蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望

蛋白質(zhì)是生命的基礎(chǔ)，是生命活動的最終控制和直接執(zhí)行者。它參與了大多數(shù)生物生命活動的過程，如生長、發(fā)育、遺傳、代謝、激酶、循環(huán)、信號傳達等。100多年來,特別是20世紀生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展,如氨基酸序列測定、多肽合成技術(shù)、X射線衍射技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)等,使人們認識到,蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)和功能高度多樣,并能對環(huán)境各種刺激做出自發(fā)響應(yīng)的、復(fù)雜而神奇的“網(wǎng)絡(luò)生命大分子”。隨著后基因組時代(post-genomeera)的到來,科學(xué)家們的研究重心已經(jīng)從解釋生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對生物功能的研究。采用差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR、基因表達系列分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、DNA芯片等技術(shù)從基因水平上闡述生命活動規(guī)律,其前提是細胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達的水平,但事實并非如此。從DNA到蛋白質(zhì),存在3個層次的調(diào)控,即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(transcriptionalcontrol),翻譯水平調(diào)控(translationalcontrol),翻譯后水平調(diào)控(post-translationalcontrol)。從mRNA角度考慮,實際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,并不能全面代表蛋白質(zhì)表達水平。蛋白質(zhì)作為生命活動的最終體現(xiàn)者,有其自身固有的特點,如蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、構(gòu)象變化、亞細胞定位或遷移、蛋白質(zhì)間相互作用等,這些都無法在基因水平上找到答案。因此,要想真正揭開生命現(xiàn)象的奧秘,必須進行蛋白質(zhì)水平的功能研究。在不同生理或病理狀態(tài)下,篩選鑒定出某些已知或未知的蛋白質(zhì)后,必須回答蛋白在生物體內(nèi)的生物學(xué)功能到底是什么,是什么樣的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)使得蛋白質(zhì)分子能夠發(fā)揮其特定生物學(xué)功能,其分子調(diào)控機制是怎樣的等問題。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)功能研究習(xí)慣于將待研究的蛋白質(zhì)進行提取分離和純化,進而分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性,但很多情況下這樣的研究方法無法揭示某種蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的功能,因為蛋白質(zhì)的功能往往是通過與其他分子的特異相互作用而共同實現(xiàn)的,并非單獨發(fā)揮作用的。近年來,蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)和方法已經(jīng)得到迅速發(fā)展,大量文章都涉及某些蛋白質(zhì)功能方面的研究,但是對蛋白質(zhì)功能研究方法進行系統(tǒng)綜述的文章非常少,因此,試圖對目前蛋白質(zhì)功能研究方法和技術(shù)及其最新研究進展進行綜述。1-de與雙熒光差異凝膠電泳蛋白質(zhì)組學(xué)(proteome)目前被廣泛應(yīng)用于尋找大量新型生物標記物和藥物治療靶點,為闡明蛋白質(zhì)功能、疾病機制及疾病治療提供依據(jù)。研究蛋白質(zhì)表達譜的技術(shù)路線主要有兩條,一條是傳統(tǒng)的基于凝膠電泳(gel-based)的蛋白質(zhì)表達譜技術(shù),如雙向凝膠電泳(twodimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、雙向熒光差異凝膠電泳(twodimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)。2-DE技術(shù)雖然傳統(tǒng)而“古老”,但由于其高分辨率和高通量的特點,仍然是非常有效而且關(guān)鍵的蛋白質(zhì)分離技術(shù),特別是在比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。另一條是基于非膠體系的多維液相層析分離與生物質(zhì)譜相結(jié)合的技術(shù)路線(MudPIT-LC-MS),其特點是高通量、速度快,克服了2-DE不能很好顯示低豐度、疏水性、偏堿性、極大和極小蛋白的缺點。目前我國已建立了具有國際先進水平的、高通量、高靈敏的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺,并且成功開展了有關(guān)人類重要生理及病理相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,如人胎肝的蛋白質(zhì)表達譜和磷酸化修飾譜、肺癌和肝癌差異蛋白質(zhì)組等研究。