鹽脅迫下甜瓜轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的表達(dá)變化

鹽脅迫下甜瓜轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的表達(dá)變化

土壤鹽分是一個(gè)全球生態(tài)環(huán)境問題，是植物生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一（zhang等人，2011）。甜瓜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)栽培作物。葫蘆科中,甜瓜的耐鹽性僅次于南瓜,但較高的鹽分也會(huì)對(duì)甜瓜栽培造成危害(Botía等2005),如抑制甜瓜生長(zhǎng)、影響代謝、降低產(chǎn)量及品質(zhì)等(Mendlinger和Fossen1993;Franco等1997;Carvaja等1998;Mavrogianopoulos等1999;delAmor等2000)。研究甜瓜耐鹽機(jī)制對(duì)于了解作物耐鹽性和鹽漬化土壤改良具有重要意義。甜瓜耐鹽性的研究主要集中生理特性方面,如在鹽脅迫下甜瓜的離子濃度、氣孔開度、光合能力、抗氧化酶活性等方面(Mendlinger和Paster-nak1992;Mavrogianopoulos等1999;delAmor等2000;Rodríguez-López等2000;Sivritepe等2005)。利用分子生物學(xué)手段來研究甜瓜鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控鮮有報(bào)道。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物對(duì)逆境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答的關(guān)鍵步驟(Kawaura等2008),轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答過程中有重要作用。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí),轉(zhuǎn)錄因子會(huì)與相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),調(diào)控并減輕逆境脅迫給植物帶來的傷害(劉強(qiáng)等2000)。研究鹽脅迫下植物轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的特性和規(guī)律對(duì)揭示植物耐鹽機(jī)理具有重要意義。轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫條件下表達(dá)發(fā)生變化。利用微陣列技術(shù)分析鹽脅迫條件下擬南芥轉(zhuǎn)錄組的變化,發(fā)現(xiàn)有289個(gè)轉(zhuǎn)錄因子受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),139個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)被抑制(Jiang和Deyholos2006)。同樣,在苜蓿中發(fā)現(xiàn)171個(gè)基因被鹽脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá),其中20%是轉(zhuǎn)錄因子(Gruber等2009)。本研究利用新一代高通量測(cè)序手段——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù),通過轉(zhuǎn)錄組分析來研究不同品種甜瓜葉片中鹽脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特性,以期更好地理解甜瓜對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制,增加對(duì)作物耐鹽機(jī)理的認(rèn)識(shí),并為培育耐鹽品種提供參考。材料和方法1試驗(yàn)材料和材料本試驗(yàn)采用2種不同地區(qū)的甜瓜(CucumismeloL.)品種‘冰雪脆’(‘BXC’,產(chǎn)地濟(jì)南,光皮)和‘玉露’(‘YL’,產(chǎn)地臺(tái)灣,網(wǎng)紋)為試驗(yàn)材料。2基質(zhì)處理與鹽析本試驗(yàn)于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程訓(xùn)練中心玻璃溫室區(qū)進(jìn)行。選取籽粒飽滿、大小一致的種子,浸種催芽后播種于盛有混合基質(zhì)(蛭石:珍珠巖=1:1)的128孔穴盤中。萌發(fā)后每隔2d澆1/2“花無缺”營(yíng)養(yǎng)液(N:P:K=20:20:20)(上海永通化工有限公司),培養(yǎng)基質(zhì)含水量維持在相對(duì)濕度75%左右。待幼苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí),移栽到20L的PVC桶中(每桶種1株),所用混合基質(zhì)為草炭:蛭石:珍珠巖:有機(jī)肥=4:4:1:1,測(cè)定基質(zhì)的EC值為1.0,pH為7.03。溫室條件為日溫24~28℃,夜溫18℃;光周期14h·d-1(光照強(qiáng)度大于87.5μmol·m-2·s-1)。以去離子水為對(duì)照,用300mmol·L-1濃度的NaCl溶液進(jìn)行處理。為避免鹽沖擊效應(yīng),采用每天遞增75mmol·L-1鹽濃度方式處理。達(dá)終濃度后每隔2d澆足量終濃度鹽溶液,以沖洗基質(zhì)中殘留鹽分,保證基質(zhì)鹽濃度在最小的范圍內(nèi)波動(dòng)。期間視需要同時(shí)澆以“花無缺”營(yíng)養(yǎng)液。每個(gè)處理隨機(jī)取樣3株,重復(fù)3次。在達(dá)到終濃度后第7天時(shí)進(jìn)行葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的測(cè)定和分析,且取甜瓜葉片經(jīng)液氮處理并于–80℃下保存?zhèn)溆谩?葉片光化學(xué)活性測(cè)定將各處理植株充分暗適應(yīng)30min以上,用FMS-2型便攜式熒光儀(英國(guó)Hansatech公司)在室溫下測(cè)定每株葉片暗適應(yīng)下的光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、初始熒光(F0)和光化學(xué)量子效率(ФPSII)。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定重復(fù)6次,取平均值。利用MicrosoftExcel2007整理測(cè)定數(shù)據(jù),采用SigmaPlot11.0作圖,方差分析用SAS9.0處理。