油茶種子-亞麻酸合成途徑相關(guān)基因表達(dá)譜分析

油茶種子-亞麻酸合成途徑相關(guān)基因表達(dá)譜分析

油茶是中國(guó)最重要的木本植物。它是中國(guó)14個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）種植的最重要樹(shù)種。種植面積接近400萬(wàn)hm。茶油是優(yōu)質(zhì)保健食用植物油,含有90%左右的不飽和脂肪酸(吳小娟等,2006),其中以油酸(80%以上)和亞油酸(約8%)居多,且不含有難以消化的芥酸和山崳酸。α-亞麻酸(α-linolenicaicd,ALA,C18:△9,12,15)是只能在植物體內(nèi)合成的三價(jià)不飽和脂肪酸,是ω-3多不飽和脂肪酸中唯一的人體必需脂肪酸(Simonetal.,2009)。α-亞麻酸在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoicacid,DPA)等(Starketal.,2008),是構(gòu)成細(xì)胞膜和生物酶的基礎(chǔ)物質(zhì),具有降血脂、降血壓、預(yù)防心腦血管疾病、抵抗炎癥、增強(qiáng)智力等多方面的作用(SanGiovannietal.,2005)。近年來(lái)α-亞麻酸的研究越來(lái)越被重視,但與油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸相比,現(xiàn)有α-亞麻酸的研究主要集中在人體α-亞麻酸的生理功能研究及富含α-亞麻酸植物的開(kāi)發(fā)利用等方面(楊靜等,2011;李麗萍等,2007;徐愛(ài)遐等,2004)。Schilmiller等(2007)和Truman等(2007)在茉莉酸的生物合成及茉莉酸調(diào)節(jié)擬南芥(Arabidopsisthaliana)的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)研究中涉及α-亞麻酸的合成及在植物體內(nèi)的變化過(guò)程;KEGGPATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)茉莉酸生物合成數(shù)據(jù)模塊中包含有α-亞麻酸代謝通路。不飽和脂肪酸的合成研究表明,植物中α-亞麻酸合成是以磷脂酰膽堿為最初底物,經(jīng)磷脂酶(PLA)和脂肪酸脫飽和酶(FAD)作用形成亞麻酸(王鏡巖等,2002)。這些研究為植物α-亞麻酸代謝途徑基因調(diào)控研究提供重要參考。本實(shí)驗(yàn)室在油茶種子轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn),油茶種子油脂合成過(guò)程存在α-亞麻酸代謝途徑。同時(shí),對(duì)不同油茶品種所產(chǎn)油脂樣品分析發(fā)現(xiàn),α-亞麻酸在茶油中的含量不高,僅為0.3%~0.4%(胡芳名等,2006)。若能通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種,調(diào)控油茶種子α-亞麻酸代謝途徑,促進(jìn)α-亞麻酸合成代謝相關(guān)基因的超量表達(dá),有可能在一定范圍內(nèi)提高α-亞麻酸在茶油中的含量,對(duì)于進(jìn)一步提高茶油的食用和保健品質(zhì)具有科學(xué)意義和產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。本文在油茶種子轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上開(kāi)展了油茶種子α-亞麻酸代謝途徑及其相關(guān)基因分析,以期為相關(guān)基因的克隆與鑒定,進(jìn)而為提高α-亞麻酸含量的油茶分子育種奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1種子采集和處理分別于2009年6月下旬(油茶果實(shí)膨大期)和10月中旬(油脂合成高峰期)從湖南省株洲市馬家河鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)油茶種質(zhì)資源圃采集國(guó)家審定油茶品種‘華碩’的果實(shí),果實(shí)采摘后立即剝?nèi)》N子放入液氮中保存,帶回實(shí)驗(yàn)室將種子置-80℃超低溫冰箱中保存。1.2總rna提取分別取果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期的‘華碩’種仁放入不同的研缽中,加入液氮研磨至勻質(zhì)粉末狀,分別裝入預(yù)冷的1.5mL離心管中,用Invitrogen公司總RNA提取試劑盒分別提取不同時(shí)期種仁樣品的總RNA。電泳檢測(cè)提取RNA的完整性,核酸/蛋白定量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。-80℃保存完整性好(28S∶18S大致為2∶1)、OD260/280值在1.9~2.2之間、樣品濃度≥200ng·μL-1的RNA樣品備用測(cè)序。1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建將上述2個(gè)不同時(shí)期的RNA樣品等比例混合成總量為1mg左右的混合樣品,用干冰保存送至深圳華大基因公司采用Illumina技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。組裝軟件SOAPdenovo完成對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝、拼接和去冗余處理后獲得非冗余Unigene序列,構(gòu)建了油茶種子油脂合成調(diào)控過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。