第六章 基因工程及其應(yīng)用(克隆)10

基因工程及其應(yīng)用

GeneticEngineeringandItsApplication

將基因進(jìn)行克隆，利用克隆的基因表達(dá)、制備特定的蛋白質(zhì)（多肽）或定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法和相關(guān)工作統(tǒng)稱(chēng)基因工程（geneticengineering）。

Geneswerecloned,usingtheclonedgeneexpression,preparationofspecificproteins(peptides)ormodifiedgenestructureorientedmethodsisusedingeneticengineering基因工程中最主要的工作（技術(shù)）是基因克?。╣enecloning），也稱(chēng)分子克?。╩olecularcloning）、重組DNA（recombinantDNA）。挑出所要群落得到純系轉(zhuǎn)殖菌株大量培養(yǎng)生產(chǎn)人類(lèi)胰島素HumanInsulin探針

Probe互補(bǔ)

DNA專(zhuān)一性抗體送入宿主細(xì)菌基因接入載體目標(biāo)基因剪接基因工程Dolly---theworld'smostfamoussheepGender:

FemaleBreed:

MammalBirthday:

1996/7/5Homeplace:

ScotlandFather:

Nofather

Mother:

ThreemothersDeath:

2003/2/14克隆（Clone）---

來(lái)自同一始祖的相同拷貝的集合。分子克隆細(xì)胞克隆

個(gè)體克隆

(動(dòng)物/植物)基因克隆(分子克隆、DNA克隆、基因重組）

gene（DNA）

cloningBergandCohenBiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972Berg----第一個(gè)重組體構(gòu)建Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻(xiàn)ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro．

Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973宣布體外構(gòu)建的細(xì)菌質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá).第一個(gè)有功能重組體的構(gòu)建Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻(xiàn)

不同的酶切片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌后能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組連接形成有功能的重組質(zhì)粒。這一結(jié)果也提示，如果能夠在體外重組成功，并能將重組體引入細(xì)胞內(nèi)，同樣具有生物學(xué)功能。Significances：１.setupbridgesamongdifferent

biologicalspeciesandrealizegenetalk;２.shortenevolutionunits;３.accordingtohumanwill.基因克隆Genec

cloningDNAcloning

DNAcloningistoplacearelativelyshortfragmentofagenome,whichmightcontainthegeneorothersequenceofinterest,inanautonomouslyreplicatingpieceofDNA,knownasa

vector,formingrecombinantDNA,whichcanbereplicatesindependentlyoftheoriginalgenome,andnormallyinotherhostspeciesaltogether.PropagationofthehostorganismcontainingtherecombinantDNAformsasetofgeneticallyidenticalorganism,oraclone.ThisprocessiscalledDNAcloning.古埃及一具木乃伊的一個(gè)DNA片段已經(jīng)得到克隆打開(kāi)了人們窺探過(guò)去的窗戶(hù)面臨的問(wèn)題Questions:

：基因操作和轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用面臨倫理、生物安全等一系列的問(wèn)題。

itisconfrontedwithaseriesofquestionsreferringtoethicandbiologicalsecurityintheapplicationofgenemanipulationandtransgenetechnology.第一節(jié)

分子克隆中常用工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA連接酶

DNA聚合酶ⅠTaqDNA聚合酶

逆轉(zhuǎn)錄酶

堿性磷酸酶

末端轉(zhuǎn)移酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶

restriction

endonuclease

是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此水解其雙鏈dsDNA內(nèi)部特異位點(diǎn)—磷酸二酯鍵的核酸酶。

.

Restrictionenzymeandmodificationmethylasewerethoughttorecognizethesamenucleotidesequenceandtogetherformarestriction-modification(R-M)system.

anaturaldefensemechanismofbacteriatoagainsttheintroductionofforeignDNAintothecell與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類(lèi)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）識(shí)別特性：具有雙鏈對(duì)稱(chēng)的回文結(jié)構(gòu)

(palindrome)

↓

GGATCCCCTAGGⅡ型酶(TypeII

Restrictionendonuclease)a只有酶切活性而無(wú)甲基化修飾作用.

cutDNAmolecularinspcificalplaces.nomodification.b以?xún)?nèi)切方式水解磷酸二酯鍵,需mg2+.

Hydrolyzephosphatebackbonewithinrecognition.

RequireMg2+.C切割位點(diǎn)嚴(yán)格、精確；識(shí)別序列呈回文結(jié)構(gòu)，通常為4、6堿基；產(chǎn)生’粘端和鈍端’切口末端。

recognizeandcutspecificsymmetricalsequence.Mostrecognitionsequencesare6bp.Yieldbluntendorsticky5`-or3`-end.

BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口：平端切口、粘端切口Restrictionsequences5’protrudingends3’protrudingendsCohensiveends特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制性?xún)?nèi)切酶

同裂酶（isoschizomers）又稱(chēng)異源同工酶：從不同原核生物中分離出來(lái)的具有相同識(shí)別位點(diǎn)，切割位點(diǎn)可以相同，也可以不同的酶。

isolatedfromdifferentprokaryotes

haveidenticalrestrictionsequences

haveidenticalordifferentdigestionsites同功異源酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶Isocaudaners:有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱(chēng)為同尾酶。

havedifferentrestrictionsequencesbutproduceidenticalcohesiveendsBamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG+A

+TCTAG

GATCTA同尾酶Isocaudaners:可變酶

識(shí)別DNA順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的,并且識(shí)別序列超過(guò)6個(gè)堿基對(duì).

Thesizeofrestrictionsequencesismorethan6bpswithatleastonevariablebase.

BstpI:GGTNACC

N為可變堿基內(nèi)切酶命名原則：第一個(gè)字母（大寫(xiě)，斜體）代表該酶微生物（寄主菌）的屬名。Genus第二、三字母（小寫(xiě)，斜體）代表微生物的種（系）名。

speciesHindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed流感嗜血桿菌d株的第三種酶接下來(lái)的字母代表微生物的株和型。

strainandtype如果從一種菌中發(fā)現(xiàn)多種限制酶，則根據(jù)發(fā)現(xiàn)順序用羅馬字母表示。I、II、III

微生物名稱(chēng)酶名稱(chēng)識(shí)別序列

BacillusamyloliquefaciensHBamhⅠG↓GATCC

解淀粉芽孢桿菌

BacillusglobigilBglⅡ

A↓CATCT

球芽孢桿菌

EscherichiaColiRY13EcoRⅠG↓AATTC

大腸桿菌

HaemophilusinfluenzaeHindⅢA↓AGCTT

流感嗜血菌

Providenciastuartii164PstⅠCTGCA↓G

普羅威登細(xì)菌

StreptomycesalbusSalⅠG↓TCGAC

白色鏈球菌應(yīng)用中的問(wèn)題

限制性?xún)?nèi)切酶廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

Restrictionendonucleasehasbeenusedinallfieldsofmolecularbiologystudy.Somequestionsofitsapplication二.DNA連接酶（DNAligase）

可催化雙鏈DNA相鄰堿基5，磷酸和3`羥基間形成磷酸二酯鍵。因而可以把兩個(gè)DNA分子連接在一起.DNAligasescatalyzeformationofaphosphodiesterbondbetweenthe5'phosphateofonestrandofDNAandthe3'hydroxyloftheanother.ThisenzymeisusedtocovalentlylinkorligatefragmentsofDNAtogether.

T4噬菌體DNA連接酶T4DNAligase

：

①催化兩個(gè)獨(dú)立DNA片段5`-P和3`-OH之間形成磷酸二酯鍵

Catalyzingtheformationofaphosphodiesterbondbetweenjuxtaposed5'phosphateand3'hydroxylterminiinduplexDNAorRNA②修復(fù)雙鍵DNA中一條鏈上的缺口。

repairingsinglestrandednicksinduplexDNA,RNAorDNA/RNAhybrids.

③反應(yīng)需要ATP提供能量.requiresATPasenergy三、DNA聚合酶（DNApolymerase）1.大腸桿菌DNA聚合酶ⅠEscherichiaColi

DNApolymeraseⅠ：

5`-3`聚合酶活性polymeraseactivity

5`-3`外切酶活性

exonucleaseactivity

3`-5`外切酶活性exonucleaseactivity

Applications:

DNA缺口平移反應(yīng)制備探針

DNAnicktranslationinordertoproduceprobes;

cDNA第二鏈的合成

cDNAsecondchainsynthesizingDNA3`末端的標(biāo)記

DNA3`endtagging;DNA測(cè)序DNAsequencing

。

Klenow片段(Klenowfragment)

：

DNAPolI的大片段.具有5`-3`聚合酶活性，

3`-5`外切酶活性。thelargefragmentofDNAPolI.5`-3`polymeraseactivity3`-5`exonucleaseactivity

3TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase：耐熱DNA聚合酶，在70-75℃具有最佳活性，但缺乏3`-5`外切酶活性。主要用于PCR反應(yīng)。TaqDNApolymeraseisatitsbestactivityat70-75℃,butitlacks3`-5`exonucleaseactivity.ItismostlyusedinPCR.4、逆轉(zhuǎn)錄酶Reversetranscriptase(RT)

以RNA為模板合成DNA合成的DNA產(chǎn)物稱(chēng)為互補(bǔ)DNA（complementaryDNA，cDNA）。anenzymethatfunctionsasaRNA-dependentDNApolymerase.

threeactivities:

5`-3`polymeraseactivity

5`-3exonucleaseactivity

3`-5`exonucleaseactivity(3`---5`exonucleaseactivity---RNaseHactivity)

常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有禽類(lèi)成骨細(xì)胞性白血病病毒（Avianmyeloblastosisvirus，AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶

Moloney小鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus(mo-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶。

第二節(jié)分子克隆中常用的載體（vector）載體（vector）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)的分子叫做載體（vector）。載體的本質(zhì)是DNA。Inmolecularbiology,avectorisanyvehicleusedtotransferforeigngeneticmaterialintoanothercellorhostcell.

.

Cloningvectors:

tocloneageneinavectorExpressionvectors:

toexpressagenefromavectorTypesofvectorsGeneralfeaturesofaVectorAutonomouslyreplicatingDNAindependentofhost’sgenome.2.Containsatleastoneselectivemarker,whichallowshostcellscontainingthevectortobeselectedamongstthosewhichdonot.

3.Containsamultiplecloningsite(MCS)

（MCSisashortsegmentofDNAwhichcontainsmany(usually20+)restrictionsites-astandardfeatureofengineered.

4.Easilytobeisolatedfromthehostcell

5.Expressionvectors:

allowingtheexogenousDNAtobeinsertedandexpressed.PromoterandenhancerterminatorforRNAtranscriptionarerequired.

表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。PlasmidvectersBacteriophagevectorsCosmidsEukaryotic

virusvectorvectors質(zhì)粒載體（plasmidvectors

）

獨(dú)立于染色體外的遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA分子組成。

Plasmidsaredouble-strandedgenerallycircularDNAsequencesthatarecapableofautomaticallyreplicatinginahostcell.

多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記AmppolylinkerMultiplecloningsitesMultiplerestrictionsitesenabletheconvenientinsertionoftargetDNAintoavectorAmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites,

多科隆位點(diǎn)）LacpromoterlacZ’…ACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA….ThrAsnSerSerValProGlyAspProLeuGluSerThrCysArgHisAlaSer…EcoRISacIKpnISmaIXmaIBamHIXbaISalIHincIIAccIPstISphILacZSelectivemarkers:

twinantibioticresistance

blue-whitescreeningExample:ampR

geneencodingtheenzymeb-lactamasewhichdegradespenicillinantibioticssuchasampicillin;kanRforkanamycin.載體上的篩選標(biāo)記----大腸桿菌LacZ基因

LacZ基因編碼半乳糖苷酶.用含有X-gal的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，在細(xì)菌的乳糖操縱子誘導(dǎo)物異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用下，細(xì)菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落變?yōu)樗{(lán)色；如果LacZ基因被外源DNA分子的插入而破壞，則不能生成相應(yīng)的半乳糖苷酶，菌落為白色。通過(guò)藍(lán)白菌落的觀察，能方便的進(jìn)行基因克隆的篩選工作。LacZgeneTheLacZgeneencodesβ-galactosidase.ItisanIPTG-inducibleβ-galactosidasegenewhosespatialprofileofitsexpressionintargetcellscanbedemonstratedbyX-gal.WheninducedwithIPTG,plaquesformedbyvectorsturnbluewithX-gal,whereasthosewithclonedDNAinsertsremaincolorless.Thus,clonedinsertswillbefoundonlyinclearpaquesthatdonotturnbluewithX-gal.lacZencodeenzyme

b-galactosidase

IPTGX-gallacpromoter

BlueproductbackX-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal2.Bacteriophagevector從λ噬菌體顆粒中分離出的DNA分子為雙鏈線狀,dsDNA,lineargenome其末端分別具有突出的12bp的互補(bǔ)單鏈,是天然的粘性末端,稱(chēng)COS位點(diǎn).12bpcomplementsinglechain.naturalcohensiveend(COSsite)插入型Insertionvectors

DNAProtein

coatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)置換型Replacementvectors

ReplacethenonessentialregionofthephagegenomewithexogenousDNA(~20kb)hightransformationefficiency(1000-timehigherthanplasmid)M13、fd、f1：

AfterinfectionofasensitiveE.colihost,Phageparticlesforma6.7kbcircularsinglestrandofDNA.