4rna提取方法按Trizol試劑盒(Invitrogen公司,美國(guó))說明書提取總RNA,并用RNeasyMini試劑盒(Qiagen公司,荷蘭)純化。用NanoDrop-1000分光光度計(jì)測(cè)定所抽提RNA樣品的A260、A280值,計(jì)算樣品濃度,并用變性瓊脂糖凝膠電泳定性檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量。每個(gè)處理取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的RNA樣品混合為50μL,用于RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。5轉(zhuǎn)錄組測(cè)序高質(zhì)量RNA樣品由上海翰宇生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建,利用IlluminaHiSeq2000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,具體方法參見Xu等(2012)。利用basecalling將測(cè)序后得到的原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù),即原始序列數(shù)據(jù)(rawreads)。6差異表達(dá)基因的計(jì)算用Tophat軟件(Trapnell等2009)將去除接頭和低質(zhì)量后得到的Cleanreads比對(duì)甜瓜基因組序列(Jordi等2012),隨后利用Cufflinks軟件(Trapnell等2010)組裝比對(duì)結(jié)果,得到Unigenes,并且根據(jù)RPKM(ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads)方法計(jì)算樣本間的基因表達(dá)差異。在本研究中,以B0(‘冰雪脆’,無鹽處理)、Y0(‘玉露’,無鹽處理)作為對(duì)照,將相對(duì)應(yīng)的B2(‘冰雪脆’,300mmol·L-1NaCl處理)、Y2(‘玉露’,300mmol·L-1NaCl處理)符合P<0.05且差異倍數(shù)在2倍以上的基因定義為差異表達(dá)基因。通過Blast2-GO軟件對(duì)Cufflinks組裝得到的所有Unigenes與NCBI的nr蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比對(duì),對(duì)Unigene進(jìn)行功能注釋和分類(Conesa等2005)。7熒光定量檢測(cè)選擇差異表達(dá)的NAC、WRKY和MYB家族的各2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,用PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)引物(表1),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。將各樣品次生物學(xué)重復(fù)的RNA采用第一鏈cDNA合成試劑盒(Takara公司,日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以Actin為內(nèi)參,采用QIAGEN公司的SYBRGreenRT-PCR試劑盒,利用FTC-3000qPCR系統(tǒng)(FunglynBiotech公司,上海)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。各樣品每個(gè)基因重復(fù)3次,按2-uf044uf044Ct相對(duì)定量法進(jìn)行定量計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果1鹽脅迫對(duì)‘玉露’和‘冰脆’f0和psiii的影響由圖1可以看出,300mmol·L-1NaCl脅迫‘冰雪脆’和‘玉露’后,F0、Fv/Fm和ФPSII值與對(duì)照組相比有不同程度的下降。和對(duì)照相比,鹽脅迫后,‘玉露’的F0由0.7下降到0.65,下降幅度為7.7%;‘冰雪脆’的F0由0.81下降到0.43,下降幅度為47.3%,品種間差異顯著?！衤丁汀┐唷腇v/Fm分別在鹽脅迫后下降18.01%和47.35%,ФPSII分別下降了15.12%和48.11%。品種間比較可以看出,‘玉露’的F0、Fv/Fm和ФPSII值均高于‘冰雪脆’中的,品種間差異顯著。2轉(zhuǎn)錄組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率meloc-tki與對(duì)照相比,‘玉露’在鹽脅迫下共有56個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變。其中,上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因22個(gè),上調(diào)倍數(shù)在7.31~61.82之間,其中最大上調(diào)基因?yàn)镸ELO3C020971。轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)表達(dá)的有34個(gè),下調(diào)倍數(shù)在7.89~243.88,其中MELO3C01364基因下調(diào)243.88倍?！┐唷邴}脅迫下與對(duì)照相比,共有47個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄本表達(dá)發(fā)生變化(表2)。其中,上調(diào)表達(dá)有17個(gè),上調(diào)幅度在6.19~94.35倍之間;下調(diào)表達(dá)的30個(gè),表達(dá)幅度變化在7.16~141.04倍之間。3轉(zhuǎn)錄因子基因不同甜瓜品種響應(yīng)鹽脅迫品種響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的變化表現(xiàn)出品種特異性(圖2)?！衤丁婕暗?6個(gè)鹽脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子中有29個(gè)基因表現(xiàn)出品種特異性,占總數(shù)的51.8%。其中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因有13個(gè),下調(diào)的有16個(gè)?！┐唷邴}脅迫下有20個(gè)特異響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,占所有應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因的42.6%。其中鹽脅迫抑制的基因有12個(gè),鹽脅迫誘導(dǎo)的有8個(gè)?！