腫瘤淋巴管新生機(jī)制研究進(jìn)展

腫瘤淋巴管新生機(jī)制研究進(jìn)展

腫瘤的轉(zhuǎn)移是其重要的生物學(xué)特征之一，也是難以完全治愈的主要原因。許多腫瘤可以通過血管和淋巴管擴(kuò)散，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通常是腫瘤患者最重要的預(yù)后因素。腫瘤相關(guān)的淋巴管為腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位進(jìn)入局部淋巴結(jié)以及遠(yuǎn)處器官提供了導(dǎo)管通路,人們過去曾經(jīng)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移是一個(gè)被動過程,而現(xiàn)在已經(jīng)明確腫瘤與淋巴管的相互影響直接促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此,明確腫瘤淋巴管新生的分子機(jī)制將會有助于腫瘤分子靶向治療的研究,并應(yīng)用于抗腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的治療。1免疫因子參與局部生成的細(xì)胞在胚胎時(shí)期,淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞以“出芽”(sprouting)的方式從靜脈中分化出來。研究發(fā)現(xiàn),在小鼠胚胎第9天時(shí),主靜脈的背外側(cè)細(xì)胞過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Sox18,進(jìn)一步誘導(dǎo)Prox1的表達(dá),在胚胎第10天左右,表達(dá)Prox1的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞從主靜脈處出現(xiàn)并向背側(cè)遷移,從而形成最初的淋巴結(jié)構(gòu)-淋巴囊,在淋巴囊形成后,淋巴管通過“出芽”進(jìn)一步擴(kuò)張,逐漸形成成熟的淋巴脈管系統(tǒng)。另外,淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的“出芽”不僅僅局限于主靜脈,在外周的局部血管中也發(fā)現(xiàn)了“出芽”現(xiàn)象。除了出芽的形式,也有一些研究發(fā)現(xiàn)在外周淋巴管及淋巴囊表面的新生淋巴管并非起源于靜脈,而是由成淋巴管細(xì)胞(lymphangioblast)分化并進(jìn)一步發(fā)育而形成,Wilting等發(fā)現(xiàn)在鳥胚胎的中胚層組織中存在Prox1+/VEGFR-3+的成淋巴管細(xì)胞,這些細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)參與了鳥翅膀新生淋巴管的生成。腫瘤淋巴管新生的機(jī)制比較復(fù)雜,新生淋巴管可能是先前存在的淋巴管通過“出芽”的方式產(chǎn)生,也可能是來源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞參與形成,甚至某些細(xì)胞能夠直接轉(zhuǎn)化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。腫瘤組織內(nèi)缺氧的微環(huán)境能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌一系列生長因子,其中VEGF-C在誘導(dǎo)淋巴管的生長過程中起著重要的作用,受VEGF-C等生長因子的影響,淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞開始增殖,逐漸形成“出芽”,生成新的淋巴管。除了通過“出芽”的方式,來源于骨髓的循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞也參與了新生淋巴管的形成。1997年,Asahara等首先從外周血中分離出了CD34+/VEGFR-2+的內(nèi)皮祖細(xì)胞,這些細(xì)胞可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,出生后,血管內(nèi)皮祖細(xì)胞主要位于骨髓,在血管損傷、組織缺血和腫瘤發(fā)生等病理狀態(tài)下,血管內(nèi)皮祖細(xì)胞可在細(xì)胞因子的作用下從骨髓動員到外周血循環(huán)中,參與局部組織的血管新生。2003年,Salven等從胎兒肝中分離出了CD34+的細(xì)胞,其中VEGFR3+的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD133,CD34+/VEGFR3+/CD133+細(xì)胞可以分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,提示這些細(xì)胞可能是淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞,此后,關(guān)于淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究逐漸增多,有研究表明,淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞參與了腫瘤淋巴管新生的過程,例如Tawada等建立綠色熒光蛋白(GFP)小鼠骨髓移植模型,在小鼠胃黏膜下接種胃腺癌細(xì)胞,3周后在胃癌周圍組織發(fā)現(xiàn)了LY-VE-1陽性的新生淋巴管,其中合并有明顯的GFP陽性的細(xì)胞,這表明骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞參與了胃腺癌淋巴管的生成。Lee等在注射了來源于骨髓podoplanin+細(xì)胞的小鼠黑色素瘤模型中檢測到淋巴管密度顯著升高,因此,他們認(rèn)為podoplanin+細(xì)胞能夠起到淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用。Bogos等發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌病人血液中CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞顯著增多,并與腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而,He等卻認(rèn)為,與腫瘤血管新生的機(jī)制不同,腫瘤新生淋巴管并非來源于內(nèi)皮祖細(xì)胞,而是由預(yù)先存在的淋巴管通過出芽的方式形成。