第2章 酶與細(xì)胞的固定化

第二章:酶與細(xì)胞的固定化第一節(jié)：酶的固定化固定化酶的定義及其特點(diǎn)酶的固定化:利用一定措施將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)。固定化酶:在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶,能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)后的酶可以回收使用.(不一定是固體)固定化酶的形狀:

顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。顆粒狀占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，薄膜主要用于酶電極。酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，主要用于工業(yè)生產(chǎn)。固定化酶的優(yōu)勢(shì)：極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制；較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶的使用效率提高、成本降低。固定化酶的缺點(diǎn)：固定化時(shí)，酶的活力有損失；只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜；增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大；與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離手續(xù)

二：固定化酶的制備原則：必須注意維持酶的催化活性及專一性。酶活性中心不能受到破壞或與載體結(jié)合，盡量避免破壞酶高級(jí)結(jié)構(gòu)的條件，固定化的條件要溫和。固定化酶必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復(fù)使用；所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。問題固定化技術(shù),固定化酶為什么要進(jìn)行酶的固定化?固定化酶有何優(yōu)劣性?固定化酶技術(shù)的基本原則有哪些?固定化酶就是使酶從游離狀態(tài)變成固體?固定化酶的活力比游離酶高?固定化酶更有利于多酶反應(yīng)?固定化酶可以節(jié)省成本?固定化酶的應(yīng)用1.在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：1）氨基酰化酶：1969年，最早工業(yè)化應(yīng)用的固定化酶。DL－乙酰氨基酸L－氨基酸2）葡萄糖異構(gòu)化酶：3）天冬氨酸酶：1973日本，延胡索酸－－－－天冬氨酸4）青霉素?；?）延胡索酸酶：生產(chǎn)蘋果酸6）B－半乳糖苷酶2.在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用：1）酶電極：葡萄糖電極；氰霉素電極；三：酶的固定化方法酶的固定化方法很多，但沒有普遍適應(yīng)的方法，必須根據(jù)不同酶及其不同的用途通過反復(fù)試驗(yàn)選擇。常用的固定化方法有：(按化學(xué)反應(yīng)的類型分)

固定化方法分類固定化方法分類非共價(jià)結(jié)合法結(jié)晶法分散法物理吸附法離子結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法交聯(lián)法，共價(jià)結(jié)合法包埋法微囊法，網(wǎng)格法固定化酶的模式圖（一）非共價(jià)結(jié)合法包括：結(jié)晶法；分散法；物理吸附法；離子結(jié)合法結(jié)晶法：

就是使酶結(jié)晶從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法,它提供了非常高的酶濃度,從而提高了效率.剛性強(qiáng),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定其局限性是:在不斷的重復(fù)循環(huán)中,酶會(huì)有所損耗.分散法：就是通過酶分散于水不溶相中從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法。關(guān)鍵是解決酶在水不溶相中的分布以及酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性.分散法：提高水不溶溶劑中酶反應(yīng)速率的途徑：正確的體系和貯存狀態(tài)使酶粉充分分散（加入有利于分散的化合物,如PEG）；通過與親脂化合物的共價(jià)連接能增加酶在有機(jī)相中的溶解度，包埋在膜體系中或通過多相反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)酶的固定化；將酶吸附到多孔載體中；物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。優(yōu)點(diǎn)：酶活性中心不易被破壞，酶高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少，因而酶活力損失很少。缺點(diǎn)：酶與載體相互作用力弱，酶易脫落等。離子結(jié)合法：

酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。（DEAE-纖維素，DEAE-葡萄糖凝膠,CM-纖維素等）優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，條件溫和，酶活性中心和高級(jí)結(jié)構(gòu)不易受到破壞，酶活回收率比較高。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，容易脫落，受溶液離子強(qiáng)度和pH影響較大（二）化學(xué)結(jié)合法包括：共價(jià)結(jié)合法；交聯(lián)法1．共價(jià)結(jié)合法：酶與載體以共價(jià)健結(jié)合的固定化方法，是載體結(jié)合法中最常用的方法。1．共價(jià)結(jié)合法：結(jié)合方法優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：與酶結(jié)合牢固，不容易脫落；缺點(diǎn)：反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，容易引起酶失活，酶活回收率低，甚至底物的專一性等也會(huì)發(fā)生變化。1．共價(jià)結(jié)合法：結(jié)合方法主要有二種：將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；在載體上接上一個(gè)雙功能基團(tuán)，然后將酶偶聯(lián)上去。EE直接結(jié)合法通過雙功能基團(tuán)結(jié)合法載體雙功能基團(tuán)1．共價(jià)結(jié)合法：所用載體包括：天然有機(jī)載體（如多糖，蛋白質(zhì)，細(xì)胞）、無機(jī)物（玻璃，陶瓷等）和合成聚合物（聚酯，聚胺，尼龍）合適的載體應(yīng)具有良好的親水性和一定的機(jī)械強(qiáng)度.天然高分子親水性較好,但機(jī)械強(qiáng)度較差,玻璃和尼龍等強(qiáng)度好但親水性較差.共價(jià)結(jié)合的方式有多種方式進(jìn)行反應(yīng),取決于載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán).載體上常用的功能基團(tuán)包括:

芳香氨基,羥基,羧甲基,氨基等可以與載體結(jié)合的酶的功能基團(tuán)包括：氨基,羧基,巰基,羥基,咪唑基,酚基等參與共價(jià)結(jié)合的氨基酸不應(yīng)是酶的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)常見的結(jié)合方法有10種結(jié)合方法：重點(diǎn)掌握溴化氰法活化基團(tuán)最常見的方法:重氮偶聯(lián)法;溴化氰法結(jié)合方法：一.重氮反應(yīng)(diazatitation):適合水不溶性的帶芳香氨基的載體.載體在稀鹽酸或亞硝酸鈉中進(jìn)行反應(yīng),成為重氮鹽衍生物,然后再在溫和的條件下和酶蛋白分子上相應(yīng)的基團(tuán)如酚羥基,咪唑基或氨基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合,得到固定化酶重氮法是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH8—9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。

可能與酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在過量重氮鹽存在下還可與酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基形成雙偶氮化合物。常用載體及其反應(yīng)如下：a.多糖類的芳香族氨基衍生物。我國獨(dú)創(chuàng)的使用對(duì)-β-硫酸脂乙砜基胺(ABSE—)多糖(纖維素，葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖，交聯(lián)瓊脂及淀粉)屬于此類載體。在堿性條件下用對(duì)—β—硫酸脂乙砜基胺活化多糖，制得的醚鍵連接的乙砜基苯胺衍生物，經(jīng)重氮化后偶聯(lián)酶：b.氨基酸共聚體。如L—Leu和對(duì)氨基—DL—苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的L—Leu和對(duì)氨基—DL—Phe的N—羧基酐的苯溶液在少量水存在及室溫下進(jìn)行反應(yīng)制成。共聚物與亞硝酸作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹氐}，可供酶固定用。用此法制備的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。c.聚丙烯酰胺衍生物。該類衍生物的商品名稱為bio—Gel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，經(jīng)重氮化可固定酶。用此法制備的有氨基?；福矸勖傅裙潭ɑ?。d.苯乙酰樹脂。這是聚氨基苯乙烯(a)和一種異丁烯一間一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通過重氮化后可固定酶．如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。玻璃的化學(xué)改造物多孔玻璃在丙酮中與Y—氨基丙基三氧乙烷硅回流加熱，生成烷基胺玻璃:烷基氨玻璃用對(duì)硝基苯酚氯處理后，再還原，轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷慊苌?此芳香基衍生物經(jīng)重氮化后與酶結(jié)合．產(chǎn)生固定化酶。結(jié)合方法：二.異硫氰酸(或異氰酸)反應(yīng)