衤丁汀┐唷瘜?duì)鹽脅迫共同響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有27個(gè),其中有9個(gè)為上調(diào)表達(dá),18個(gè)表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。4轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)果(表3)表明,甜瓜在鹽脅迫下有25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的差異表達(dá)。其中差異表達(dá)顯著且包含轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量較多的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)較多的家族有AP2/EREBP、NAC、Homeobox、WRKY、MYB、Zincfinger、Ttcp7/9、bHLH和Gata等。鹽脅迫下葉綠素?zé)晒夂孔兓容^小的‘玉露’其表達(dá)發(fā)生變化的56個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄本屬于19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。表3和4可以看出,NAC家族上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子最多,為6個(gè)(27.3%),上調(diào)表達(dá)幅度最大的是MELO3C017185為61.119倍;Zincfinger家族下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子最多,為7個(gè)(22.6%)。有的轉(zhuǎn)錄因子家族既有轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的,也有轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的,如MYB家族、NAC家族和ERF家族。與‘冰雪脆’相比,homeobox-leucinezipperproteinathb-7和heatstresstranscriptionfactorb-3是‘玉露’特有的鹽脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子,并且此兩類轉(zhuǎn)錄因子主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)?！┐唷斜磉_(dá)發(fā)生變化的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄本屬于20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,其中上調(diào)表達(dá)幅度最大的是NAC家族的MELO3C017185,表達(dá)量上調(diào)了94.136倍,下調(diào)表達(dá)幅度最大的是MYB家族中的MELO3C006313,下調(diào)了141.04倍。4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄本在鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上升和下降同時(shí)存在,這些家族分別為AP2/EREBP、NAC、MYB、Zincfinger家族。與‘玉露’相比,‘冰雪脆’特有鹽脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子為HDdomainclass、palmate-likepentafoliata1和mixta-liketranscriptionfactor,并且這些轉(zhuǎn)錄因子主要表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)?！┐唷汀衤丁餐险{(diào)的轉(zhuǎn)錄因子家族有AP2/EREBP、NAC、WRKY和MYB家族;共同下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子家族有AP2/EREBP、NAC、MYB、Zincfinger、bHLH、Ttcp7/9、Gata、transcriptionactivatorglk1-like和GRAS,這些共性的轉(zhuǎn)錄因子可能是甜瓜耐鹽性研究重要的分子線索。5pcr對(duì)鹽處理前后表達(dá)的影響分別選取‘玉露’和‘冰雪脆’中NAC、WRKY和MYB家族的2個(gè)基因,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其鹽處理前后表達(dá)變化進(jìn)行分析。由熒光定量結(jié)果(表5和圖3)可以看出,雖然在表達(dá)變化幅度上有些差異,但從6個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)來看,實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致,說明Illumina測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。鹽脅迫反應(yīng)中anyf轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物對(duì)逆境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答的關(guān)鍵步驟,轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用。目前已經(jīng)鑒定出AP2/EREBP、MYB、WRKY、NAC以及bZIP/HD-ZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族的成員參與了植物對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)(朱冬梅等2010),特定轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的變化能極大地影響植物適應(yīng)逆境的能力。轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫下呈現(xiàn)出不同的應(yīng)答反應(yīng)模式,表明這些轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫應(yīng)答途徑中扮演著不同的角色(Jiang和Deyholos2006;Kawaura等2008;Gruber等2009)。本文研究結(jié)果表明,鹽脅迫可以誘導(dǎo)或抑制眾多轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),且不同品種甜瓜的轉(zhuǎn)錄因子在其轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出一定的品種特異性。