變性梯度凝膠電泳技術(shù)在環(huán)境微生物學研究中的應用

變性梯度凝膠電泳技術(shù)在環(huán)境微生物學研究中的應用

采用離散度冷杉電泳技術(shù)（dgge）在微生物生態(tài)學中的應用已經(jīng)10多年，在研究各種環(huán)境中的微生物群體方面發(fā)揮了重要作用。DGGE是應用于染色體DNA點變異檢測的方法。1992年荷蘭科學家GerardMuyzer在西班牙召開的第6次微生物生態(tài)學會議上,首次介紹了DGGE技術(shù)在微生物生態(tài)學研究上應用的可能性,1993年Muyzer等便首先在AppliedandEnvironmentalMicrobiology上發(fā)表DGGE方法在微生物生態(tài)研究上的應用。之后,DGGE及溫度梯度凝膠電泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)技術(shù)便在微生物生態(tài)學領(lǐng)域迅速發(fā)展。目前,DGGE技術(shù)廣泛應用于土壤、水體、發(fā)酵食品等環(huán)境微生物群體多樣性的研究和微生物群體動態(tài)的追蹤研究上,并與其他分子生態(tài)學技術(shù)結(jié)合,將微生物生態(tài)學、尤其是環(huán)境微生物學的研究引入了新的階段。目前DGGE技術(shù)也迅速在國內(nèi)推開,但還未見詳細介紹這項技術(shù)的中文文獻。因此,本文結(jié)合筆者等多年來與東京大學合作研究中積累的經(jīng)驗系統(tǒng)地介紹環(huán)境微生物學研究中DGGE技術(shù)應用的全步驟,為更多的研究人員掌握該技術(shù)提供參考。1電泳條帶和指紋基因片段的分離和分析該技術(shù)的主要原理是:在含有濃度線形遞增的變性劑(尿素和甲酰胺的混合物)的聚丙烯酰胺凝膠電泳中,可將長度相同的雙鏈DNA因其堿基排列的不同而分離。將以帶GC夾子(G和C堿基集中的序列)的引物擴增的PCR產(chǎn)物在由上(正極)向下(負極)DNA變性劑濃度遞增的垂直電泳膠上泳動,隨著DNA變性劑濃度的遞增,雙鏈DNA間的氫鍵被斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈成單鏈,但GC堆積部分氫鍵堅固,仍然保持雙鏈結(jié)構(gòu),于是部分變性的DNA分子成為向3方延伸的形狀。這種形狀的DNA分子的電泳遷移率大大降低,具有同樣堿基序列的DNA集中在一處形成條帶,而序列不同的DNA分子由于A-T、G-C間的氫鍵數(shù)量和排列不同,在不同的變性劑濃度下解鏈,亦即在不同的位置形成條帶;從而將長度相同而序列不同的DNA片段在膠上分離。在自然界的不同環(huán)境中,如土壤、農(nóng)田、河川、海洋、污水、堆肥、發(fā)酵食品(飼料)、動物消化道等生息著各種微生物,它們對氧氣、酸堿度、營養(yǎng)等環(huán)境條件的要求各不相同,之間有著復雜的關(guān)系;因此用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)研究這些生境中微生物種類和群體動態(tài),可培養(yǎng)的范圍局限性很大,甚至認為目前人類可培養(yǎng)的微生物種類不到自然界微生物的1%。近年分子生物學技術(shù)應用到微生物生態(tài)的研究中,對復雜環(huán)境中微生物的種類和群體動態(tài)的認識取得了突破性的進展。PCR-DGGE技術(shù)也是其中之一,它可直接從環(huán)境中提取DNA,用PCR擴增微生物的指紋基因片段,根據(jù)其堿基序列的不同而分離;因此可不經(jīng)培養(yǎng),從微量環(huán)境微生物樣品的DNA檢測微生物種類。PCR-DGGE技術(shù)可以用電泳條帶將指紋基因可視化,可以容易判斷一個環(huán)境樣品中的微生物種類。