第三章 細胞生物學研究方法1

第三章

細胞生物學研究方法顯微鏡---細胞學說電子顯微鏡與分子生物學結合，細胞生物學才能有今天的發(fā)展。結構與功能（動態(tài)特征）；細胞的生命活動；實驗科學與實驗技術——細胞真知源于實驗室第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法

光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)一、光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)最早的光學顯微鏡是1590年Janssen和他的侄子共同研制的。其后，RobertHooke和Leeuwenhoek對光學顯微鏡的分辨本領進行了極大的改進，由此發(fā)現(xiàn)了細胞。20世紀30年代發(fā)展起來的電子顯微鏡導致細胞結構和功能研究發(fā)生了一次革命，使生物學家得以從亞顯微水平上重新認識細胞。光學和電子顯微鏡成像原理不管是何種顯微鏡，鏡像的形成都需要三個基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)。透射●焦距與角孔徑焦距(focallength)是透鏡的中心平面到焦點的距離，而角孔徑(angularaperture)是光從樣品進入顯微鏡的物鏡半角α，因此角孔徑實際表示有多少光離開樣品通過透鏡。角孔徑越大，透過透鏡的信息越多分辨率:透鏡最重要的性質就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式計算:R=0.61λ/nSinα其中:n=聚光鏡和物鏡之間介質的折射率.空氣為1.油為1.5;α=樣品對物鏡角孔徑的半角，sinα的最大值為1;λ=照明光源的波長。0.61是一個恒定的參數(shù)，表示成像的點雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度。從上式可知，角孔徑越大，進入物鏡的光越多；介質的折射率越大，則數(shù)值孔徑越大，這些都可以使分辨率提高。由于分辨率表示的是能夠區(qū)別兩個點間最近距離的能力，所以R值越小，分辨率越高。從分辨率的表達式來看，或者波長越短，分辨率越高。

分辨極限(limitresolution)與放大率(magnification)對可見光來說，能清楚地分辨出相鄰兩點之間的最小間隔是0.2μm，稱之為分辨極限。最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率?？偡糯舐?/p>

=物鏡放大率×目鏡放大率，放大率同樣受分辨極限的限制。一般來說，光學顯微鏡的最大放大率只能是透鏡的數(shù)值孔徑的1000倍。由于透鏡的數(shù)值孔徑的范圍是1.0-1.4，所以光學顯微鏡在用空氣作介質時最大放大倍數(shù)為1000倍，用油鏡則為1400倍。增大角孔徑或縮短波長可提高光學顯微鏡的分辨率。如果用波長比普通波長短得多的電子波代替光波，分辨率可大大提高，電子顯微鏡就是在這種需求下被發(fā)明的。表電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領光源透鏡真空光學顯微鏡300nm可見光玻璃透鏡不需真空200nm(油鏡)可見光玻璃透鏡不需真空100nm紫外光玻璃透鏡不需真空電子顯微鏡0.1nm電子束電磁透鏡真空1、

常用的光學顯微鏡光學顯微鏡(lightmicroscope)是光學顯微技術的主要工具，自問世以來已有400多年歷史。光學顯微鏡是利用光線照明，使微小物體形成放大影像的儀器?，F(xiàn)今使用的光學顯微鏡都是由幾個透鏡組合而成，所以又稱為復合顯微鏡。普通雙筒顯微鏡比較高級的顯微鏡上都設有傾斜式的雙目鏡筒。在物鏡轉換器上方裝有四個棱鏡，使經過物鏡的光線平分為兩路到達目鏡，故雙筒顯微鏡的亮度要比單筒者為暗。雙筒顯微鏡的優(yōu)點為同時用兩眼觀察，有較強的立體感?；緲嬙欤汗鈱W放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機械和支架系統(tǒng)石蠟切片技術熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）熒光顯微鏡的工作原理是利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強烈的紫外線光源，通過照明設備把顯微固定的切片或活染的細胞透視出來。熒光顯微鏡原理

相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)相差顯微鏡在結構上進行了特別設計，尤其是光學系統(tǒng)有很大的不同，可用于觀察未染色的活細胞。相差顯微鏡是能將物體本身的相位差轉換為振幅差的顯微鏡。在普通光鏡下觀察標本時，是靠顏色（波長）和亮度（振幅）的差別而看到被檢物體的結構，而活細胞近于無色透明，光波通過不吸收光，振幅變化不大，故人眼感覺不到，為解決這一難題，30年代（1934—1935）荷蘭物理學家Zernike設計制造出相差顯微鏡，并用此而獲1953年諾貝爾獎。