Thecomplementarystrandissynthesized,andtheDNAreplicatedasa

double-strandedcircle,thereplicativeform(RF)withabout100copiespercell.絲狀噬菌體AfilamentousphageReplicationform(RF,dsDNA)

ofM13phagecanbepurifiedandmanipulatedlikeaplamid.Phageparticles(ssDNA):DNAcan

beisolatedinasingle-strandedformDNAsequencing基因重組轉(zhuǎn)染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝粘性質(zhì)粒

CosmidvectorsUtilizingthepropertiesofthephagelcossitesinaplasmidvector.2.ItallowsthetargetDNAtobeinserted

Theinsertcanbe37-52kb

Analysisofeukaryoticgenesandthegenome

vectorswitha

largercapacityforclonedDNAthanplasmidsorphage

.CloninglargeDNAfragments３.病毒virussvectors各種真核病毒載體中均含有各種相似的調(diào)控序列(regulatoryelements)，包括DNA在真核細(xì)胞中的復(fù)制起始點(diǎn)(ori)、啟動(dòng)子(promoter)、剪切位點(diǎn)(cleavagesite)、多聚腺苷化信號(hào)、增強(qiáng)子(enhancer)等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在逆轉(zhuǎn)錄病毒前基因組的兩端分別有一個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列（Longterminalrepeat，LTR），其中含有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、整合信號(hào)及多聚A化信號(hào)等調(diào)控序列。

Bothendsofpre-genomeofretrovirushaveLTRs,containingregulatoryelementssuchaspromoter；enhancer；integrationsignaling；PolyAsignalingandsoon。

Retroviruss:

single-strandedRNAgenome,whichcopytodsDNAafterinfection.HavesomestrongpromotersforgeneexpressionGenetherapy基因克隆的基本過(guò)程

Basicprocessofcloningagene

目的基因的分離與制備

生物物種的基因種類(lèi)繁多，而且每種基因均由四種核苷酸組成，理化性質(zhì)接近，用一般的物理、化學(xué)的方法難以分離。Separationofgeneisdifficultbecauseoftheirsimilarphysicalandchemicalqualities

PCR可以把

指定的基因片段

數(shù)量放大染色體PCR

基因數(shù)量放大連瑣反應(yīng)１.聚合酶鏈反應(yīng)獲取目的基因

Polymerasechainreactionforthetargetgene

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)明的一種生物技術(shù)，能在試管中將目的DNA片段在數(shù)小時(shí)內(nèi)由一個(gè)拷貝擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)倍。PCR技術(shù)的發(fā)明使大量獲取目的DNA片段進(jìn)行DNA分子的體外操作成為可能。

PCRenablesresearcherstoproducemillionsofcopiesofaspecificDNAsequenceintubeswithinafewhours.

《后詳》ScreeningfromGenomiclibraries２.通過(guò)基因組文庫(kù)分離、篩選基因需要克隆的DNA片段。目的基因編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系基因組文庫(kù)存在于細(xì)菌內(nèi)、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合體稱(chēng)基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)。

ThecollectionofgenomicDNAcarriedbythecloningvectorsinbacteriaiscalledgenomicDNAlibrary.

建立基因文庫(kù)后需要結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多轉(zhuǎn)化子菌落中篩選出含有某一基因的菌落。

Aftertheestablishmentofgenelibraryscreeningmethodsrequireacombinationofappropriatecoloniesfromanumberoftransformantsscreenedcoloniescontainedagene

一個(gè)理想的基因組文庫(kù)應(yīng)包含全部DNA序列，在進(jìn)行任一基因篩選時(shí)達(dá)到99%以上的概率，這種方法類(lèi)似于霰彈打鳥(niǎo)，因此也稱(chēng)為鳥(niǎo)槍法(Shotgunmethod)

。Acollextionofcloneswhichbetweenthemrepresenttheentiregenomeofanorganism.Theshotgunmethod(alsoknownasshotguncloning)isamethodincloninggenomicDNA.