由水稻秸稈飼料化發(fā)酵中細菌群體動態(tài)的DGGE分析(圖1)可見,隨著發(fā)酵進程的進展細菌的群體結(jié)構(gòu)在發(fā)生變化;因此,根據(jù)DGGE膠上DNA條帶的位置、數(shù)量,可以容易地比較判斷不同環(huán)境、時間、位置的樣品之間微生物群體結(jié)構(gòu)。本文中以細菌的16SrDNA的V3區(qū)為例說明PCR-DGGE的技術(shù)步驟。2技術(shù)步驟2.1trs-hcl法微生物的細胞壁組成結(jié)構(gòu)復雜,應針對不同的細胞壁采用適宜的破壞細胞壁的方法,達到最佳的細胞壁的破壞率和DNA的產(chǎn)出率。DNA的產(chǎn)率低將導致DGGE條帶代表性差。本研究室經(jīng)過反復的試驗對比,樣品總DNA的提取方法采用氯苯法進行改良:在1~2g樣品中加入3mL提取緩沖液(100mmol/LTris-HCl,40mmol/LEDTA)充分混合后→加入3mL氯苯和1mL的20g/100mLSDS,在50℃水浴30min,并且每5min將樣品取出充分渦旋(如果樣品是細胞壁難以破壞的革蘭氏陽性菌,則再在體系中加入0.1g直徑為0.1mm的鋯珠后,充分渦旋,破壞細胞壁效果較好)→在冰上放置30min→15000r/min離心15min,小心提取上清移至干凈離心管→加入與上清液等體積的苯和與上清液等體積氯仿/異戊醇去除蛋白→與上清液等體積的異丙醇沉淀DNA→用RNAse(10mg)去RNA→用PEG精制DNA。該法特點是成本低廉,適于提取乳酸菌發(fā)酵物和堆肥中細菌的DNA。其他經(jīng)常見到的提取DNA的方法有珠磨法、試劑盒法等。環(huán)境樣品中,尤其是堆肥和土壤中,腐殖質(zhì)的存在嚴重影響PCR的擴增效率,去除腐殖質(zhì)的常用方法有玻璃奶純化等。筆者采用的是稀釋法,即將DNA稀釋為10ng/μL后,再進行PCR,此時對堆肥樣品尤其有效。2.2樣品索取液索用于DGGE的PCR條件,需要針對不同的樣品摸索。筆者結(jié)合國內(nèi)的條件建立了一套適合乳酸菌、纖維素分解菌和堆肥中細菌16SrDNAV3區(qū)擴增的方法,現(xiàn)介紹如下。2.2.1引物的分析試驗藥品中需要注意的是由于DGGE的PCR引物特殊,需要GCclamp,所以要選擇適宜的引物公司合成引物,筆者選用的是北京六合通公司用PAGE法合成的引物。引物357F-GC序列為,GCclamp-5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′(其中GC-clamp序列為5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′);引物517R的序列為5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。使用時引物用滅菌的去離子水稀釋為45pmol。dNTP購自法瑪西雅公司,將4種dNTP等體積混合后,稀釋為10mmol/L,Taq酶購自TIANGEN公司。2.2.2反應體系的適宜按筆者的經(jīng)驗,細菌16SrDNAV3區(qū)域的PCR所需要模板DNA的量有一個適宜的范圍,50μL的反應體系的適宜范圍在10~20ng(濃度由UVconcentration測量)。由于TE對Taq酶有抑制作用,DNA溶液的體積要控制在2μL之內(nèi),即質(zhì)量濃度至少要達到5ng/μL。50μL反應體系的各組分如表1。2.2.3pcr反應方案以下是本試驗室常用的程序,適用于不同的體系?？筛鶕?jù)試驗結(jié)果,調(diào)整程序。1退火1min95℃5min;93℃解鏈1min,48℃退火1min,72℃延伸1min10s,30個循環(huán);最后93℃解鏈1min,48℃退火1min,72℃延伸5min結(jié)束。2in循環(huán)循環(huán)95℃5min;93℃解鏈30s,65℃退火40s,72℃延伸1min,10個循環(huán);93℃解鏈30s,60℃退火40s,72℃延伸1min,10個循環(huán);93℃解鏈30s,55℃退火40s,72℃延伸1min,9個循環(huán);最后93℃解鏈30s,55℃退火40s,72℃延伸5min結(jié)束。