相差顯微鏡的光學部件及光線通路相差顯微鏡觀察的活細胞■暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器使照明光線不能進入物鏡被放大，在黑暗的背景下呈現(xiàn)明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以觀察未經染色的活體或膠體粒子。暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，分辨不清內部的微細構造，適合于觀察活細胞內的細胞核、線粒體、液體介質中的細菌和霉菌等。暗視野顯微鏡的光學倒置顯微鏡倒置顯微鏡的結構組成與普通顯微鏡一樣，所不同的只是它的物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過來。前者置于載物臺之下，而后者在載物臺的上方。集光器與載物臺之間的工作距離提高?？梢苑胖门囵B(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器，直接對培養(yǎng)的細胞進行照明和觀察。光學顯微鏡的樣品制備與觀察由于大多數(shù)細胞的成分不影響光線的穿透，無法形成反差，所以在一般光學顯微鏡下，幾乎看不清未經處理的細胞。為了看清細胞內含物，就必須對細胞樣品進行一些特殊的處理，為此建立和發(fā)展了樣品的各種制備技術。

樣品的固定(fixation)目的:

生物組織在染色前先進行固定的目的是殺死細胞，穩(wěn)定細胞的化學成份，并且使樣品硬化以便在進一步的處理和切片時不會受到破壞做法:

樣品固定的最簡單做法是將樣品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等處理過程中移位或丟失而產生人工假象。一般用具有緩沖作用的醛類固定液，用甲醛或戊二醛作固定劑，能夠與蛋白質的游離氨基形成共價鍵，從而將鄰近的蛋白質分子牢固地交聯(lián)在一起。包埋和切片樣品制備的第二步是將固定的組織制備成切片。樣品首先要被包埋在介質中，通常用液態(tài)的石蠟或樹脂做包埋劑，使之滲入整塊組織，然后將之硬化成固體的包埋塊；用專門的切片機切割包埋塊，制備成薄切片。適用于光學顯微鏡觀察的切片厚度為

l-10μm。染色(staining)大多數(shù)細胞總重量的70%是水，對可見光幾乎是透明的，只有很少的內含物不透光。染色的目的就是給細胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征。19世紀初，發(fā)現(xiàn)某些有機染料可染生物組織，并對細胞特殊部位的著色具有選擇性。如蘇木精對負電荷分子有親和性，能顯示出細胞內核酸的分布；酸性染料如伊紅可使細胞質染色；蘇丹染料在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪著色。但對許多染料的特異性染色機理尚不清楚。

激光共焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）

原理

應用： 排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構樣品的三維結構。2、電子顯微鏡技術

自從第一臺電子顯微鏡在德國誕生以來，取得飛躍發(fā)展并在生物學領域中得到廣泛的應用。利用電鏡可以觀察到各種病毒的形態(tài)結構以及細胞器的微細結構，還能觀察到許多生物大分子。目前的電鏡已由單純的形態(tài)描述進入了成分分析、定性和定量分析。此外，將電鏡與計算機連用，對圖象進行信息處理也取得了很大進展。

總之，電鏡已成為研究生物學的有力工具，必將發(fā)揮越來越大的作用。1932年德國學者MaxKnolls和ErnstRuska發(fā)明了第一臺電子顯微鏡，開拓了超微世界，發(fā)現(xiàn)了許多光鏡下看不到的結構，如細胞膜、線粒體、細胞核、高爾基體、中心粒等細胞器的細微結構。將在光學顯微鏡中觀察不到而只能在電子顯微鏡下觀察的結構稱為亞顯微結構(submicroscopestructure)，或超微結構(ultrastructure)。在種類上，電鏡可分為兩大類:透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差光鏡與電鏡的主要區(qū)別：（1）光源不同：光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同：光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空（4）顯示記錄系統(tǒng)透射電子顯微鏡(TEM)透射電子顯微鏡主要是讓電子束穿透樣片而成像。電子顯微鏡基本結構由三大部分組成∶電子光學系統(tǒng)(鏡筒)、真空系統(tǒng)、電子學系統(tǒng)(供電系統(tǒng))。電子光學系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機等組成。由于電子顯微鏡必需在高度真空條件下進行工作，陰極與陽極之間會放電，燈絲也會因受到氧化或被陽離子轟擊而縮短壽命，所以設計了真空系統(tǒng)。電子學系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。電鏡(透射電鏡)與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造