將Unigene序列比對(duì)到Nr,SwissProt,KEGG和COG等數(shù)據(jù)庫(kù),完成油茶種子油脂合成調(diào)控過(guò)程轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋,取e-value<0.00001的Unigene視為已知基因(邵奉公,2011)。1.4數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序?qū)⑸鲜?個(gè)不同時(shí)期的RNA樣品各1mg左右分別用干冰保存,送至深圳華大基因公司采用Solexa技術(shù)進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序。對(duì)2個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行整理和去雜后,根據(jù)已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因注釋。1.5unihenes序列及同源性比分析從華大基因公司下載油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和表達(dá)譜測(cè)序數(shù)據(jù),按基因功能對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Pathway顯著富集的Unigenes進(jìn)行分類(lèi),綜合分析油茶種子油脂形成過(guò)程中涉及的相關(guān)基因,關(guān)鍵基因參與調(diào)控代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),以及關(guān)鍵基因的功能、不同時(shí)期的表達(dá)差異及與油脂形成的關(guān)系,在Nr,SwissProt,KEGG和COG等數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋信息不一致的Unigenes序列,選取其中200bp以上的序列在GenBank中重新進(jìn)行Blastx同源性比對(duì)獲取準(zhǔn)確基因信息。1.6qpcr檢測(cè)引物對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析獲得的油茶種子關(guān)鍵基因在油茶種子不同時(shí)期的表達(dá)模式采用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中各基因已知序列信息采用軟件PrimerPrimer5.0設(shè)計(jì)用于qPCR的引物(表1),由北京六合華大基因公司合成,各引物均進(jìn)行PCR檢測(cè),并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物回收測(cè)序以驗(yàn)證引物的特異性。按QuantiFastSYBRGreenPCR試劑盒(QIAGEN)推薦方法在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD)上完成qPCR過(guò)程,采用Bio-RadCFXManager軟件進(jìn)行分析。2結(jié)果與分析2.1unigere測(cè)序結(jié)果油茶果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期RNA等比例混合樣品進(jìn)行Illumina雙末端測(cè)序(paired-endsequencing,PE)后,共獲得了13333334個(gè)reads片段,包含1200000060nt,其中片段長(zhǎng)度大于20個(gè)堿基的百分比為96.05%,N值為0,GC%值為46.75%,說(shuō)明此次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較好,為后續(xù)的數(shù)據(jù)組裝提供了很好的原始數(shù)據(jù)。用組裝軟件SOAPdenovo對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝、拼接和去冗余處理后最終獲得了69798個(gè)非冗余Unigene片段,序列信息達(dá)到24154817nt,片段大小從159~3859nt不等,各Unigene片段長(zhǎng)度、數(shù)量及其在轉(zhuǎn)錄組中所占比例見(jiàn)表2。對(duì)Unigene進(jìn)行覆蓋度分析發(fā)現(xiàn)69798條Unigene都能夠與測(cè)序的原始數(shù)據(jù)reads相對(duì)應(yīng),同時(shí)將Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)與Scaffold數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后,也得到了Unigene序列與Scaffold序列的很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系,說(shuō)明Unigene序列確實(shí)由Scaffold序列進(jìn)行拼接獲得的去冗余序列。對(duì)油茶種子轉(zhuǎn)錄組Unigene序列進(jìn)行蛋白功能注釋、Pathway注釋、COG功能注釋和GeneOntology(GO)功能注釋,共有18714條Unigene獲得基因注釋,歸并為124個(gè)代謝途徑,其中涉及α-亞麻酸合成代謝的Unigene序列共112條,與α-亞麻酸代謝密切相關(guān)的不飽和脂肪酸合成途徑Unigene序列94條,分別占全部注釋基因的0.6%和0.5%。