2.2.4種模板dna的反應時間dntp的提取PCR添加藥品要在冰盒上快速進行,由于Taq酶對溫度很敏感,吸取使用量后迅速放入-20℃冰箱。步驟:1)按表1中每種樣品量和樣品數(shù)計算每種反應液的總需要量。為避免最后量不足,每種反應液多計算1個樣品份,即一種反應液的總需要量=1個反應所需量×(樣品數(shù)+1)。2)將各樣品模板DNA1μL分裝到PCR反應管(0.2或0.5μL離心管),4℃冷藏。3)將模板DNA以外的前5種試劑和水的總量加入到1.5μL離心管中,用移液槍混勻放入冰盒,其中dNTP由4種核苷酸組成,吸取前一定要充分混勻。4)將模板DNA管從冰箱中取出,分別向每個管分裝49μL上述混合液。當操作熟練時可以用同一移液器吸頭連續(xù)分裝,但注意移液器吸頭不要碰到管壁,以防污染。5)完成后迅速將樣品插入PCR機器上,標記好位置,以防混淆。注意:①藥品混合時一定要充分混勻!②選擇程序時,要選擇Lidheat,否則,管蓋上有水汽!③Taq酶最短時間內(nèi)放入冰箱!2.2.5eb染色后檢測在進行DGGE之前,應確認PCR產(chǎn)物是否正確擴增。PCR產(chǎn)物以2g/100mL的瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)染色后檢測。電泳緩沖液用1×TAE,電泳約15~20min,EB染色20min。注意EB是致癌物,必須制定有效的措施防止EB的污染。本研究室的做法是,EB染色后的膠用大量水沖洗(帶手套)后,放到保鮮膜上,摘掉手套端起保鮮膜放到凝膠成像系統(tǒng)艙內(nèi),赤手操作凝膠成像系統(tǒng),避免對成像儀和計算機的污染。操作完后,用保鮮膜包好EB膠,將EB膠和手套放入專用的EB垃圾桶中。2.3前處理如果首次DGGE的條帶不是很清晰,可以考慮將PCR產(chǎn)物濃縮后進樣,一般是將100μLPCR產(chǎn)物用酒精沉淀法濃縮到15μL(酒精沉淀法見后)。本試驗按16cm膠的規(guī)格舉例,10和20cm膠的做法可以根據(jù)比例換算。2.3.1在dgge裝置的研究中，biorad公司的dol-16cm16cm膠板的手術(shù)系統(tǒng)進行了裝置的組成:電源、溫度控制系統(tǒng)、凝膠板架、水槽以及配套的梯度生成儀組成。2.3.2dgge藥品的準備2.3.2.膠溶液的配制本研究室采用雙梯度法,即聚丙稀酰胺和變性劑2個梯度,聚丙烯酰胺(PA)一般6~12g/100mL,變性劑梯度(UF)可以根據(jù)情況調(diào)整,一般在15%~60%(尿素為7mol/L、甲酰胺為40%(體積分數(shù))時的變性濃度為100%)的范圍內(nèi),制備膠還需要10g/100mLAPS(過硫酸銨-20℃保存),TEMED(4℃保存)。制膠之前要根據(jù)需要分別配制4種不同濃度的膠溶液儲備液,避光儲存在4℃冰箱。以PA6%~12%為例的膠溶液配制法見表2。梯度膠配制的步驟為:將丙烯酰胺和甲叉雙丙稀酰胺從4℃冰箱拿出,達到室溫,→在試劑瓶中依次加入尿素、甲叉雙丙稀酰胺、丙烯酰胺、去離子甲酰胺,→用去離子水(DW)將附著在壁上的藥品沖下,→加DGGE專用50×TAE,→加適量DW,閉光溶解,→全部溶解后用DW定容→用鋁箔紙將試劑瓶包好,閉光4℃保存。2.3.2.應用于mdge的方法1)50×TAE-DGGE專用緩沖液(pH7.4)500mL。稱取41.015g無水乙酸鈉,溶解在200mL去離子水中→加入121.14gTris→溶解后,加50mLEDTA→用乙酸調(diào)節(jié)pH到7.4,大約需要40mL→定容至500mL。2)LoadingBuffer(DGGE專用)10mL。配制10mL60g/100mL的蔗糖溶液,121℃滅菌15min→在15mL的塑料離心管中,加2.5g/100mL溴酚藍200μL(0.005g溴酚藍溶于200μLSDW)(如果有沉淀,0.8μm濾膜過濾),0.5mol/LEDTA2mL,20g/100mLSDS250μL后,混勻→加6.66mL60g/100mL蔗糖后,用SDW定容至10mL。