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鑒定出來的差異蛋白結(jié)果只是初步的,所以當(dāng)篩選鑒定出差異蛋白后,可從網(wǎng)上檢索該蛋白的相關(guān)信息和文獻,選取比較有意義的特定蛋白進行在細胞內(nèi)mRNA表達水平、蛋白表達水平、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的驗證,并開展更為精細的后續(xù)功能的分析。2生命活動基礎(chǔ)機體細胞內(nèi)每個蛋白質(zhì)并不是獨立發(fā)揮作用,通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成較大復(fù)合體,在特定的時間和空間內(nèi)行使特定的功能,構(gòu)成各項生命活動的基礎(chǔ)。目前,用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法非常多,包括酵母雙雜交技術(shù)、串聯(lián)親和純化技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)、表面胞質(zhì)團共振技術(shù)、免疫共沉淀等等,作為一種好的蛋白質(zhì)相互作用方法,應(yīng)該具備兩個條件:(1)特異性,能鑒定出與目的蛋白特異作用的蛋白;(2)能反映在生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的相互作用。2.1轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem,Y2H)是由Field和Song在1989年研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時首次發(fā)明,是一種在酵母中利用轉(zhuǎn)錄激活物的重組來鑒定蛋白質(zhì)之間相互作用的方法,在蛋白質(zhì)相互作用方面扮演著重要角色。真核生長轉(zhuǎn)錄因子具有兩個不同的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain),分別與誘餌蛋白及可能與誘餌蛋白相互作用的獵物蛋白相連,并共同轉(zhuǎn)入酵母細胞。如果兩個蛋白能夠發(fā)生相互作用就能使轉(zhuǎn)錄因子原來分開的兩部分結(jié)合,從而激活下游報告基因。通過檢測報告基因的表達產(chǎn)物就可判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用,如Wang等應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)人Polo樣激酶1(PLK1)與人乳頭瘤病毒5型(HVP-5)的E2蛋白是相互作用的。后來又有研究者在細菌和哺乳動物細胞中進行雙雜交。雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白分子間兩兩相互作用的傳統(tǒng)技術(shù),其假陽性率和假陰性率比較高,所以必須與其他技術(shù)聯(lián)用加以鑒定。2.2核心靶點的選擇與鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽和tev蛋白分離的分子串聯(lián)親和純化(tandemaffinitypurification,TAP)是近些年來發(fā)展起來的新技術(shù),與酵母雙雜交系統(tǒng)不同,此方法可在生理條件下研究多種蛋白質(zhì)復(fù)合物的相互作用,兼具融合蛋白親和色譜法和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點,通過兩步特異性的親和純化可獲得與目的蛋白結(jié)合的高純度蛋白質(zhì)復(fù)合物。該方法首先對目的蛋白進行TAP標簽標記,標簽包括3個部分:蛋白A、鈣調(diào)素結(jié)合多肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)和中間連接的TEV酶識別的酶切位點。在蛋白復(fù)合物的分離純化中,第一步利用與蛋白標簽具有親和作用的色譜柱,采用TEV蛋白酶斷裂TEV蛋白酶切位點的方式洗脫;第二步利用與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽具有親和作用的鈣調(diào)蛋白色譜柱,將蛋白復(fù)合物和TEV蛋白酶分開,純化出的蛋白復(fù)合物用凝膠電泳、質(zhì)譜技術(shù)或Edman降解法進行鑒定。TAP技術(shù)的優(yōu)點是利用酶切的方法進行洗脫,條件溫和,不破壞復(fù)合物的結(jié)構(gòu),并且經(jīng)兩步洗脫,去除了雜蛋白的干擾,提高了蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果的可靠性、特異性,遠遠超越了酵母雙雜交傳統(tǒng)技術(shù)。2.3熒光標記法檢測兩蛋白質(zhì)的相互作用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的基本原理是處于激活狀態(tài)的供體能在足夠近的距離(小于10nm)將本身的熒光傳遞到受體上。因此,用熒光標記的蛋白質(zhì),可以通過熒光體的能量傳遞來檢測兩蛋白質(zhì)的相互作用。此技術(shù)的優(yōu)點是可以在生理條件下無損傷、動態(tài)地研究蛋白質(zhì)的相互作用,同時還能檢測蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位。但是,該方法受熒光發(fā)色基團空間距離的限制,只能用于研究分子量小于200kD的蛋白。目前隨著計算機技術(shù)的發(fā)展,很多研究者運用計算分析和構(gòu)建相互作用模型的方法來預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用,從而發(fā)現(xiàn)更多未發(fā)現(xiàn)有相互作用的蛋白,但這些發(fā)現(xiàn)的蛋白需要利用以上提到的方法進行鑒定?？