３.通過(guò)cDNA文庫(kù)分離、篩選基因

IsolatedbycDNAlibraryscreeninggene

cDNA文庫(kù)由一個(gè)基因組全部mRNA基因的克隆組成的文庫(kù)。從文庫(kù)中可調(diào)出該基因組的任何mRNA的基因。

cDNAlibraries

：AllmRNAbyagenomeconsistingofgenelibrary.AdjustablefromthelibraryoutofthegenomeofanymRNAofthegenecDNA文庫(kù)的組建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA兩種文庫(kù)的比較基因組文庫(kù)中，所包含的外源基因片段不僅含有可被轉(zhuǎn)錄和翻譯的區(qū)域，還含有不能轉(zhuǎn)錄的序列。Genomiclibrarieshaveintrons.cDNA文庫(kù)中的插入片段是由mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成，可直接指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和翻譯，能直接用于基因表達(dá)或調(diào)控方面的研究。cDNAlibrarieshavenointrons.４.人工合成基因artificialgene用化學(xué)合成技術(shù)(DNA合成儀)合成DNA分子。synthesizesDNAusingchemicalsynthesistechnology(synthesisinstrument)人工合成基因必需首先知道核苷酸序列及其他相關(guān)的基因信息。artificialgenemustfirstlyknowitsnucleophosphatesequencesanditsrelatedinformation.

化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列目的基因的獲取化學(xué)合成法

cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)二、載體選擇

Choicesofcloningvectors

PlasmidvectersBacteriophagevectorsCosmidsEukaryotic

virusvector三、目的基因與載體的體外重組這種DNA重組是靠DNA內(nèi)切酶和連接酶將外源DNA與載體共價(jià)連接的。Thejoining,or1igation,ofDNAfragmentsiscarriedoutbyanenzymeknownasDNAligase

連接的位點(diǎn)位于載體的多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite,MCS)。TheligationsitelocatesinMCSofvector.

DNAligation

Oneofthemostimportantstepsinacloningprocedure.

CovalentlyjointheDNAmoleculeswiththebase-pairingcohesiveends,orbluntends,ifthe5’-endshavephosphategroups幾種常用的DNA分子連接方法1、粘性末端連接法

cohesiveendligationwheninsertedDNAhaveidenticalcohesiveendswithvector,asidenticalcohesiveendscanbeeasilylinkedtogetherwiththehelpofDNAligase

常用.連接效率高.commonusage,highligationefficiency

BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+載體DNA用BamHⅠ切割目的基因用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄

通?？衫脡A性磷酸酶處理線性的載體分子以去除其5`端的磷酸基團(tuán)，降低載體環(huán)化幾率.Alkalinephosphatase

Removesthephosphategroupsfromthe5’-endsofthevectorDNAlinearizedbyasinglerestrictionenzymetopreventtheself-ligationofthevectorDNAuponthefollowedligationTheuseofalkalinephosphatasetopreventreligationofvectormoleculesG-OHCTTAA-OH用定向克隆方式，即對(duì)載體和插入片段均使用兩種內(nèi)切酶進(jìn)行處理directionalcloning(bothinsertedDNAandvectorarerespectivelydigestedbytworestrictionendonuclease,sotheexogenousDNAcanbedirectionallyinsertedintovector）不同限制酶切位點(diǎn)的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體目錄2、平頭末端連接法bluntendligation

某些DNA分子末端并不是粘性結(jié)構(gòu)，而是平頭結(jié)構(gòu).insertedDNAhaveidenticalbluntendswithvector

平頭連接缺點(diǎn):

連接效率較低;存在的雙向插入和多拷貝插入問(wèn)題。disadvantages:lowligationefficiency,bidirectionalinsertion,multiplecopyinsertion.

應(yīng)適當(dāng)增加酶量，提高反應(yīng)中底物的濃度并延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

Overcome:increasingthequantityofligase,improvingtheconcentrationofreagents,prolongingreactiontime.

目的基因載體限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3、人工接頭法artificiallinker

人工合成的含有常用限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列的雙鏈DNA短片段(大小一般為8-12個(gè)堿基對(duì))稱(chēng)接頭(Linker).

LinkerisashortfragmentofdsDNA(8-12bp),whichisartificiallysynthesizedandcontainsrecognitionsequencesofmanycommonrestrictionendonuclease.

人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ4、同聚物加尾連接

（homopolymerictails）在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。homopolymerictailsligationTerminaldeoxyrinucleotidyltransferasecancatalyzedeoxyribonucleotidetoaddto3`-OHofssDNAordsDNAonebyone.SothepolydCtailsoflinearvectorandthepolydGtailsoftargetDNAcanbecomplementarilylinkertogetherwiththehelpofTerminaldeosynucleotidyltransferase5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體連接方式：

粘性末端連接

平頭末端連接

人工接頭連接

同聚物結(jié)尾連接四、重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞

Intro