基因工程論文

基因工程課程設(shè)計題目：基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用 姓名：王曉紅學(xué)號：20103027年級：10級3班專業(yè)：生物技術(shù)專業(yè)指導(dǎo)教師：朱常香山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 二014年選題依據(jù)課程設(shè)計目的了解工業(yè)生產(chǎn)中的新型育種技術(shù)并比較不同育種技術(shù)的優(yōu)勢；學(xué)習(xí)理解基因工程育種技術(shù)及其操作原理；研究基因工程育種技術(shù)在人干擾素生產(chǎn)中的創(chuàng)新?；蚬こ套鳛?1世紀(jì)的一種新型生物技術(shù)，應(yīng)用基因工程育種技術(shù)重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b,通過優(yōu)化補(bǔ)料分批培養(yǎng)時葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達(dá)量和表達(dá)速率。利用這些技術(shù)，可以直接地、有針對性地在DNA分子水平上改造生物的遺傳性狀。通過轉(zhuǎn)入外源基因，微生物和動、植物細(xì)胞可以產(chǎn)生出自身原來沒有的蛋白質(zhì)。同樣，利用重組DNA技術(shù)，也可以使一些原來存在量極低但有重要工業(yè)或醫(yī)學(xué)用途的小分子(抗生素)或蛋白質(zhì)之外的大分子物質(zhì)得以大量生產(chǎn)。特別是隨著重組DNA技術(shù)的完善和發(fā)展，以基因水平為核心的現(xiàn)代分子定向育種技術(shù)越來越受到工業(yè)微生物育種學(xué)家的關(guān)注，并展示了良好的應(yīng)用前景。文獻(xiàn)綜述內(nèi)容1972年美國的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV40DNA、λ噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。翌年，美國斯坦佛大學(xué)的Cohen和Boyer等人在體外構(gòu)建出含有四環(huán)素和鏈霉素連個抗性基因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌后，該重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞相應(yīng)的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。3.易錯PCRDNA聚合酶在進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA時會以一定的頻率發(fā)生堿基錯配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的可能方法。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯PCR(Error_pronePCR，簡稱EP—PCR)。此方法的原理與操作如圖3，其操作過程是在TaqDNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)體系中，利用Mn替代天然的輔助因子Mg，使TaqDNA聚合酶缺乏校對活性，同時使反應(yīng)體系中各種dNTP的比例失衡，因此導(dǎo)致堿基的錯配率大大增加，通常約為0.1％。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來控制錯配水平。這種方法可以將錯配率最大提高至20％?？讟s等利用易錯PCR使D-海因酶對底物的水解活性提高了2.4倍；黃瑛等用易錯PCR使短小芽孢桿菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH>8.0時的穩(wěn)定性也較野生型脂肪酶有所提高。DAN重排DNA重排(DNAshufling)技術(shù)是一種利用重組文庫的體外定向進(jìn)化技術(shù)，Stemmer于1993年首先提出。Figure4TheprincipleandoperationprocessofDNAshufflingZhao等在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種更加簡化交叉延伸程序(STEP)。此技術(shù)是在一個PCR反應(yīng)體系中以2個以上相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物先在一個模板鏈上延伸，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性(延伸)過程。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地與含不同突變的模板進(jìn)行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整時間和溫度來控制。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進(jìn)一步簡化。近幾年來，提高DNA重排技術(shù)捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI對靶序列進(jìn)行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術(shù)（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴(kuò)大了該技術(shù)的用途。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識別標(biāo)記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNaseI產(chǎn)生重排片段。Bergquist等開發(fā)的DOGS技術(shù)則是根據(jù)保守模體區(qū)序列特征設(shè)計簡并引物，擴(kuò)增出保守同源區(qū)后再用重排操作生成突變富集體。由于此方法是在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。DNA重排的最大特點(diǎn)是在反復(fù)突變過程中引進(jìn)了重組這一自然進(jìn)化中最重要的過程，而且其對可操作的靶序列的長度沒有任何要求，可以達(dá)到幾萬kb。