傊?用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法很多,所有方法都各有千秋,但至今尚無十分理想的方法可以大規(guī)模獲得蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù),故相互作用圖譜有賴于各種研究方法的綜合分析。3亞細胞定位的實現(xiàn)蛋白質(zhì)作為生命活動的直接執(zhí)行者,其功能與亞細胞定位密切相關(guān),有序分布和動態(tài)調(diào)控的蛋白質(zhì)是保證生命個體實現(xiàn)其精細的生物功能的前提。特別是對于真核細胞來說,蛋白質(zhì)位于不同的亞細胞部位,其所行使的功能也不同,或者說蛋白質(zhì)表達部位發(fā)生錯誤就會失去預(yù)期的功能,從而對細胞乃至對整個機體產(chǎn)生影響。目前更是提出了定位組(1ocalizome)的概念來大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的亞細胞定位。觀察蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的精確定位可以借助各種顯微鏡技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)作為一種集激光、顯微鏡和計算機于一體的新型、高精度顯微鏡,是近十幾年來發(fā)展起來的大型生物學(xué)分析儀器,與其他顯微鏡相比,其功能強大,能進行熒光定量測量、共焦圖像分析、三維圖像重建、活細胞動力學(xué)參數(shù)檢測、胞間通訊研究等,可對所觀察的蛋白質(zhì)進行定量、定性、定位的監(jiān)測,在整個細胞生物學(xué)研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。免疫電鏡技術(shù)(immunoelectronmicroscopy,IEM)是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項重要研究手段,集電子顯微技術(shù)與免疫細胞化學(xué)技術(shù)于一體,能在細胞微細結(jié)構(gòu)水平對抗原或抗體進行定位。目前研究蛋白質(zhì)的亞細胞定位已具備了多種成熟的方法,如融合報告基因定位法、免疫電鏡技術(shù)定位、免疫熒光定位和生物信息學(xué)預(yù)測定位等。也有研究者提出可通過相互作用蛋白的亞細胞定位來檢測目的蛋白的定位,此種方法的關(guān)鍵在于選定可靠的,且與目的蛋白相互作用的蛋白。3.1gfp的熒光檢測融合報告基因定位法是將目的蛋白基因與易于檢測的報告基因進行融合,構(gòu)建融合基因表達載體表達融合蛋白,然后借助于報告基因表達產(chǎn)物的特征來定位目的蛋白質(zhì)的一項技術(shù)。目前,報告基因就其表達產(chǎn)物而言,以綠色熒光蛋白(GFP)應(yīng)用最為廣泛,因為綠色熒光蛋白的相對分子質(zhì)量較小,發(fā)色基團性質(zhì)穩(wěn)定,在與其它蛋白質(zhì)融合后發(fā)射熒光,同時不影響它所連接的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。利用這些特性結(jié)合顯微鏡技術(shù)(如激光掃描共聚焦顯微鏡),通過檢測GFP發(fā)射的熒光就可測定目的蛋白在細胞中的準確定位。如Vartiainen等利用GFP和激光掃描共聚焦技術(shù)證實了血清應(yīng)答因子(SRF)的共激活劑MAL的亞細胞定位是受核內(nèi)肌動蛋白的調(diào)控,Varecha等也通過GFP標記技術(shù)分析了人細胞凋亡過程中凋亡蛋白核酸內(nèi)切酶G、AIF和AMID的細胞內(nèi)定位情況。3.2免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)是在免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,它是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量抗原的技術(shù)方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、研究細胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術(shù)主要經(jīng)歷了鐵蛋白標記技術(shù)、酶標記技術(shù)以及膠體金標記技術(shù)3個主要發(fā)展階段。膠體金標記免疫電鏡技術(shù)因其具有特異性強、靈敏性高、方法簡便等優(yōu)點成為目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡標記物,用于細胞表面和細胞內(nèi)多種抗原的精確定位。將免疫細胞化學(xué)方法與電鏡技術(shù)聯(lián)用最大的優(yōu)點就是體內(nèi)定位系統(tǒng),反映的是活體狀態(tài)下目標蛋白質(zhì)在細胞中的位置,是最直接、準確的定位方法。如Hashimoto等利用原位雜交和免疫電鏡的研究證實人絨毛外滋養(yǎng)層細胞有過氧化物酶小體存在。但是,這種方法的先決條件是要求具備目標蛋白質(zhì)的特異性的抗體,而這大部分蛋白質(zhì)來說都是很難具備的條件。另外,免疫細胞化學(xué)方法實驗周期長,效率低,技術(shù)依賴性強,難以實現(xiàn)高通量。4反向遺傳技術(shù)遺傳學(xué)手段大致可以分為“正向遺傳學(xué)”(forwardgenetics)和“反向遺傳學(xué)”(reversegenetics)兩類。正向遺傳學(xué)是分子遺傳學(xué)家最初可使用的一種方法,是指通過生物個體或細胞基因組的自發(fā)突變或人工誘變,尋找相關(guān)的表型或效應(yīng)改變,然后從這些特定效應(yīng)變化的個體或細胞中找到對應(yīng)的突變基因,并揭示其功能,例如遺傳病基因的克隆。