iso(thio)cyanatereaction適合含芳香氨基的載體.芳香氨基先用硫光氣處理成異硫氰酸(或異氰酸)鹽的衍生物,然后在極溫和的條件下和酶分子的氨基反應(yīng).在中性pH下優(yōu)先與a-氨基反應(yīng),因此有一定的選擇性結(jié)合方法：三.溴化氰法:活化固相載體最早的方法之一,是活化多糖類載體的最盛行的方法,也是實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模經(jīng)常選用的方法溴化氰—亞胺碳酸基反應(yīng)含有羥基的載體(如纖維素、葡聚糖、瓊脂等)在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸基，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。異脲型亞氨碳酸酯型氨基甲酸型最主要方式溴化氰法的優(yōu)缺點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):適用于多種載體的活化,不僅是多糖類,而且也適用于許多其他合成的含羥基的聚合物.其活化的載體可用于偶聯(lián)小配基,以及含伯氨基的高分子聚合物操作簡單重復(fù)性好.用于酶的固定條件特別溫和.缺點(diǎn):少量的持續(xù)不斷的配基的脫落;有比較明顯的非特異性吸附溴化氰法實(shí)驗(yàn)方法:NaOH滴定的傳統(tǒng)方法:用1L無離子水在玻璃漏斗中洗滌Sepharose4B,抽干成濕餅狀并轉(zhuǎn)移到500ml燒環(huán)中;膠懸浮在100ml無離子水中,并輕輕攪拌(不要使用磁力攪拌器)加入20gCNBr到凝膠懸浮液中,逐滴加入20%的NaOH,保持反應(yīng)混合物的pH值在11,不時(shí)加入冰塊到反應(yīng)混合物中,保持溫度在25℃當(dāng)全部CNBr溶解時(shí)(10-15min),NaOH消耗速度將減少,此時(shí),反應(yīng)混合物傾入含冰的砂芯玻璃漏斗中,用1L冰冷的水和500ml冰冷的偶聯(lián)緩沖液(pH8.5,0.1mol/LNa2CO3)快速地洗滌凝膠,由于活化載體不穩(wěn)定,凝膠必須立即偶聯(lián)蛋白質(zhì)或其他配基.必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行四,芳香烴化反應(yīng):含羥基的載體可在堿性條件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反應(yīng),引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚羥基或巰基等偶聯(lián)。五，疊氮反應(yīng)：適用于含羥基，羧甲基等的載體，如CM-纖維素，葡聚糖，聚氨基酸等，可在酸等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮衍生物，然后在pH7.5-8.5和酶的氨基直接偶聯(lián)。六，酰氯?；磻?yīng)：含羧基載體酸樹脂可通過氯化亞砜處理后生成活潑的酰氯衍生物，再與酶共價(jià)結(jié)合。七,酸酐反應(yīng):乙烯等和順丁烯二酸酐的共聚物，可通過其活潑的酸酐基直接和酶的氨基偶聯(lián)，生成固定化酶。八，縮合反應(yīng)：利用羰二亞胺的活化作用，使氨基和羧基直接偶聯(lián)縮合形成肽鍵的反應(yīng)九，巰基-二硫基交換反應(yīng)：帶巰基和二硫基的載體可通過巰基-二硫基交換反應(yīng)和酶分子上的非必需巰基偶聯(lián)。十，直接法或涂層法交聯(lián)法：

就是利用雙功能或多功能試劑使酶與酶，酶與蛋白，或微生物與微生物細(xì)胞之間交聯(lián)的固定化方法，該法也是利用共價(jià)健固定酶的，所不同的是它不使用載體。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛。參與交聯(lián)的基團(tuán)有:a-氨基,-NH2（Lys）,-SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等交聯(lián)反應(yīng)可發(fā)生在分子間或分子內(nèi)；其比例在一定程度上和酶的濃度與交聯(lián)試劑的濃度有關(guān)，也與pH、離子強(qiáng)度有關(guān)。一般而言：低酶濃度下主要形成分子內(nèi)交聯(lián)，交聯(lián)后的酶仍呈溶解狀態(tài)；高濃度下分子間交聯(lián)增加，形成的固定化酶往往變?yōu)椴蝗軕B(tài)。交聯(lián)劑與酶的最適比為10%左右（w/w)，但并不是適用于一切的。交聯(lián)法優(yōu)缺點(diǎn)及措施：

