經(jīng)生理鹽水沖洗,在青霉素和慶大霉素溶液中浸泡10min,測(cè)定氣管段管腔橫徑及前后徑,植入重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/膠原緩釋系統(tǒng),以等長(zhǎng)硅膠管作內(nèi)支撐。受體犬行腹正中切口,將氣管段包埋入大網(wǎng)膜內(nèi)。按照植入氣管段的不同分為:自體移植組、同種異體移植組及冷凍后的異體移植組。1.2.5操作和提交時(shí)間所有實(shí)驗(yàn)犬均于術(shù)后給予青霉素肌內(nèi)注射,每日2次,連續(xù)3d,接受相同喂養(yǎng),并于術(shù)后5周處死。1.3觀察指標(biāo)1.3.1動(dòng)物生存術(shù)后觀察3組實(shí)驗(yàn)犬存活狀況,死亡犬分析死亡原因等。1.3.2一般變化意外原因死亡或到預(yù)殺期的實(shí)驗(yàn)犬,均觀察移植體大體及剖面情況與大網(wǎng)膜愈合情況及腔內(nèi)黏膜等。1.3.3光鏡觀察和分級(jí)移植體用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,行蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察上皮、腺體、軟骨及環(huán)間組織,包括血腫、水腫、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、肉芽組織樣反應(yīng)、壞死和單核細(xì)胞浸潤(rùn),并按照Nakanishi等的半定量法讀片結(jié)果進(jìn)行分級(jí)。1.3.4新生軟骨面積測(cè)定用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)研制的HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)于100倍視野下測(cè)定移植體內(nèi)新生軟骨面積。將移植體縱形取材、切片,行蘇木精-伊紅染色,以每一取材部位的相鄰軟骨環(huán)間區(qū)域?yàn)闇y(cè)定區(qū),測(cè)定新生軟骨的像素面積,以每一軟骨環(huán)間5處新生軟骨的平均值作為該區(qū)的新生軟骨面積。1.3.5堿性磷酸酶檢測(cè)取各標(biāo)本重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/膠原緩釋系統(tǒng)植入?yún)^(qū)組織各一塊,按文獻(xiàn)方法,徹底消除標(biāo)本表面軟組織,稱(chēng)重、搗碎,加入2ml生理鹽水勻漿,離心10min(10000r/min)。取上清液0.5ml在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定堿性磷酸酶水平,以標(biāo)本濕質(zhì)量為除數(shù),求得堿性磷酸酶的含量(U/mg)。取上述離心沉淀物用0.3mol/L的鹽酸消化,用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鈣含量,以標(biāo)本濕質(zhì)量為除數(shù),求得標(biāo)本鈣含量(mg/g)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,統(tǒng)計(jì)方法使用方差分析及t檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2結(jié)果2.1一般實(shí)驗(yàn)狗各組均未發(fā)生麻醉、手術(shù)意外,都存活到預(yù)殺期,僅異體移植組2只、冷凍后的異體移植組1只術(shù)后1周內(nèi)有呼吸道刺激表現(xiàn)。2.2鞋塊的表面結(jié)構(gòu)各組標(biāo)本大致相同,標(biāo)本被大網(wǎng)膜包繞而成一較大組織塊,表面血管清晰,大網(wǎng)膜與氣管外壁形成緊密粘連,所有標(biāo)本無(wú)軟化塌陷,按壓彈性良好,軟骨環(huán)結(jié)構(gòu)完整。以上移植體剖面肉眼下均未見(jiàn)到新生軟骨。2.3異體移植的原因自體移植組:移植體黏膜上皮大部脫落,管腔無(wú)狹窄,氣管軟骨無(wú)明顯變性、壞死,腔內(nèi)少量肉芽組織增生;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2植入?yún)^(qū)可見(jiàn)到分化良好的軟骨細(xì)胞和新生軟骨組織,細(xì)胞外基質(zhì)豐富,周?chē)罅块g充質(zhì)細(xì)胞聚集。異體移植組:移植體固有結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,黏膜上皮完全脫落,肉芽組織向腔內(nèi)增生伴瘢痕化,有大量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn),多數(shù)血管出現(xiàn)栓塞,單核細(xì)胞出現(xiàn)在栓塞血管及其周?chē)＼浌黔h(huán)外膜部分破壞吸收,暴露的軟骨組織受到炎性細(xì)胞浸潤(rùn),軟骨細(xì)胞變性壞死,細(xì)胞溶解吸收,軟骨基質(zhì)部分吸收;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2植入?yún)^(qū)可見(jiàn)較多成熟軟骨細(xì)胞聚集,周?chē)纬上莞C,軟骨基質(zhì)較豐富,偶見(jiàn)新生軟骨細(xì)胞壞死。冷凍后的異體移植組:大體觀察與自體移植組移植體相似,鏡下見(jiàn)移植體黏膜上皮脫落消失,少量肉芽組織增生,未見(jiàn)明顯單核細(xì)胞浸潤(rùn),軟骨膜完整;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2植入?yún)^(qū)可見(jiàn)到分化良好的軟骨細(xì)胞和新生軟骨組織,新生軟骨細(xì)胞核較大,細(xì)胞外基質(zhì)豐富,周?chē)鸀槔w維血管組織,其間大量間充質(zhì)細(xì)胞聚集,軟骨膜下可見(jiàn)散在新生軟骨細(xì)胞。2.4組結(jié)果比較自體移植組、異體移植組、冷凍后的異體移植組半定量法組織學(xué)評(píng)分分別為1.68±0.27、5.57±0.72、1.93±0.24,3組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.717,P<0.001)。