2.2不同時(shí)期和不同樣品間的基因表達(dá)差異分別對(duì)油茶果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期RNA進(jìn)行Solexa單端測(cè)序(single-endsequencing,SE),獲得油茶種子2個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行整理和去雜后,得到油茶果實(shí)膨大期高質(zhì)量測(cè)序標(biāo)簽(cleantags)117123條,油脂合成高峰期cleantags106069條;大部分?jǐn)?shù)據(jù)能夠通過(guò)前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋。為了進(jìn)一步分析2個(gè)時(shí)期基因表達(dá)差異,將基因的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化,取標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)量TPM(transcriptpermillioncleantags)值直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異(聶志揚(yáng)等,2009),并對(duì)差異檢驗(yàn)的P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正,通過(guò)控制FDR(falsediscoveryrate)≤0.001來(lái)最終決定P值的域值。本研究中,以FDR≤0.001且存在2倍以上表達(dá)差異作為判斷基因表達(dá)差異顯著的閾值。將果實(shí)膨大期的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)與高峰期的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)種類(lèi)相同且表達(dá)上存在差異的基因共有2716條,其中α-亞麻酸代謝差異表達(dá)基因12條,占全部差異表達(dá)基因的1.25%。2.3unigeres基因序列及與植物相關(guān)酶的序列分析綜合分析油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中α-亞麻酸代謝途徑的112條Unigenes序列和不飽和脂肪酸合成途徑94條Unigenes序列的基因注釋信息,可確定調(diào)控α-亞麻酸代謝過(guò)程的主要酶基因有12種,分別為磷脂酶A2基因(PLA2)、脂肪氧合酶基因(LOX)、α-雙加氧酶基因(DOX)、12-氧代植物二烯酸還原酶基因(OPR)、丙二烯氧化物環(huán)化酶基因(AOC)、脂肪酸β-氧化作用多功能蛋白基因(MFPA)、乙酰-CoA?；D(zhuǎn)移酶基因(AACT)、脂酰-CoA-氧化酶基因(ACOX)、氫過(guò)氧化物裂解酶基因(HPL)、丙二烯氧化物合酶基因(AOS)、△-(12)-脂肪酸脫飽和酶基因(FAD2)、△-(15)-脂肪酸脫飽和酶基因(FAD3),它們編碼參與油茶種子α-亞麻酸代謝過(guò)程的12種關(guān)鍵酶。轉(zhuǎn)錄組α-亞麻酸代謝Pathway分析顯示12種酶功能基因分別參與調(diào)節(jié)α-亞麻酸代謝過(guò)程中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的生化反應(yīng),是調(diào)控α-亞麻酸代謝途徑的關(guān)鍵酶功能基因。為進(jìn)一步確認(rèn)12種α-亞麻酸代謝關(guān)鍵酶基因注釋的可靠性,將12種基因中200bp以上的Unigene編碼序列在GenBank中重新進(jìn)行Blastx同源性比對(duì)。各基因Unigene序列與其他植物相關(guān)已知基因序列的比對(duì)信息顯示,編碼12種關(guān)鍵酶的Unigenes基因序列分別與油橄欖(Oleaeuropaea)、茶樹(shù)(Camelliasinensis)、歐洲榛子(Corylusavellana)、大豆(Glycinemax)、花生(Arachishypogaea)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、煙草(Nicotianatabacum)等植物相關(guān)基因序列比對(duì)的基因注釋達(dá)到較高的期望值,相似性達(dá)85%~95%不等。Blastx同源性比對(duì)結(jié)果可以確認(rèn)這12種酶基因注釋的準(zhǔn)確性和可靠性。2.4關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析油茶種子果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期的表達(dá)譜數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)油茶種子α-亞麻酸代謝中12種關(guān)鍵酶功能基因在油茶種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)存在差異,各基因不同時(shí)期表達(dá)分析詳見(jiàn)表3。本研究中,以TPM1~5為低豐度表達(dá),TPM5~10為中豐度表達(dá),TPM>10為高豐度表達(dá)。表3數(shù)據(jù)顯示,在油茶種子發(fā)育過(guò)程中α-亞麻酸代謝的12種關(guān)鍵酶基因存在4種表達(dá)模式。