優(yōu)點(diǎn)：操作簡便缺點(diǎn)：反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率一般較低對(duì)策：盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶比活力的提高。采取某些保護(hù)措施：利用可逆抑制劑或底物保護(hù)活性中心?；蛱砑佣栊缘鞍?。（三）包埋法可分為網(wǎng)格型和微囊型兩種，將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型；將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。通常采用惰性材料的載體優(yōu)點(diǎn)：包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率較高。缺點(diǎn)：包埋時(shí)可能發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)使酶失活，只適合小分子底物和產(chǎn)物，不適合大分子底物和產(chǎn)物。1.網(wǎng)格型:

將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型。是固定化微生物中用得最多,最有效的方法.載體主要有丙烯酰胺、聚乙烯醇、和光敏樹脂等合成高分子化合物以及淀粉、明膠、膠原、海藻酸等天然高分子化合物。合成高分子化合物包埋通常采用單體或預(yù)聚物在酶或微生物存在下聚合的方法；對(duì)天然高分子化合物則采用于溶膠狀的高分子化合物中加入酶和微生物再將之凝膠化的方法。例如:瓊脂糖包埋法是，將1％一2.5％的瓊脂糖加熱溶解后冷至37—38℃,與一定量動(dòng)物細(xì)胞混合后．分布于石蠟油中.使溫度由37℃降至10℃左右，可得到直徑為0.1—0.3mm的微球狀固定化細(xì)胞，用于單克隆抗體、白細(xì)胞介素等的生產(chǎn)。2．微囊型：將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。其顆粒比網(wǎng)格型小得多，有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，但是反應(yīng)條件要求高，制備成本也比較高例如：先用海藻酸鈣包埋動(dòng)物細(xì)胞制成膠粒后，再在外面包一層聚Lys膜，然后放入檸檬酸鈉溶液中去除海藻酸鈣，便可獲得由多聚Lys包埋的動(dòng)物細(xì)胞。(3)脂質(zhì)體（liposome)包埋法脂質(zhì)體：具有雙層結(jié)構(gòu)和一定包裹空間的微球體，它具有多層囊胞結(jié)構(gòu)（MLV），單層小囊泡（SUV），單層大囊泡（LUV）等三種類型。特點(diǎn)：一定的機(jī)械性能，能定向?qū)⒚傅劝镔|(zhì)攜帶到一定部位然后釋放，具有更大的定向性；比較安全，回收率高。缺點(diǎn)：在包埋過程發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)同樣會(huì)導(dǎo)致酶的失活。問題1固定化酶有哪些方法?它們各有什么特點(diǎn)?利用結(jié)晶法固定化酶需要載體?不需要載體的固定化方法包括哪些?非共價(jià)固定化酶的方法一般不改變酶的共價(jià)結(jié)構(gòu).共價(jià)法固定化酶一定改變酶的共價(jià)結(jié)構(gòu)?分散法固定化酶就是將酶分散于水溶液中進(jìn)行催化反應(yīng)?問題2如何提高分散法固定化酶的催化效率?吸附法固定酶,離子交換法固定化酶?離子交換法所采用的載體應(yīng)該帶有與蛋白質(zhì)相反的電荷?pI6.5的酶在pH8.3環(huán)境中應(yīng)該與什么載體結(jié)合(DEAE或CM纖維素?)可以進(jìn)行共價(jià)固定化的載體基團(tuán)主要包括?可以進(jìn)行共價(jià)固定化的蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)主要包括?問題3共價(jià)固定化就是將酶直接通過某種方式共價(jià)連接到載體的功能基團(tuán)上?針對(duì)芳香氨基有哪些固定化方法?描述重氮偶聯(lián)法的過程.重氮偶聯(lián)法基團(tuán)活化時(shí)利用了鹽酸,在很酸條件下進(jìn)行,哪么為什么酶不會(huì)大部分失活?可以與重氮衍生物結(jié)合的基團(tuán)有哪些?含有芳香氨基的載體包括哪些?重氮偶聯(lián)法具有比較高的專一性?問題4異硫氰酸法是針對(duì)什么基團(tuán)的載體進(jìn)行的?基本過程?能與蛋白質(zhì)上的什么基團(tuán)連接?對(duì)多糖類的載體,一般采用什么方法進(jìn)行固定化?溴化氰法的原理?基本過程如何進(jìn)行?溴化氰法的優(yōu)缺點(diǎn)?溴化氰法為什么要加入NaOH?溴化氰法與酶結(jié)合時(shí)以什么方式為主?問題5包埋法屬于共價(jià)還是非共價(jià)固定化?有什么優(yōu)劣?包埋法的原理及基本種類?舉例說明各種包埋法?交聯(lián)法常用的交聯(lián)劑是什么?交聯(lián)法由于不需要活化基團(tuán),所以條件比較溫和,酶活的回收率比較高?四．固定化酶的性質(zhì)酶的性質(zhì)?（一）固定化后酶活力的變化：固定化酶的活力一般比天然酶小，專一性也有所變化。原因可能有：固定化過程中，酶分子空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸；固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），影響到活性中心與底物的定位作用；內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心接近受阻；包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能透過膜與酶接觸。問題固定化后酶的活力一定下降?一般會(huì)下降?原因是什么?（二）固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響：在大多數(shù)情況下酶經(jīng)過固定化后其穩(wěn)定性都有所提高；表現(xiàn)在：熱穩(wěn)定性提高；對(duì)各種有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高；對(duì)不同pH穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性都有影響。有報(bào)道有些固定化酶經(jīng)過貯藏后，其活性提高了問題固定化后酶的活力上升了?固定化后酶的穩(wěn)定性上升了?也可能下降?為什么?（三）固定化酶的最適溫度變化：