3)Diffusionbuffer(DGGE專用)100mL。在試劑瓶中依次加入3.854g醋酸銨、0.214g四水合醋酸鎂、0.2mL0.5mol/LEDTApH8.0→SDW定容到100mL,121℃滅菌15min→滅菌后,再向試劑瓶中加0.5mL20g/100mLSDS。2.3.3固膠和凝膠的制備在DGGE整個過程中,制膠是非常關(guān)鍵的步驟,其步驟繁瑣。筆者列出了具體制膠步驟,并指出應該注意的細節(jié)。膠的制備大約需要3~4h,具體操作如下:1)擦玻璃板,在平坦的桌面上鋪層軟紙,選擇底部沒有缺口的玻璃板,先用kimwipeue5f8(特制沒有碎纖維的紙)蘸去離子水,沿水平方向擦,以保證同一水平下玻璃板對條帶的影響一致;然后再蘸酒精擦,使水分蒸發(fā)。2)將spacer放在2個玻璃板中間,插入clamp中,將aligment板放入,用螺絲夾子固定,將aligment取出,用手摸底部是否平整,要絕對的平,否則漏。Spacer要稍微出來一點,達到用手剛能摸到的程度。調(diào)整好后擰緊螺絲。3)將軟墊放在底座上,玻璃板放在軟墊上固定,用水平器調(diào)節(jié)。將進膠管用膠布固定在大玻璃板中間部位,使管口距離小玻璃板正上方0.2cm處,否則進膠時液體易溢出。4)準備冰盒,將10%APS,TEMED,2個50mL的三角瓶(三角瓶上貼上不同顏色的膠布以區(qū)分高低含量,防止混淆。本實驗室設(shè)定黃色表示高含量12%PA,白色表示低含量6%PA),及配好的4種膠溶液6%PA,0UF;6%PA,50%UF;12%PA,0UF;12%PA,80%UF放在冰盒上。5)制膠時要選擇1個梯度范圍,按照所需要的濃度,將相應體積的各溶液加在2個50mL的三角瓶中,高濃度的是黃色,低濃度的是白色。常用變性濃度范圍下各膠溶液加入量見表3。為保證溶液成分均一,吸前先將瓶搖勻再吸。加好液體后,將70μL的10%APS分別加入到2個三角瓶中,搖勻。6)過濾,脫氣。將液體倒入50mL的注射器中,過0.45μm的濾膜,接入到放在冰上的50mL的三角瓶中,注意黃色和白色不要混淆。將三角瓶放入真空干燥器中真空脫氣5min。7)在每個三角瓶中加入15μL的TEMED,搖勻放冰上。用專用的注射器(事先貼上黃、白2種顏色的膠布把高低濃度的注射器區(qū)分開)吸入三角瓶中的液體,注意黃色和白色不要混淆。排出氣泡,將注射器安裝在進樣器(事先分別在高濃度和低濃度端貼上黃、白2種顏色的膠布)上,注意進樣器要歸零。先裝黃色高濃度的這端,然后裝白色低濃度的那端,連好三通。注意要提前準備一燒杯水放在進樣器旁。8)進膠。勻速轉(zhuǎn)動,進膠完成后,將膠管卸下放在燒杯中,反相轉(zhuǎn)動,使水進入注射器中,防止膠凝固在注射器中。9)用去離子水沖洗梳子,然后小心地插入到玻璃板中,只插入一半,防止扭曲,注意觀察膠是否漏,少量的漏可以通過配制1mL的6%PA,0UF,2μLAPS,1μLTEMED彌補。10)打開燈,凝固需室溫2~3h。為節(jié)省時間,在膠凝固過程中可以打開電泳槽加熱,加熱至66℃大約需要90min。11)清洗。把做膠用的三角瓶、注射器等用洗滌靈洗凈,蒸餾水潤洗后,放在吸水紙上晾干。2.3.4用loadingfiger-roin檢查出液管及下錨點單梯度DGGE的電泳時間一般為3h,雙梯度DGGE的電泳時間一般為5h,以下介紹以雙梯度DGGE為例的電泳步驟。1)在DGGE槽中加60mL50×TAE(DGGE專用),加去離子水至6L刻度線;再在三角瓶中準備1L0.5×TAE,將槽中的水補至Full和Run的中間位置;加蓋,注意長桿進入底部的窟窿中,打開電源,將溫度設(shè)置到66℃,打開heat鍵。2)溫度到55℃時開始準備樣品,將PCR產(chǎn)物各13μL加入1.5mL離心管中,將DGGE專用loadingbuffer各7μL加到每個離心管蓋子上,flash后,檢查loadingbuffer與DNA是否融合。把樣品放冰盒上準備點樣。(如果用大梳子的話,需加10μL的loadingbuffer,20μL的DNA。)