脂肪氧合酶基因(LOX)、丙二烯氧化物合酶基因(AOS)和脂酰-CoA-氧化酶基因(ACOX)膨大期沒(méi)有表達(dá),油脂合成高峰期有表達(dá);丙二烯氧化物環(huán)化酶基因(AOC)、12-氧代植物二烯酸還原酶基因(OPR)、乙酰-CoA脂肪酰轉(zhuǎn)移酶基因(AACT)在油茶種子成熟過(guò)程不同時(shí)期都有表達(dá)但表達(dá)量差異不大,3種基因在不同時(shí)期均表達(dá)豐度較低;磷脂酶A2基因(PLA2)、氫過(guò)氧化物裂解酶基因(HPL)、△-12脂肪酸脫飽和酶基因(FAD2)和△-15脂肪酸脫飽和酶基因(FAD3)在油茶油脂形成過(guò)程的果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期都有表達(dá),且油脂合成高峰期表達(dá)相對(duì)于膨大期表達(dá)為上調(diào);而α-雙加氧酶(DOX)基因和脂肪酸β-氧化作用多功能蛋白基因(MFP)在油茶油脂形成過(guò)程的果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期也都有表達(dá),但油脂合成高峰期表達(dá)為下調(diào),如MFP在油脂合成高峰期相對(duì)于果實(shí)膨大期基因表達(dá)下調(diào)近4倍。2.5熒光定量pcr特性對(duì)α-亞麻酸代謝12個(gè)關(guān)鍵酶基因采用qPCR驗(yàn)證其在油茶果實(shí)膨大期和油茶種子油脂合成高峰期的表達(dá)情況。利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)的α-亞麻酸代謝關(guān)鍵酶功能基因的qPCR引物退火溫度為57℃,PCR產(chǎn)物130~385bp,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和測(cè)序,確認(rèn)各基因引物能有效單一條帶擴(kuò)增,表明設(shè)計(jì)的引物具有特異性,可用于熒光定量PCR分析。以表達(dá)穩(wěn)定的油茶GAPDH基因(rzots0_001325.y1.scf)為內(nèi)參對(duì)照基因(譚曉風(fēng)等,2008)擴(kuò)增目的基因,采用Bio-RadCFXManager軟件,擬定相對(duì)表達(dá)豐度最高值為1.0,計(jì)算α-亞麻酸代謝各關(guān)鍵酶基因在油茶果實(shí)膨大期和油茶種子油脂合成高峰期的相對(duì)表達(dá)量并作柱狀圖(圖1)。由圖1可知:PLA2,HPL,FAD2和FAD3基因表達(dá)規(guī)律一致,在油茶種子果實(shí)膨大期都有一定表達(dá)量,PLA2,HPL,FAD2油脂合成高峰期相對(duì)于膨大期表達(dá)上調(diào)幅度較大,FAD3果實(shí)膨大期表達(dá)量低,油脂合成高峰期表達(dá)上調(diào)幅度不如FAD2;AOC,OPR,AACT等基因在油茶種子果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期表達(dá)量較低且差異不大;LOX,AOS和ACOX在果實(shí)膨大期表達(dá)量極低,在油脂合成高峰期有一定量表達(dá);DOX,MFP果實(shí)膨大期表達(dá)量較大但在油脂合成高峰期基因表達(dá)驟然下降。試驗(yàn)結(jié)果顯示,α-亞麻酸代謝關(guān)鍵酶基因在油茶果實(shí)膨大期和油茶種子油脂合成高峰期的表達(dá)模式與油茶種子不同時(shí)期表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。2.6油茶種子-亞麻酸代謝的關(guān)鍵酶基因調(diào)控途徑油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示Pathway顯著性富集分析可以確定α-亞麻酸代謝過(guò)程中FAD2,FAD3,LOX,AOS,ACOX,AOC,OPR,AACT,PLA2,HPL,DOX,MFP2具差異表達(dá)的12種關(guān)鍵酶功能基因調(diào)控α-亞麻酸代謝過(guò)程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的反應(yīng),結(jié)合油茶種子調(diào)控α-亞麻酸代謝的關(guān)鍵酶基因不同時(shí)期基因表達(dá)差異分析,繪制油茶種子α-亞麻酸代謝過(guò)程關(guān)鍵酶功能基因調(diào)控途徑(圖2)。從圖2中可以看出,油茶種子α-亞麻酸代謝存在α-亞麻酸的合成和形成多種不飽和脂肪酸的物質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程。PLA2,FAD2,FAD3是調(diào)控α-亞麻酸合成過(guò)程的關(guān)鍵基因,各基因分別調(diào)控油茶種子α-亞麻酸合成途徑中1個(gè)節(jié)點(diǎn)的反應(yīng)。DOX,LOX及FAD是平行調(diào)控α-亞麻酸轉(zhuǎn)化為其他不飽和脂肪酸物質(zhì)的第1步反應(yīng)中的關(guān)鍵基因,在油茶α-亞麻酸代謝途徑中DOX基因調(diào)節(jié)1個(gè)代謝節(jié)點(diǎn)的生化反應(yīng),LOX參與調(diào)控2個(gè)代謝節(jié)點(diǎn)的生化反應(yīng),調(diào)控α-亞麻酸生成脂肪酸氫過(guò)氧化物過(guò)程。HPL和AOS基因在油茶α-亞麻酸代謝過(guò)程分別調(diào)節(jié)2個(gè)代謝節(jié)點(diǎn)的代謝流量,調(diào)控脂肪酸氫過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化形成多種不飽和脂肪酸。