反向遺傳學(xué)的原理正好相反,人們首先是改變某個特定的基因或蛋白質(zhì),然后再去尋找有關(guān)的表型或效應(yīng)變化,如基因敲除(knockout)、RNA干擾(RNAinterference,RNAi)等,這些技術(shù)目前已經(jīng)趨于成熟。基因敲除雖然是一種很有效的產(chǎn)生突變個體方法,但因其復(fù)雜而又費時,故不能被普遍接受。而自1998年Fire等發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象以來,RNAi技術(shù)已被證實是一種特異、高效、經(jīng)濟的抑制基因表達的手段而受到極大的重視和歡迎。2001年,RNAi技術(shù)被成功應(yīng)用于哺乳動物細胞,其應(yīng)用前景更加誘人。研究者們可以利用這項技術(shù)對目標基因或蛋白質(zhì)進行特異性表達沉默,通過觀察其表達被抑制的細胞或者生物體的從形態(tài)到各項生理生化指標的變化,對該基因或蛋白質(zhì)的功能及參與的信號網(wǎng)絡(luò)進行研究。這比傳統(tǒng)的基因敲除方法要簡單而且方便得多,因此短短幾年,就有了很多突破性的成果,其中研究得最多的是跟疾病相關(guān)的一些基因和蛋白,如Song等已經(jīng)成功地利用RNAi技術(shù)治愈了試驗鼠的暴發(fā)性肝炎,Qin等報道,用siRNA沉默HIV的重要受體——chemokinereceptor5(CCR5)有效阻斷了HIV病毒對人外周血淋巴細胞的侵入。4.1磷酸腺苷作誘導(dǎo)沉降性因子RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA進入細胞后,在三磷酸腺苷(ATP)依賴性RNA酶Ⅲ(Dicer,DCR)的作用下被切割成3′端有2個突出堿基的21~23nt長度的小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA);這些siRNA與RNAi特異性酶結(jié)合,形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC);而后RISC在siRNA反義鏈的指導(dǎo)下與siRNA同源靶mRNA相結(jié)合,RISC中的重要組成成分Ago2蛋白在近中點位置將其切割,隨后靶mRNA被細胞內(nèi)RNA酶降解,轉(zhuǎn)錄后的mRNA就不能翻譯出相對應(yīng)的蛋白,而RISC游離出來,尋找新的目標分子,從而達到抑制靶基因表達的作用,如圖1所示。4.2病毒載體誘導(dǎo)rnaisiRNA的制備主要有5種方法,包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄合成法、dsRNA法、siRNA表達載體和siRNA表達框架(表1)。從表1可以看出,要想建立長效基因沉默的細胞株進行功能缺失研究,只能采用siRNA表達載體方法,其它方法均為誘發(fā)瞬時基因沉默。siRNA表達載體方法是借助表達質(zhì)粒或表達病毒載體在細胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA,使研究者無需直接操作RNA就可達到長期抑制靶基因表達的目的,且載體上的抗性標記有助于快速篩選出陽性克隆,這使得其將具有更為廣闊的應(yīng)用前景,其中用病毒載體介導(dǎo)RNAi近年來受到人們重點關(guān)注,利用病毒載體能解決質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低、效果不穩(wěn)定和某些類型細胞不能轉(zhuǎn)染等問題,擴大了RNAi的應(yīng)用范圍。常見病毒載體有腺病毒(adenovirus)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)載體、慢病毒(lentivirus)載體等。最近慢病毒載體因其獨特的優(yōu)勢,逐漸成為表達載體中的大熱,與其它表達載體相比,最大的優(yōu)勢是它們能同時感染分裂細胞和非分裂細胞,對干細胞和難轉(zhuǎn)染細胞的研究,能解決轉(zhuǎn)染效率低的問題。如Kim等利用慢病毒載體抑制了間質(zhì)干細胞中的蛋白ICAT的表達,通過與ICAT過表達組的比較,證實ICAT參與組織基質(zhì)細胞的增值和分化;Wiederschain等利用pLKO-Tet-OnshRNA慢病毒載體系統(tǒng)有效抑制了一系列癌細胞系中Bmi-1和Mel-18蛋白的表達;Huang利用慢病毒載體高效抑制了蛋白Smad4在SMMC-7721細胞中的表達,并探討了Smad4在TGF-beta1誘導(dǎo)的SMMC-7721細胞增值和凋亡過程中的作用。這些都說明慢病毒載體是一個高效且快速的干擾系統(tǒng),如果能篩選出長效穩(wěn)定基因沉默的細胞株,可以進一步根據(jù)目的蛋白/目的基因或其家族的已知功能特性,通過干擾組與正常細胞組或蛋白過表達組的比較,開展各類細胞功能試驗來鑒定目的蛋白的具體功能和調(diào)節(jié)機制,如細胞周期及細胞凋亡檢測、細胞運動試驗、細胞侵襲試驗、細胞中各類酶的測定、相關(guān)基因的表達、各項生理生化指標變化檢測等。5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測生物信息學(xué)是通過實驗手段認識蛋白質(zhì)功能方法的補充,它是現(xiàn)代生命科學(xué)與信息科學(xué)、計算機科學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等學(xué)科相互滲透而高度交叉形成的一門新興前沿學(xué)科。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能已成為后基因組時代的一項重要任務(wù),它貫穿蛋白質(zhì)功能研