3)當梳子位置的膠凝固好后,關(guān)閉電源,用去離子水沖洗黃色的凝膠板架底部,將玻璃板固定在黃色的凝膠板架上,如果只有1板膠,注意另一側(cè)也要固定玻璃板(不加spacer),否則漏水。黃凝膠板架的兩側(cè)固定好玻璃板后,凝膠板架子上方形成一個密閉的槽,在槽中加適量去離子水檢查是否漏水,若漏水,則重新安裝玻璃板,直至不漏水為止(如果出現(xiàn)漏水的情況,會導致電路不通,DGGE主機無法運轉(zhuǎn))。安裝好玻璃板后,將凝膠板架(紅點在右邊)放入水槽中,之后將溫度控制器蓋在電泳槽上,注意長桿進入底部的窟窿中。打開電源,打開heat鍵和bump鍵,開bump鍵后,水位會下降,降至run與maxmum的中間,水若不夠的話,關(guān)閉電源,打開溫度控制器上方的探望口,加0.5×TAE補足。4)溫度達到66℃,立即進樣(加熱時間過長則對膠有損傷),先關(guān)掉所有電源,取下溫度控制器,小心地拔掉梳子,用移液槍沖洗每一個進樣口;進樣要緩慢,使樣品順著玻璃板均勻地落入到進樣口中。5)將溫度控制器蓋在電泳槽上,打開電源,將溫度調(diào)到61℃,打開heat鍵,運行5min后,在主機上插入紅黑電源線,注意紅黑線不要顛倒。打開主機電源,電壓調(diào)到200V(constant),時間調(diào)為5h。6)運行5min后看到DNA跑入膠內(nèi)后,打開pump鍵,觀察機器運轉(zhuǎn)正常,水位正常后,人可以離開。2.3.5玻璃板膠壓染色DGGE膠用SYBRGreenⅠ染色,它的染色效率是EB的25~100倍,至少可檢出20pgDNA。具體染色步驟如下:1)在專用的托盤中鋪層保鮮膜,準備好切膠用的離心管。2)關(guān)掉電源,打開蓋子,將凝膠板架拿出,控水,卸下玻璃板。將玻璃板放到水池中的泡沫塑料上(防止打碎玻璃),將clamp卸下,手抓住spacer,向內(nèi)側(cè)擰,揭下短玻璃板,膠粘在長玻璃板上。3)將托盤上平鋪張保鮮膜后,將長板和膠放入托盤中準備染色,在專用的50mL的SYBRGreenⅠ專用的離心管中加15mLDGGE專用的0.5×TAE,再向離心管中加入1.5μL的SYBRGreenⅠ,搖勻。如果是單板便在8mL中加入0.8μLSYBRGreenⅠ。用移液槍將液體順著每個條帶的方向均勻的滴在膠上。染色30min。4)染色結(jié)束后,帶手套將托盤一側(cè)抬起,使余液集中在另一側(cè),用吸水紙將余液吸干,將玻璃板拿出。在專門清洗膠板的水盆內(nèi)接滿水,將玻璃板放入緩緩沖洗幾次,注意防止膠滑下。最后控掉多余的水。5)將預先撕好的保鮮膜蓋在膠上,反轉(zhuǎn)膠板,慢慢取下玻璃板,將粘有膠的保鮮膜,放在沒有灰塵的桌面上,注意不要用污染的手套觸摸到保鮮膜,脫下手套扔掉。6)赤手將膠放入凝膠成像儀艙內(nèi),將膠放平整,排出多余氣泡,照相。注意選用波長302nm的紫外線,并盡量減少紫外照射時間,減少DNA降解。2.3.6離心法制備dna得到DGGE圖譜后,需將特征條帶從膠上切下,并回收,具體步驟如下:1)分析要切的條帶,并編號。將離心管也編號,準備放入切下的條帶。準備鑷子、刀子、酒精和打火機。2)帶上手套,面具。將刀子蘸酒精,用打火機燒后,切條帶,將切下的條帶按序號放入離心管內(nèi)。最后,將切完的膠再放入凝膠成像儀內(nèi),檢查是否將條帶全部切下。3)分別在每個離心管中加入400μL酒精(特級),10~15min后,膠變?yōu)榘咨Ｕ婵瘴呱锨逡?再在離心管中加入200μLdiffusionbuffer。待膠從白色變?yōu)橥该骱?4℃過夜。如果時間緊迫,可以采用50℃水浴30min。4)最后,用酒精沉淀法回收DNA,具體步驟為:①分別在每個離心管中加入3mol/LNaOAC20μL(×1/10),酒精500μL(×2.5),輕輕上下混勻后,-80℃放置30min。②15000r/min離心20min,去掉上清,在離心管中加75%(體積分數(shù))酒精1mL。③上下混勻后,15000r/min離心2min,去掉上清,室溫干燥。④