由于固定化后酶的熱穩(wěn)定性提高，因此其最適溫度也提高了，這對(duì)于生產(chǎn)上非常有利。問題固定化后酶的最適溫度上升的主要原因是什么?（四）固定化酶的最適pH變化：固定化酶的最適pH值常常發(fā)生偏離,主要是微環(huán)境表面的電荷性質(zhì)的影響.如何變化?載體帶正電荷則最適pH上上升偏低?（五）固定化酶的米氏常數(shù)(Km)的變化:

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km值隨載體的帶電性能變化.當(dāng)酶結(jié)合于中性載體時(shí),由于擴(kuò)散限制造成表觀Km值的上升;與載體電荷相反的底物在固定化酶微環(huán)境中濃度比整體溶液高,則固定化酶的表觀Km值下降;(一定降低嗎?)而載體電荷與底物相同,就會(huì)造成固定化酶的表觀Km值顯著增加.問題固定化酶的Km值必定大于游離酶?固定化后Km值上升意味著酶的性質(zhì)發(fā)生了變化?固定化酶性質(zhì)發(fā)生變化的原因：固定化改變了酶的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象；固定化后酶催化反應(yīng)的空間障礙、擴(kuò)散限制效應(yīng)；載體性質(zhì)引起的分配效應(yīng)及其對(duì)酶和反應(yīng)體系性質(zhì)的影響。五.影響固定化酶性能的因素:包括：質(zhì)量傳遞效應(yīng)和支持物產(chǎn)生的（靜態(tài)的）和反應(yīng)產(chǎn)生的（動(dòng)態(tài)的）質(zhì)子梯度：(一)質(zhì)量傳遞效應(yīng):

由于空間位阻、離子強(qiáng)度變化或其他因素導(dǎo)致溶質(zhì)在反應(yīng)體系中運(yùn)動(dòng)性能受到影響，這種現(xiàn)象稱質(zhì)量傳遞效應(yīng)。對(duì)于固定化酶，由于質(zhì)量傳遞效應(yīng)能引起反應(yīng)速率的降低，因此和天然酶相比，其催化效率有所降低。增強(qiáng)催化效率的一些方法：降低顆粒大??；對(duì)于比活力高的酶應(yīng)降低酶的負(fù)載量；使酶在載體的外部優(yōu)先結(jié)合。(二)支持物產(chǎn)生的（靜態(tài)的）和反應(yīng)產(chǎn)生的（動(dòng)態(tài)的）質(zhì)子梯度：