因此,內(nèi)皮祖細(xì)胞是否參與了腫瘤淋巴管新生還需要進(jìn)一步研究。除了以上兩種方式,巨噬細(xì)胞在一定條件下也能直接轉(zhuǎn)化為表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的內(nèi)皮祖細(xì)胞,從而進(jìn)一步分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,一些腫瘤動物模型也證實(shí)了巨噬細(xì)胞參與了腫瘤相關(guān)的淋巴管新生。2采用定量分析方法的腫瘤淋巴結(jié)活檢腫瘤內(nèi)部缺氧的微環(huán)境能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌多種淋巴管生成因子,從而促進(jìn)新生淋巴管的生成,腫瘤新生淋巴管僅由單層淋巴內(nèi)皮細(xì)胞組成,與新生血管相比,其基底膜不完整,缺乏肌層,管壁更薄,因此,腫瘤細(xì)胞更易侵入新生的淋巴管,經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié),并向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。另外,新生的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)多種趨化及黏附因子,進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤分期的一個(gè)重要內(nèi)容,是腫瘤患者重要的預(yù)后指標(biāo),早期發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有助于制定最佳的臨床治療方案。目前,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤新生淋巴管的形成與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。定量分析腫瘤相關(guān)的新生淋巴管將有利于發(fā)現(xiàn)早期的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),一些評估腫瘤淋巴管新生的參數(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床及實(shí)驗(yàn)研究,包括淋巴管密度(lymphaticvesseldensity,LVD)、淋巴管侵犯、淋巴管生成因子水平等。其中LVD是最常用的評估腫瘤淋巴管新生的參數(shù),過去的大量研究證實(shí)LVD與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān),LVD可以客觀地評估腫瘤內(nèi)新生淋巴管的分布,有利于判斷腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后情況,因此,LVD的定量分析將會是一種很有應(yīng)用前景的檢測腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法。目前定量檢測腫瘤LVD的研究方法大多是Weidner等提出的免疫染色計(jì)數(shù)方法或Chalkley點(diǎn)重疊形態(tài)測定法,但是這兩種計(jì)算方法均需要人工選擇腫瘤組織淋巴管豐富的“熱點(diǎn)”區(qū)域,而對“熱點(diǎn)”的選擇需要專業(yè)的訓(xùn)練以及檢查者的經(jīng)驗(yàn),因此,這兩種計(jì)數(shù)LVD的方法最大的缺點(diǎn)就是主觀性較強(qiáng),各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性較差。最近JoannaNiemiec等的實(shí)驗(yàn)室使用了一種計(jì)算LVD的新方法-distributionofpodoplaninstainedvessels(DPV),這種方法不需要選取“熱點(diǎn)”區(qū)域,只需要在至少有一個(gè)淋巴管的視野內(nèi)計(jì)數(shù)淋巴管的比例。相對于前面兩種方法,后者更省時(shí),重復(fù)性更好,并且因?yàn)槟[瘤內(nèi)的淋巴管相對比較稀少,所以更適合腫瘤內(nèi)部的淋巴管計(jì)數(shù)。既往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)新生淋巴管存在于腫瘤內(nèi)部或腫瘤周圍,在頭頸部的惡性腫瘤、黑色素瘤、異種移植瘤等過表達(dá)淋巴管新生因子的腫瘤模型中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了增殖的瘤內(nèi)淋巴管的存在,并且發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)淋巴管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而,在口腔癌及喉癌等腫瘤模型中雖然發(fā)現(xiàn)了瘤內(nèi)的新生淋巴管,但是,瘤內(nèi)的新生淋巴管密度卻與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Padera等通過對瘤內(nèi)淋巴管進(jìn)行四種不同方法的功能試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)它們不具備正常淋巴管的功能,并且在小鼠的前列腺癌模型中,抑制瘤內(nèi)淋巴管新生卻并不能阻止腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而功能性的淋巴管僅存在于腫瘤邊緣,也就是說,腫瘤邊緣的淋巴管對于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散更為重要。Olszewski等在結(jié)腸癌腫瘤內(nèi)部僅發(fā)現(xiàn)極少量的已被壓縮的淋巴管,但是卻檢測到大量微小的、不規(guī)則的、橢圓或圓形的密閉的“湖”,并推測正是因?yàn)槟[瘤內(nèi)部缺乏通暢的淋巴管,因此從毛細(xì)血管滲出的液體不能被排出,所以才形成了充滿組織液的“湖”,因此,腫瘤細(xì)胞通過瘤內(nèi)淋巴管擴(kuò)散似乎也不太可能,相反,腫瘤外周的淋巴管往往呈擴(kuò)張的狀態(tài),其中充滿了腫瘤細(xì)胞群。