兩兩比較(SNK法),自體移植組、冷凍后的異體移植組與異體移植組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),自體移植組與冷凍后的異體移植組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.5組結(jié)果比較自體移植組、異體移植組及冷凍后的異體移植組新生軟骨像素分別為2573.6±738.4、1691.3±743.6及2482.9±27.5。3組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.711,P<0.05)。兩兩比較(SNK法),自體移植組、冷凍后的異體移植組與異體移植組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),自體移植組與冷凍后的異體移植組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.6自體移植組比冷凍后的異體移植組的鈣含量自體移植組與冷凍后的異體移植組堿性磷酸酶水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),自體移植組比冷凍后的異體移植組的鈣含量高(P<0.05);自體移植組、冷凍后的異體移植組與異體移植組相比,無(wú)論堿性磷酸酶水平還是鈣含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。3骨形態(tài)發(fā)生蛋白在細(xì)胞移植中的表達(dá)用帶蒂大網(wǎng)膜包繞移植體氣管的手術(shù)方法仍存在因移植段內(nèi)軟骨吸收導(dǎo)致軟化性狹窄的缺點(diǎn),最終引起移植失敗。李小飛等首次利用骨形態(tài)發(fā)生蛋白誘導(dǎo)氣管移植體內(nèi)軟骨再生,提出了“生物彈性支架”的方法,取得一定效果,但實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn):骨形態(tài)發(fā)生蛋白在氣管移植體內(nèi)能夠誘導(dǎo)軟骨再生,但是新生軟骨量少,不足以從根本上克服移植體的軟骨吸收造成的軟化性狹窄。本實(shí)驗(yàn)將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2分別植入自體氣管段、同種異體氣管段和深低溫冷凍后的同種異體氣管移植段后,再將氣管移植段移位植入腹腔大網(wǎng)膜內(nèi),在這種相對(duì)簡(jiǎn)單而一致的動(dòng)物模型上,通過(guò)比較研究為氣管內(nèi)的軟骨再生尋求一種理想的成骨微環(huán)境,為氣管移植應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一類(lèi)廣泛分布于動(dòng)物骨組織中的低分子量酸性多肽,具有異位誘導(dǎo)成骨及成軟骨的作用。單純骨形態(tài)發(fā)生蛋白植入體內(nèi)很快降解吸收,誘骨活性得不到有效發(fā)揮,所以應(yīng)用合適的緩釋載體對(duì)于充分發(fā)揮骨形態(tài)發(fā)生蛋白的誘骨活性非常重要。本實(shí)驗(yàn)考慮到氣管的特殊結(jié)構(gòu)及術(shù)中的易操作性,選用膠原作為載體,膠原是利用胃蛋白酶從牛腱中提取的有機(jī)成分,無(wú)明顯抗原性,可降解吸收,膠原的三維結(jié)構(gòu)可限制骨形態(tài)發(fā)生蛋白的自由擴(kuò)散,從而在骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/膠原復(fù)合物植入?yún)^(qū)持續(xù)地保持一定濃度的骨形態(tài)發(fā)生蛋白釋放,可產(chǎn)生較單純骨形態(tài)發(fā)生蛋白更加明顯的新骨生成。本實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)植入大網(wǎng)膜的移植體血供豐富,結(jié)構(gòu)保持良好。通過(guò)對(duì)新生軟骨面積和反應(yīng)成骨量的堿性磷酸酶水平、鈣含量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在自體、異體及冷凍后異體氣管移植體內(nèi)均可誘導(dǎo)軟骨再生。但在相同的條件下,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在自體和冷凍后異體氣管移植體內(nèi)誘導(dǎo)出的新生軟骨比異體氣管移植體明顯多,這與組織學(xué)觀察結(jié)果一致,我們發(fā)現(xiàn)移植段氣管結(jié)構(gòu)的完整性與其新生軟骨量密切相關(guān),其原因可能與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2所處的成骨微環(huán)境極大地影響著它的作用效果有關(guān)。氣管移植體本身存在早期缺血,會(huì)有部分組織壞死,局部炎癥反應(yīng)較重。而在異體氣管移植中還存在排斥反應(yīng),排斥反應(yīng)不但會(huì)加重炎癥反應(yīng),而且還導(dǎo)致新生血管的栓塞和破壞,使成骨微環(huán)境更加惡化,所以骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在異體移植中誘導(dǎo)出的新生軟骨較少。降低移植物自身的抗原性是控制免疫排斥反應(yīng)的最佳手段。隨著深低溫冷凍技術(shù)的發(fā)展,冷凍后的組織可以保持其原有活性和結(jié)構(gòu)完整性,并能消減其抗原性,這既解決了供體的保存問(wèn)題,又解決了移植后免疫排斥反應(yīng)的控制問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)觀察到在深低溫冷凍后的同種異體移植組中,鏡下移植氣管結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)有單核細(xì)胞浸潤(rùn),而單核細(xì)胞浸潤(rùn)是與同種異體移植物引起的免疫排斥反應(yīng)密切相關(guān)。因此我們認(rèn)為深低溫冷凍降低了氣管的免疫原性,從而明顯減弱了受體犬的排斥反應(yīng),改善了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的成骨微環(huán)境,使其成軟骨量明顯高于未經(jīng)處理的異