靜態(tài)質(zhì)子梯度：由于溶質(zhì)分子的帶電基團(tuán)和載體上的靜電荷相互作用（分配作用）所引起的在固定化酶周圍空間和整個(gè)反應(yīng)體系之間形成的質(zhì)子梯度。動(dòng)態(tài)質(zhì)子梯度：固定化酶所催化的反應(yīng)釋放質(zhì)子或吸收質(zhì)子，可造成酶周圍環(huán)境中質(zhì)子濃度和反應(yīng)體系中質(zhì)子濃度的差異，這種梯度隨著反應(yīng)的進(jìn)行而不斷變化，受反應(yīng)體系中酸堿緩沖系統(tǒng)的緩沖能力和質(zhì)量傳遞效應(yīng)的影響。動(dòng)態(tài)質(zhì)子梯度對(duì)固定化酶催化的反應(yīng)效率有重要的影響。建議縮小反應(yīng)產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)pH梯度的作用，可以通過下面幾種方法達(dá)到：對(duì)于底物介導(dǎo)的擴(kuò)散控制，分別或同時(shí)減少酶濃度或顆粒大小；使用足夠容量的緩沖液來減少動(dòng)態(tài)pH梯度；采用比該酶最適pH高的外部pH進(jìn)行操作；共固定一個(gè)質(zhì)子消耗酶，它能原位形成氨并中和產(chǎn)生的質(zhì)子；復(fù)習(xí)問題概念:固定化;固定化酶;結(jié)晶法；分散法；物理吸附法；離子結(jié)合法;交聯(lián)法;包埋法為什么要進(jìn)行酶的固定化?固定化酶有什么優(yōu)缺點(diǎn)(相對(duì)游離酶)?固定化酶的方法有哪些分類?共價(jià)法和非共價(jià)法的比較?常見非共價(jià)法?常見共價(jià)法?固定化酶的制備原則?常見固定化酶的載體可以活化的基團(tuán)包括哪些?針對(duì)這些基團(tuán)的相應(yīng)活化方法?掌握重氮反應(yīng)法\異硫氰酸法\溴化氰法:針對(duì)的載體基團(tuán),可以結(jié)合的酶的基團(tuán),關(guān)鍵結(jié)構(gòu),選擇性?溴化氰法的基本過程.什么叫溴化氰法？其原理是什么？其應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)？舉例說明一個(gè)典型利用溴化氰法進(jìn)行共價(jià)固定的實(shí)驗(yàn)。掌握包埋法,交聯(lián)法的概念?主要關(guān)聯(lián)劑,關(guān)聯(lián)的程度與濃度的關(guān)系?包埋法的主要種類.可以用于固定化的蛋白質(zhì)上的基團(tuán)包括什么?固定化引起酶的性質(zhì)發(fā)生變化的原因?固定化后酶的哪些主要性質(zhì)發(fā)生了變化?變化的趨勢(shì)及原因分析.第三節(jié):輔酶的固定化一、輔酶的定義及分類：輔因子:有些酶的催化作用必須在一些非蛋白質(zhì)成分的物質(zhì)的參與才能進(jìn)行,這些小分子物質(zhì)統(tǒng)稱輔因子.為什么輔酶要固定化?酶的作用往往需要輔酶輔酶一般價(jià)格比較昂貴輔酶不容易回收（二）固定化難題及措施：輔酶分子量小，難以包埋在半透膜中，若固定化在不溶性載體上，則會(huì)影響其在多個(gè)酶之間的傳遞作用，目前都是將輔酶結(jié)合于水溶性高分子載體，使其高分子化來解決輔酶的固定化難題：1）引入功能團(tuán)和間隔臂；（主要功能團(tuán)有氨基和羧基）2）高分子化；（碳亞二胺法）。二、載體和方法最常用的載體是瓊脂糖，其次還有纖維素、玻璃珠及合成高分子載體等。常用共價(jià)偶聯(lián)法固定化輔酶或輔基，一般采用溴化氰法、碳亞二胺法以及重氮偶聯(lián)法。二、輔酶的固定化方法（一）輔基輔酶固定化的一般步驟：

1．首先，選擇合適的載體；2．其次，選擇合適的間隔臂；3．引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F(tuán)或利用輔基本身合適的功能基團(tuán)將輔基偶聯(lián)到載體上。（二）輔酶的固定化實(shí)例：輔酶的固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法、碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后用在超濾器中。NAD+通過通過共價(jià)偶聯(lián)法在瓊脂糖上的固定化步驟：用碘乙酸使NAD+/NADH