藥用植物蜘蛛香總草三酯的富集工藝研究

藥用植物蜘蛛香總草三酯的富集工藝研究

蜘蛛虱主要分布在中國(guó)西南少數(shù)民族地區(qū)。根和根是治療腹部腫脹和疼痛、嘔吐和腹瀉的藥物。其主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi),環(huán)烯醚萜成分中纈草三酯類(lèi)化合物是抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、解痙等藥效成分之一。在提取工藝研究基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)篩選大孔吸附樹(shù)脂型號(hào),并通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)選其純化工藝。制備的纈草三酯提取物,較文獻(xiàn)報(bào)道的纈草三酯類(lèi)提取物純度高,且操作簡(jiǎn)便,可作為抗腫瘤藥、抗抑郁藥研發(fā)的醫(yī)藥中間體,同時(shí)為蜘蛛香資源的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1子天麻的測(cè)定UV1100型紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司),UPT-I-10T型優(yōu)譜超純水器(成都超純科技有限公司),BS124S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。HPD-600,AB-8,HPD300,S-8,ADS-8型大孔樹(shù)脂(成都亞榮生化設(shè)備有限公司),纈草三酯對(duì)照品(成都植標(biāo)化純生物有限公司,批號(hào)110756-200110,純度>98%),蜘蛛香(采自湖北省恩施州利川市福寶山,經(jīng)湖北民族學(xué)院中藥鑒定教研室朱敏英教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根莖和根),試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取適量纈草三酯,用無(wú)水乙醇溶解配制成0.1096g·L-1的對(duì)照品貯備液。分別吸取該貯備液0.5,1,1.5,2,2.5mL置于10mL量瓶中,用無(wú)水乙醇定容至刻度,搖勻,配制成系列對(duì)照品溶液。以無(wú)水乙醇作空白,于256nm處測(cè)吸光度(A)。以A為縱坐標(biāo),纈草三酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),得回歸方程Y=31.427X+0.0372(r=0.9992),線性范圍0.00548～0.0274g·L-1。2.2無(wú)水乙醇用量的提取稱(chēng)取蜘蛛香粉末5g,置具塞錐形瓶中,加50mL無(wú)水乙醇浸泡1h,超聲提取3次,每次30min,合并提取液,過(guò)濾,用無(wú)水乙醇定容至50mL,搖勻,即得。2.3沖洗脫液、活化大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24h,濕法裝柱。用95%乙醇沖至洗脫液澄清,用水沖洗至洗脫液無(wú)醇味;用2BV5%HCl浸泡3h左右,按4～6mL·min-1流速?zèng)_洗,用水沖洗至中性;用2BV2%NaOH浸泡3h,以4～6mL·min-1流速洗柱,用水沖洗至中性,備用。2.4中心樹(shù)脂吸附草三酯解吸能力的測(cè)定稱(chēng)取預(yù)處理好的5種大孔吸附樹(shù)脂(HPD-600,AB-8,HPD-300,S-8,ADS-8)各15g,濕法裝柱,分別吸取等量蜘蛛香提取液過(guò)柱,進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。至吸附均勻時(shí),停止上樣,記錄上樣液體積。用水沖洗樹(shù)脂柱,收集所有沖洗液,定容,計(jì)算蜘蛛香總纈草三酯吸附量依次為7.19,7.83,7.63,6.28,7.50mg·g-1;吸附率分別為89.10%,97.02%,94.50%,77.8%,92.90%。用95%乙醇100mL洗脫至洗脫液近無(wú)色,收集洗脫液并定容至100mL。各精密量取0.2mL,揮干溶劑,用無(wú)水乙醇定容至10mL,測(cè)定蜘蛛香總纈草三酯洗脫量分別為7.10,5.10,6.31,5.74,7.16mg·g-1;洗脫率依次為98.7%,65.1%,82.7%,91.4%,95.5%。綜合考慮,ADS-8型大孔樹(shù)脂對(duì)蜘蛛香總纈草三酯的吸附和解吸能力相對(duì)較好。