另外,原發(fā)瘤的位置是否靠近預(yù)先存在的小淋巴管對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也很重要,如果腫瘤發(fā)生在毛細(xì)淋巴管豐富的組織,比如皮膚中,那么它將更容易發(fā)生淋巴管新生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,毛細(xì)淋巴管受到VEGF-C的誘導(dǎo),可以通過“出芽”的方式向著腫瘤方向生長,這說明了腫瘤周圍的淋巴管在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了更為重要的作用。總之,腫瘤與新生淋巴管之間相互影響,腫瘤細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)淋巴管的新生,而新生淋巴管又能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,評估淋巴管新生的一些參數(shù)在相關(guān)的臨床及基礎(chǔ)研究中起著重要作用,找到更客觀、更統(tǒng)一、并更容易操作的衡量這些參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)將是以后相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及方法改進(jìn)的方向之一,這將能夠更好地促進(jìn)腫瘤淋巴管新生的研究。腫瘤外周的淋巴管可能為功能性的淋巴管,其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了更為重要的作用,而腫瘤內(nèi)部的淋巴管是否是功能性淋巴管目前仍有爭議,需要將來進(jìn)一步研究。3vegf-c信號途徑在胚胎淋巴管新生中的作用VEGF-C是VEGF家族的重要成員之一,其基因位于人類染色體4q34上,編碼一種含419個(gè)氨基酸殘基的蛋白,相對分子量為46900。VEGF-C通過與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的膜型酪氨酸激酶受體VEGFR-3結(jié)合后,通過一系列復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo),最終引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)淋巴管生成,并且影響淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的分子表達(dá),VEGF-C/VEGFR-3信號途徑在淋巴管新生中起著重要的作用。在胚胎10.5天左右,頸靜脈周圍的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)VEGF-C,從而形成淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞出芽。對基因敲除鼠的研究進(jìn)一步揭示了VEGF-C/VEGFR-3信號途徑的重要作用,在VEGF-C基因敲除的小鼠胚胎10.75天左右,Prox1+的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞大量聚集在總主靜脈,但是,在主靜脈以外的區(qū)域卻檢測不到Prox1+的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,說明淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞不能從主靜脈中遷出從而形成淋巴囊。而且,在新生小鼠體內(nèi)注射重組腺病毒編碼的VEGFR-3-Ig,結(jié)果導(dǎo)致其淋巴管的完全缺失,這表明了VEGF-C/VEGFR-3信號途徑在胚胎淋巴管新生中起著重要的作用。大量動物模型揭示了VEGF-C/VEGFR-3信號途徑在腫瘤淋巴管新生中的重要作用,包括乳腺癌、黑色素瘤、纖維肉瘤、結(jié)腸癌、肺癌等在內(nèi)的大量動物模型均證實(shí)了VEGF-C能夠促進(jìn)腫瘤淋巴管新生、并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞沿淋巴管轉(zhuǎn)移。在乳腺癌的同源模型中,Shibata等采用小干擾RNA技術(shù)抑制VEGF-C的表達(dá)能夠抑制淋巴管新生,減少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移。Shi等建立人胰腺癌細(xì)胞系B×PC-3裸鼠動物模型,經(jīng)VEGF-CShRNA處理后檢測腫瘤組織中VEGF-C的表達(dá)和D2-40標(biāo)記的腫瘤淋巴管密度,結(jié)果證實(shí)VEGF-CShRNA能明顯抑制VEGF-C的表達(dá),同時(shí)腫瘤組織內(nèi)淋巴管密度明顯減少。Huang等采用RT-PCR技術(shù)檢測子宮內(nèi)膜癌動物模型中的VEGF-CmRNA,發(fā)現(xiàn)在腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤模型中,腹膜后淋巴結(jié)中的VEGF-CmRNA水平較無腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯升高,說明VEGF-C在子宮內(nèi)膜癌的腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起著重要作用,或可以作為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的預(yù)測因子。除了動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?VEGF-C/VEGFR-3與腫瘤淋巴管新生的關(guān)系在臨床病理研究中也得到了驗(yàn)證,在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等患者的腫瘤標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)VEGF-C不僅能夠促進(jìn)腫瘤淋巴管新生及腫瘤細(xì)胞的淋巴管轉(zhuǎn)移,并且能夠作為判斷腫瘤臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物。Tanaka等分析了106例已行食管癌根治術(shù)的食管鱗癌患者,發(fā)現(xiàn)腫瘤分期在Ⅱb-Ⅳa的患者VEGF-C水平表達(dá)高于分期在0-Ⅱa的患者,依據(jù)VEGF-C表達(dá)水平分成兩組分析,發(fā)現(xiàn)VEGF-C高表達(dá)者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯高于低表達(dá)者。