六味地黃丸血清藥物化學(xué)研究

六味地黃丸血清藥物化學(xué)研究

基于傳統(tǒng)的藥物化學(xué)方法，總結(jié)和應(yīng)用了中國藥物化學(xué)的各種現(xiàn)代技術(shù)，對中藥治療后的血清中移行成分進(jìn)行了分析，并確定了藥物效應(yīng)的相關(guān)性。確定中醫(yī)特定功能的應(yīng)用學(xué)科。應(yīng)用本方法已經(jīng)成功地完成了茵陳蒿湯的生物藥學(xué)研究,首次闡明了該復(fù)方的作用機(jī)理;進(jìn)行了地黃血清藥物化學(xué)的初步研究。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了六味地黃丸的血清藥物化學(xué)研究。六味地黃丸出自宋朝錢乙《小兒藥證直訣》,是“滋陰補(bǔ)腎”之首方,現(xiàn)臨床上廣泛用于多種疾病的治療。目前,對六味地黃丸的成分及藥效研究較多,但有關(guān)的成分研究大多只限于成分的定性、定量的分析,針對藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究很少;有關(guān)藥效的研究也多只集中在免疫調(diào)節(jié)作用方面。六味地黃丸在體內(nèi)以何種成分、何種形式發(fā)揮作用以及作用機(jī)理如何,至今少有明確的研究報(bào)道。因此,有必要對六味地黃丸的血中移行成分進(jìn)行詳細(xì)的分析,闡明其血中移行成分、代謝產(chǎn)物及方劑的配伍意義,從而有的放矢地改善其生產(chǎn)工藝,提高制備水平,提高臨床療效。1實(shí)驗(yàn)材料1.1umproeWaters高效液相色譜儀(Waters600Controller,Waters600Pump,Waters996PhotodiodeArrayDetector);WaterSymmetryShieldC18色譜柱(3.9mm×150mm,5μm);Nova-PakC18Guard-Pak保護(hù)柱;80-2型離心機(jī);H66MC型超聲震蕩儀;sk-1型快速混勻器。1.2素lognin對照品丹皮酚(Paeonol)對照品(中國生物制品藥品檢定所提供);馬錢素(Loganin)對照品(南京中醫(yī)藥大學(xué)提供);熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉(均購于哈爾濱市人民藥店,經(jīng)鑒定為正品);乙腈,色譜級(美國迪馬(Dikma)試劑公司);其余試劑為分析純。1.3動(dòng)物健康Wistar大鼠,體重為200±20g,6周齡,雌雄不限,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2實(shí)驗(yàn)方法2.1對照品溶液的制備按藥典六味地黃丸處方稱取藥材,采用2000年版藥典方法分別制成六味地黃丸、缺味六味地黃丸及單味丸,各稱取1g,用10ml甲醇超聲提取15min(2次),濾過,合并濾液,濾液干燥后加入甲醇定容為10ml,溶液過0.45μm微孔濾膜即得;另精密稱取丹皮酚及馬錢素對照品1mg,分別置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度搖勻得丹皮酚及馬錢素對照品溶液;上述各樣品液供HPLC分析使用。2.2相同濃度的0.2法律-pcr的相互混懸液對大鼠肝門靜脈內(nèi)部的吸附量的影響取Wistar大鼠,禁食12h(自由飲水),按照1.5ml/100g體重,分別灌胃給予蒸餾水、六味地黃丸、缺味六味地黃丸及單味丸的甲醇提取物的混懸液,給藥60min后用1%戊巴妥鈉麻醉,經(jīng)肝門靜脈取血5ml,血液在3000r/min條件下離心10min,取上清液1ml,加入0.2ml70%高氯酸,快速搖勻,3000r/min條件下離心10min,取上清液過0.45μm微孔濾膜,備HPLC分析。2.3酶pak-pak保護(hù)柱WaterSymmetryShieldRP18色譜柱(3.9mm×150mm,5μm);Nova-PakC18Guard-Pak保護(hù)柱;柱溫30℃;流速為1ml/min;檢測波長200～400nm掃描;流動(dòng)相乙腈-0.15%磷酸梯度洗脫:0/100?→????0～60min12/88?→?????60～130min30/700/100→0～60min12/88→60～130min30/70。2.4建立hplc分析取10批六味地黃丸供試品溶液,以及5批六味地黃丸血清樣品在相同的色譜條件下進(jìn)行HPLC分析,建立HPLC色譜圖,并比較分析確定進(jìn)入血液的成分。并通過缺味六味地黃丸及單味丸及其血清樣品的分析測定,對相應(yīng)的色譜圖進(jìn)行比較分析,確定入血成分的來源藥物。3復(fù)方配伍山基層黨組織所含成分的檢測結(jié)果3.1六味地黃丸給藥后血中出現(xiàn)了11個(gè)移行成分(圖1),與體外樣品比較,其中七個(gè)為體外成分直接吸收入血,即1、2、4、5、7、10、11號峰為六味地黃丸中所含的原型成分,且1號峰轉(zhuǎn)運(yùn)入血后的相對含量有較大的提高,而11號峰卻明顯下降;3、6、8及9號峰為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。經(jīng)與六味地黃丸、空白血清及單味生藥比較分析確定入血成分的來源為:1號峰的歸屬較為復(fù)雜,來源于三種生藥。首先,熟地中含有此成分,此成分在六味地黃丸和熟地中含量均很低,但是吸收入血后此成分的相對含量大大提高,表明復(fù)方配伍后其有較強(qiáng)的血中轉(zhuǎn)移能力(圖2);其次,在除去熟地的樣品給藥后,血清中仍然出現(xiàn)1號峰,表明其他藥材在體內(nèi)對1號峰的產(chǎn)生也有貢獻(xiàn);山茱萸和澤瀉中雖不含有此成分,但給藥后血中也能產(chǎn)生該峰(圖略),經(jīng)光譜分析表明與六味地黃丸血清中的1號峰為同一成分,所以推測山茱萸和澤瀉中所含的物質(zhì)被代謝后共同產(chǎn)生該成分?？梢?復(fù)方中三種生藥對血中同一成分1號峰有共同貢獻(xiàn),表明熟地配伍山茱萸和澤瀉的必要性及復(fù)方配伍的科學(xué)性。2、4、5、10號峰為山茱萸所含成分直接入血而形成,經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照表明5號峰為來源于山茱萸的馬錢素;7和11號峰為牡丹皮中所含成分直接入血而形成(圖3),經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照表明11號峰為來源于牡丹皮中的丹皮酚;3、6、8、9號峰為丹皮酚的代謝產(chǎn)物(圖4,圖5)。所以,血清樣品中丹皮酚峰較體外樣品中明顯下降。丹皮酚被吸收入血后,其代謝產(chǎn)物量較大,具有產(chǎn)生藥效的可能性,或許具有更強(qiáng)的生理活性。從3、6、8、9號峰的保留時(shí)間和UV光譜推測可能為丹皮酚的脫甲氧基代謝物、葡萄糖醛酸或膽汁酸的結(jié)合體。3.2本研究初步闡明了六味地黃丸的體內(nèi)部分化學(xué)成分,其結(jié)果已能在某種程度上闡明該方配伍機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本文僅報(bào)道血清中有紫外吸收成分的情況,血中成分的分離及鑒定、研究結(jié)果將另報(bào)。綜合研究結(jié)果將對六味地黃