掃描式電子顯微鏡

1940年，英國劍橋大學首先試制成功掃描電子顯微鏡。直到1965年，才有英國劍橋科學儀器有限公司生產出實用性強的商品掃描電鏡。由于掃描電鏡具有顯著的優(yōu)點，因此，幾十年來，已廣泛應用于生物學、醫(yī)學、古生物學、地質學、化學、物理學、電子學以及勘察、冶金，機械與輕工業(yè)等領域，成為十分有用的研究工具。

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。主要電鏡制樣技術

超薄切片

負染色技術

冰凍蝕刻技術

電鏡三維重構技術

超薄切片技術取材—前固定(4%戊二醛)-PBS洗殘余的戊二醛后固定(4°C,鋨酸)--脫水(乙醇或丙酮包埋(環(huán)氧樹脂)修片切片(600埃，銀色)染色(醋酸鈾與鉛鹽)觀察

●負染色(negativestainning)一些生物大分子組成的結構，如病毒、線粒體基粒、核糖體和蛋白質組成的纖維等可以通過負染色電鏡技術觀察其精細結構，還可以從不同角度觀察三維結構。

負染原理：又稱陰性反差染色，借助染色劑的襯托，增加背景對電子的散射，使樣品相對地透過較多的電子，最后在熒光屏上形成暗背景下的“亮像”。●冰凍斷裂復型和冰凍蝕刻是專門觀察樣品外表面的投影復型術一、顯微鏡的種類及原理5.透射電子顯微鏡；6.掃描電子顯微鏡能否用掃描電鏡來觀察樣品的內部結構，而用透射電鏡來觀察樣品的表面結構？冰凍蝕刻技術電鏡三維重構技術3、掃描遂道顯微鏡掃描隧道顯微鏡由IBM公司瑞士蘇黎世研究所的兩位學者BinningG.和RohrerH.等在1981年發(fā)明的具有原子顯像力的顯微鏡，是根據(jù)量子力學中的隧道效應原理而制成的。這種顯微鏡對生物、物理、化學等學科均有推動作用，可用于研究表面的原子結構和電子結構，故于1986年獲得了諾貝爾物理學獎。

特點：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復雜計算，且分辨本領高。（側分辨率為0.1-0.2nm，縱分辨率可達0.01nm）；（2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。（4）可連續(xù)成像，進行動態(tài)觀察

用途：納米生物學研究領域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結構。掃描隧道顯微鏡DNA雙螺旋結構的建立是根據(jù)X射線衍射結果推導出來的，至今還沒有直接觀察DNA結構的方法，所以對其中的微細結構還不夠了解。用STM觀察了DNA的雙螺旋結構，見到

DNA分子上的大溝和小溝，并且了解DNA的結構隨染色體長度而異。第二節(jié)細胞組分的分析方法離心分離技術細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯示方法特異蛋白抗原的定位與定性細胞內特異核酸的定位與定性放射自顯影技術定量細胞化學分析技術核酸分子雜交技術一、離心分離技術離心分離細胞組分是最常用的分離方法，因為不同的細胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物。差速離心：分離密度不同的細胞組分。密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離?！癫钏匐x心(differentialcentrifugation)主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。差速離心密度梯度離心二、細胞內核酸、蛋白質、

酶、糖與脂類等的顯示方法原理：利用一些顯色劑與所檢測物質中一些特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量。DNA特異性的顯示方法Feulgen反應：利用酸水解去除細胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應呈紫紅色。多糖的顯示方法PAS（過碘酸希夫氏）反應利用過碘酸的強氧化作用破壞糖分子的C-C鍵，使糖分子氧化產生雙醛基，自由的醛基與希夫試劑作用形成紫紅色產物。脂類物質的顯示方法對脂類物質的染色應用的是物理的擴散原理。蘇丹類染料是脂溶性染劑，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當含有脂肪的標本與蘇丹染料接觸時，它會脫離酒精而溶于脂類結構中從而顯色。細胞中各種酶的顯示方法由于酶易受外界條件影響而變性失活。對酶的顯示一般采取間接的方法進行，對可以與酶發(fā)生特異性結合的底物進行染色從而達到顯示酶的目的。在實驗的過程中需在盡量保持酶的活性。三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有