綜上所述,VEGF-C/VEGFR-3反應(yīng)軸不僅能夠促進(jìn)腫瘤淋巴管新生,而且可促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,在腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移通路中起著至關(guān)重要的作用。4sdf-1和cxcr4在腫瘤組織轉(zhuǎn)移中的作用SDF-1是CXC趨化因子家族成員之一,也被稱為CX-CL12,CXCR4是其特異性受體之一,由352個(gè)氨基酸構(gòu)成,α螺旋跨膜7次。SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸通過SDF-1與其受體CXCR4特異性結(jié)合,激活下游信號通路,發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。SDF-1和CXCR4在許多器官如肝臟、肺、腎、腦、心臟等均有廣泛地表達(dá),過去的大量研究證實(shí)SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸不僅介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)、還能夠調(diào)控造血干細(xì)胞遷移及歸巢、參與胚胎發(fā)育過程等,當(dāng)發(fā)生缺氧、中毒或者放射損傷時(shí),大量的組織通過增加CXCL12的分泌及表達(dá)來招募CXCR4陽性的干細(xì)胞或祖細(xì)胞到達(dá)需要組織再生的位置,這表明CXCL12還可以作為一個(gè)緊急的救助信號來開始引起組織的再生及修復(fù)。最初,在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中首先發(fā)現(xiàn)了SDF-1及其同源受體CXCR4在B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及組織定位中起著重要的調(diào)控作用,隨后,關(guān)于SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸與腫瘤相關(guān)的研究逐漸成為熱點(diǎn),包括乳腺癌、肺癌、腎癌、腦癌及各種類型白血病等在內(nèi)的超過75%的腫瘤,CXCR4在其腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移過程中均起著至關(guān)重要的作用,并且,SDF-1/CXCR4還能夠直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的血管新生,SDF-1不僅通過與CXCR4相互作用從而刺激腫瘤生長,還能夠招募內(nèi)皮祖細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位從而促進(jìn)腫瘤血管新生。SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸在腫瘤淋巴管新生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。研究表明,缺氧能夠誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)SDF-1的表達(dá),同時(shí)上調(diào)腫瘤細(xì)胞CXCR4的表達(dá),腫瘤新生淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞分泌SDF-1,利用SDF-1/CXCR4信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管。Kim等研究發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞LECs能夠通過分泌SDF-1促進(jìn)表達(dá)CXCR4的黑色素瘤細(xì)胞淋巴遷移,而Zhuo等經(jīng)過對54個(gè)不同類型腫瘤組織標(biāo)本的檢測,發(fā)現(xiàn)其中50個(gè)樣本的LVD與SDF-1的水平呈陽性相關(guān),并且通過基質(zhì)膠體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SDF-1能夠直接促進(jìn)淋巴管生成,而并不依賴VEGF-C/VEGFR-3信號通路。另外,SDF-1能夠促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化遷移,在小鼠乳腺癌動物模型中發(fā)現(xiàn)SDF-1的抑制劑能夠明顯減少轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量,表明SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸能夠直接促進(jìn)腫瘤淋巴管新生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)SDF-1可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF,VEGF反過來可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面的SDF-1/CXCR4表達(dá),而阻斷SDF-1/CXCR4軸可以起到抑制VEGF依賴的血管形成作用,這表明SDF-1和VEGF在促進(jìn)血管產(chǎn)生過程中有協(xié)同作用。同樣,Zhuo等發(fā)現(xiàn)VEGF-C能夠特異性地上調(diào)CXCR4的表達(dá),并且VEGF-C/VEGFR-3與SDF-1/CXCR4能夠共同促進(jìn)淋巴管形成,兩者亦具有疊加效應(yīng)。5sdf-1/cxcr4分子靶向治療作為最主要的淋巴管生成調(diào)控因子,針對VEGF-C/VEGFR-3反應(yīng)軸的靶向治療研究較多,Karpanen等發(fā)現(xiàn)正常組織的淋巴管存活并不僅僅依靠VEGFR-3的功能,這表明腫瘤部位的淋巴管生長能夠被選擇性的靶向抑制,而不影響正常組織的淋巴管存活。大量的研究通過抗VEGFR-3的小分子抑制劑或單克隆抗體,或利用RNA干擾技術(shù)抑制VEGFR-3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)阻斷VEGF-C/VEGFR-3通路能夠抑制腫瘤的淋巴管