通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高，同時還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。4.基因組重排基因組重排(genomeshufling)技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀(jì)出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對象從單個基因擴(kuò)展到整個基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。首先，利用經(jīng)典的誘變育種技術(shù)獲得含有目標(biāo)性狀的基因組庫，然后利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進(jìn)行多輪隨機(jī)重組，從而快速篩選表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體-融合-再生-再制成原生質(zhì)體-融合-再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursiveprotoplastfusion)的方法。Zhang等于2002年首次報道應(yīng)用基因組重排方法快速地使弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)產(chǎn)生泰樂菌素的能力得到提高。該方法以營養(yǎng)缺陷型為出發(fā)菌株，僅用了1年時間，通過兩輪基因組改組就從24000株菌株中分離到2組共14株泰樂菌素高產(chǎn)菌株，其泰樂菌素產(chǎn)量高于通過經(jīng)典誘變育種方法所篩得的生產(chǎn)菌株SF21，而后者(SF21)是用經(jīng)典誘變育種方法在長達(dá)20年的時間中先后篩選過約1000000個菌株后才獲得的。由此可見，此技術(shù)大大減少了工作量，并縮短了篩選時間。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標(biāo)記特征，應(yīng)用基因組重排的方法在一年之內(nèi)使替考拉寧產(chǎn)量提高了65.3％。2、基因工程育種技術(shù)在大腸桿菌種的應(yīng)用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細(xì)菌，其K-12MG1655株的4000多kb的染色體DNA已測序完畢，全基因共含有4405個開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。作為一種成熟的基因克隆表達(dá)受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如基因的分離擴(kuò)增、DNA序列分析、基因的表達(dá)產(chǎn)物功能鑒定等。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。因此，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌工程菌，以規(guī)模化生產(chǎn)真核生物基因尤其是人類基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有重大的經(jīng)濟(jì)價值?，F(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長激素、人干擾素、人白細(xì)胞介素和抗體。以下以生產(chǎn)人干擾素為例介紹其應(yīng)用。人干擾素a2b(HumanInterferona2b,hIFNa2b)是由165個氨基酸組成的多肽,具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)損傷等作用。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長快速、發(fā)酵成本低、表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn),是生產(chǎn)外源蛋白的理想表達(dá)體系。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實(shí)現(xiàn)高密度高表達(dá)的關(guān)鍵。本文采用大腸桿菌BL21(pBAI)表達(dá)hIFNa2b,其表達(dá)通過溫控型PL啟動子調(diào)控?？疾炝搜a(bǔ)料方式對hIFNa2b生產(chǎn)速率的影響,hIFNa2b表達(dá)水平達(dá)到6540mg/L。參考文獻(xiàn)：[1]張惠展.基因工程.上海:華東理工大學(xué)出版社,2005,8[2]朱筠,李志敏,張倩,甘人寶,葉勤.重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b.華東理工大學(xué)學(xué)報,2008,3(2):184-188[3]聶明,李懷波,萬佳蓉,周傳云.工業(yè)微生物遺傳育種的研究進(jìn)展.現(xiàn)代食品科技，2005,21(3):184-187[4]王參軍,鄒文藝,張玲,范清林,宋禮華.突變?nèi)烁蓴_素-α2b基因5′端提高其在大腸桿菌中的表達(dá).安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,45(2):149-153[5]代云見,王明蓉,杜天飛.微生物基因工程育種技術(shù)的研究進(jìn)展.藥研動態(tài)(國外醫(yī)藥抗生素分冊),2008,29(5):193-200[6]王海波,申燁華,秦芳玲等.大腸桿菌生產(chǎn)重組人干擾素-γ培養(yǎng)基的研究.西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2003,33(2):174-178[7]鄒鐘誠,侯劍英,王增學(xué),蘇冬梅.大腸桿菌發(fā)酵重組人干擾素-α2a的高密度、高表達(dá).微生物學(xué)雜志,1999,19(1):24-26[8]周鳴南,方深高,陶征宇,何麗敏.人a2b型干擾素的基因克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)提高.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1995,26(4):152-15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