吸附量=(母液質(zhì)量濃度-濾液質(zhì)量濃度)×溶液體積/干樹(shù)脂質(zhì)量;吸附率=(母液質(zhì)量濃度-濾液質(zhì)量濃度)/母液質(zhì)量濃度×100%;洗脫量=洗脫液質(zhì)量濃度×洗脫液體積/干樹(shù)脂質(zhì)量;洗脫率=解吸量/吸附量×100%2.5單因素試驗(yàn)2.5.1最大上樣量的確定稱(chēng)取ADS-8型大孔樹(shù)脂10g,濕法裝柱,加蜘蛛香提取液(4.23g·L-1)上柱,流速1mL·min-1,收集流出液,每10mL收集1份,共收集12份,測(cè)定A,吸附曲線見(jiàn)圖1,故確定最大上樣量42.3mg·g-1。2.5.2總草三酯含量測(cè)定a稱(chēng)取已吸干表面水分的ADS-8型樹(shù)脂4份,每份10g,準(zhǔn)確加入蜘蛛香提取液20mL,用等量水洗脫,考察流速為1,2,4,8mL·min-1對(duì)蜘蛛香總纈草三酯純化工藝的影響,收集流出液,測(cè)定A,測(cè)定總纈草三酯含量。結(jié)果總纈草三酯吸附量分別為7.25,8.29,8.02,6.59mg·g-1,吸附率依次為85.7%,97.9%,94.8%,77.9%,故選擇上樣流速2mL·min-1。2.5.3總草三酯含量的測(cè)定精密量取蜘蛛香提取液5,10,15,20mL,分別稀釋定容至50mL。稱(chēng)取已吸干表面水分的ADS-8型樹(shù)脂4份,每份5g,分別浸泡于上述4份提取液中,置于20℃恒溫水浴箱,每間隔30min振蕩1min(60次/min),1h后抽濾,制成總纈草三酯制備液,測(cè)定A,計(jì)算總纈草三酯含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨上樣液質(zhì)量濃度的提高,吸附率上升,當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為1.692g·L-1時(shí),吸附率最高,隨后上樣質(zhì)量濃度上升吸附率反而下降,故確定上樣質(zhì)量濃度1.692g·L-1(生藥質(zhì)量濃度0.035g·mL-1)。2.5.4醇洗脫總草三酯取已處理備用的ADS-8型樹(shù)脂20g,濕法裝柱,吸取蜘蛛香提取液20mL上柱,分別用體積分?jǐn)?shù)為10%,20%,30%,50%,70%,80%,95%的乙醇溶液50mL以2.0mL·min-1的流速洗脫,收集洗脫液,測(cè)得總纈草三酯質(zhì)量分別為0.134,1.025,2.013,19.458,8.469,2.468,0.092mg;得率依次為0.40%,3.05%,5.98%,57.81%,25.16%,7.33%,0.27%。結(jié)果顯示,30%乙醇洗脫液中總纈草三酯含量較低,70%乙醇洗液不能完全洗脫總纈草三酯成分,而95%乙醇洗脫時(shí),其含量顯著減少。因此,洗脫溶劑確定為先用30%乙醇洗脫除雜,后用95%乙醇溶液洗脫。2.5.5總草三酯供試品溶液的制備稱(chēng)取ADS-8型樹(shù)脂20g裝柱,加1.692g·L-1蜘蛛香提取液20mL上柱,待吸附均勻,用適量水和30%乙醇100mL沖洗至流出液近無(wú)色,用95%乙醇洗脫至洗脫液無(wú)色,收集洗脫液,每20mL為1個(gè)流份,共收集10份,揮干,制成總纈草三酯供試品溶液,測(cè)定A,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,當(dāng)收集至第6份時(shí),洗脫液中總纈草三酯含量已降至較低水平,故認(rèn)為此洗脫劑120mL(6BV)即可將總纈草三酯洗脫完全。2.6香提取液的制備稱(chēng)取蜘蛛香藥材粉末3份,每份20g,超聲提取,得蜘蛛香提取液。按優(yōu)選的純化工藝富集總纈草三酯,進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果總纈草三酯平均收率26.12%(RSD2.56%),平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)51.38%(RSD3.12%)。3提取溶劑的選擇考察上樣流速時(shí),隨流速的升高,其吸附率降低,可能是由于纈草三酯分子擴(kuò)散速率較慢,與樹(shù)脂接觸不充分,使大量纈草三酯類(lèi)來(lái)不及與ADS-8型樹(shù)脂交換吸附而發(fā)生泄漏。纈草三酯類(lèi)成分極性較小,脂溶性較強(qiáng),因此用30%乙醇洗脫,可在保證不洗脫目標(biāo)成分的前提下將水溶性雜質(zhì)盡可能除去,從而最大限度富集目標(biāo)成分。纈草三酯屬環(huán)烯醚萜類(lèi)成分,遇酸堿易分解,對(duì)熱不穩(wěn)定,同時(shí)在無(wú)水三氯甲烷和無(wú)水乙醇中較穩(wěn)定