鹽脅迫下,兩個(gè)甜瓜品種‘玉露’和‘冰雪脆’葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)相差較大,說明兩個(gè)品種在耐鹽性方面有一定的差異?！衤丁?1.8%的轉(zhuǎn)錄因子是鹽脅迫特異響應(yīng),‘冰雪脆’中則有42.6%的鹽脅迫逆境響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)為特異響應(yīng)。鹽脅迫下2種甜瓜品種表現(xiàn)的不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)也體現(xiàn)了2個(gè)品種鹽脅迫時(shí)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控方式可能有所差異,其鹽脅迫的適應(yīng)機(jī)理可能也有所差異。由于轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目眾多,其調(diào)控方式表現(xiàn)出豐富的多樣性,測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果也可以看出這兩個(gè)品種在鹽脅迫逆境下,有的轉(zhuǎn)錄因子家族中既有上調(diào)表達(dá)的,也有下調(diào)表達(dá)。這種表達(dá)的差異可能是植物重新組織和調(diào)節(jié)生理生化活動(dòng),以提高或改善某些代謝途徑來適應(yīng)鹽逆境脅迫,減少傷害。兩種甜瓜在鹽脅迫條件下所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子也有部分相同,表明其在鹽脅迫時(shí)有某種相同的反應(yīng)機(jī)制,這種機(jī)制可能與基礎(chǔ)抗性有關(guān)。植物AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族能夠?qū)Π}脅迫在內(nèi)的多種非生物脅迫產(chǎn)生應(yīng)答(Kizis等2008)。本研究發(fā)現(xiàn)甜瓜響應(yīng)鹽脅迫的AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子大部分屬于ERFs轉(zhuǎn)錄因子家族(ethylene-responsivefactors)。ERF廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及各種逆境脅迫反應(yīng)的調(diào)控(莫紀(jì)波等2011)。如對(duì)轉(zhuǎn)入ERF類轉(zhuǎn)錄因子OPBP1基因的煙草分析發(fā)現(xiàn),OPBP1的過表達(dá)能提高煙草的抗鹽能力(劉文奇等2002);番茄ERF類轉(zhuǎn)錄因子JERF3既是GCC-box結(jié)合蛋白,又能識(shí)別DRE元件。JERF3在番茄中能被乙烯、茉莉酸、低溫、高鹽和脫落酸誘導(dǎo),同時(shí)能提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性(Wang等2004)。本研究中,部分AP2/EREBP基因參與甜瓜應(yīng)對(duì)鹽脅迫的分子調(diào)控過程,2種甜瓜中表達(dá)發(fā)生變化的AP2/EREBP基因大都不同且數(shù)量也不同。在‘玉露’中有11個(gè),其中4個(gè)上調(diào)表達(dá),7個(gè)下調(diào)表達(dá);‘冰雪脆’中有6個(gè),其中僅有1個(gè)表現(xiàn)為上調(diào)。在鹽脅迫下,一些AP2/EREBP基因表現(xiàn)為上調(diào),而另一部分基因卻表現(xiàn)為表達(dá)抑制,說明不同的基因參與環(huán)境脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)方式不同。近幾年,植物ERFs轉(zhuǎn)錄因子在基因克隆和功能研究方面取得了很大進(jìn)展,但目前對(duì)ERFs轉(zhuǎn)錄因子整體調(diào)控機(jī)制還不很明確(莫紀(jì)波等2011)。ERFs轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的深入研究,將為培育耐逆性作物新品種提供參考。植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答與NAC家族轉(zhuǎn)錄因子有密切關(guān)系(Purani等2012;Nakashima等2012)。對(duì)普通小麥的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)53個(gè)NAC基因中有23個(gè)NAC基因受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(Glenn等1999)。NAC家族基因在擬南芥根部對(duì)NaCl應(yīng)答最為顯著,表明它是擬南芥根部對(duì)鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中潛在的重要調(diào)節(jié)因子(Vannini等2004;Jiang和Deyholos2006)。本研究也檢測(cè)到受鹽脅迫誘導(dǎo)的NAC類轉(zhuǎn)錄因子,在‘玉露’和‘冰雪脆’中上調(diào)表達(dá)的NAC類轉(zhuǎn)錄因子都比下調(diào)表達(dá)的多,表明這兩種甜瓜中NAC轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫下主要通過誘導(dǎo)表達(dá)起調(diào)控作用。植物中對(duì)鹽脅迫特異性應(yīng)答以及超高水平應(yīng)答的NAC轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)大多能使轉(zhuǎn)基因植物提高一種或幾種脅迫耐受性,對(duì)植物耐鹽基因工程具有重要參考價(jià)值(李小蘭等2013)。WRKY基因在植物體內(nèi)的表達(dá)受生物和非生物環(huán)境的誘導(dǎo),其表達(dá)具有快速、瞬時(shí)等特點(diǎn)(Zhou等2008)。在葡萄中,逆境相關(guān)的信號(hào)物質(zhì),如脫落酸、高鹽和低溫等逆境脅迫均可誘導(dǎo)3個(gè)WRKYs基因的表達(dá),表明WRKYs參與了葡萄抵御逆境脅迫的過程(侯麗霞等2013)。本研究也檢測(cè)到在鹽脅迫下不同甜瓜品種中WRKY均為上調(diào)表達(dá),表明它是甜瓜對(duì)鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中潛在的重要調(diào)節(jié)因子,主要通過上調(diào)表達(dá)對(duì)作物起