AOC和OPR各調(diào)控1個(gè)α-亞麻酸代謝節(jié)點(diǎn)的生化反應(yīng),ACOX,MFP和AACT各調(diào)控3個(gè)代謝節(jié)點(diǎn)的反應(yīng),圖2顯示這5個(gè)基因共同參與調(diào)控油茶種子發(fā)育過(guò)程中α-亞麻酸形成茉莉酸類(lèi)物質(zhì)。3fad3調(diào)控油茶種子成熟過(guò)程中-亞麻酸的表達(dá)油茶種子發(fā)育過(guò)程中能合成大量不飽和脂肪酸,其中α-亞麻酸是ω-3不飽和脂肪酸中人體必需的不飽和脂肪酸。為開(kāi)發(fā)油茶的優(yōu)質(zhì)基因資源,培育提高α-亞麻酸含量的油茶新品種,本研究以油茶果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期種子為材料構(gòu)建了油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)和不同時(shí)期表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù),并在轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上對(duì)油茶種子α-亞麻酸代謝途徑及其相關(guān)基因在種子不同時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行了分析,同時(shí)對(duì)各關(guān)鍵酶基因參與調(diào)控α-亞麻酸代謝過(guò)程關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的生化反應(yīng)進(jìn)行了分析研究。轉(zhuǎn)錄組基因注釋過(guò)程中KEGG是有關(guān)Pathway主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Kanehisaetal.,2008),通過(guò)Pathway顯著性富集可以確定差異表達(dá)基因參與的最主要的生化代謝途徑以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(聶志揚(yáng)等,2009)。油茶種子轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)基因注釋中Pathway顯著性富集可以確定α-亞麻酸代謝12種關(guān)鍵酶功能基因,各基因在α-亞麻酸代謝過(guò)程中分別調(diào)控不同節(jié)點(diǎn)的反應(yīng)進(jìn)程(圖2)。12種關(guān)鍵酶功能基因中PLA2,FAD2,FAD3等基因是調(diào)控油茶種子α-亞麻酸合成的關(guān)鍵酶基因,其他基因調(diào)控α-亞麻酸進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成多種不飽和脂肪酸的關(guān)鍵步驟。王鏡巖等(2002)研究表明植物中的脂肪酸脫飽和酶(FAD)不能直接作用于游離脂肪酸,但可直接對(duì)磷脂類(lèi)的脂肪酸鏈去飽和。PLA2可調(diào)控磷脂酰膽堿形成1-?；视土姿崮憠A(1-Acylglycerophosphocholine),FAD2調(diào)控磷脂酰膽堿分子中sn2位上油酸鏈12和13碳原子之間形成雙鍵生成亞油酸,亞油酸受FAD3調(diào)控在15和16碳原子之間進(jìn)一步形成雙鍵生成α-亞麻酸(王鏡巖等,2002),實(shí)現(xiàn)油茶種子成熟過(guò)程中α-亞麻酸的積累。所以磷脂酰膽堿是α-亞麻酸合成的最初底物,FAD2調(diào)控著油茶油脂中油酸和亞油酸的比例,FAD3調(diào)控油茶種子α-亞麻酸含量。油茶種子不同時(shí)期表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析顯示PLA2,FAD2在油茶果實(shí)膨大期有高豐度表達(dá)到油脂合成高峰期表達(dá)上調(diào)幅度很大,說(shuō)明油茶種子發(fā)育過(guò)程中始終有油酸和亞油酸的積累,而FAD3在油茶果實(shí)膨大期表達(dá)量較低,到油脂合成高峰期表達(dá)雖有上調(diào)但上調(diào)倍數(shù)不到2(表3),這可能是油茶種子α-亞麻酸含量不高的主要原因。目前FAD2和FAD3基因已經(jīng)分別在油茶、擬南芥、花生、麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)、大豆、油菜(Brassicanapus)等植物中發(fā)現(xiàn)并克隆出來(lái)(譚曉風(fēng)等,2008;謝金喜等,2007;張皙等,2007;石東喬等,1999;付瑜華等,2012;李曉丹,2007)。α-亞麻酸在茶油成分中含量不高也與α-亞麻酸合成后進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成多種不飽和脂肪酸有關(guān)。DOX和LOX是調(diào)控α-亞麻酸向其他不飽和酸物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶基因,DOX在擬南芥和煙草中研究較多,現(xiàn)已分別克隆得到基因序列(馬龍等,2007),可調(diào)控α-亞麻酸進(jìn)行α-氧化形成2(R)-氫過(guò)氧化物-十八碳三烯酸[(2R)-(9Z,12Z,15Z)-2-hydroxyoct-adecatri-9,12,15-enoicacid],繼而進(jìn)一步形成2(R)-羥基-十八碳三烯酸[(2R)-(9Z,12Z,15Z)-2-hydroxyoctadecatri-9,12,15-enoicacid]或十七碳三烯酸等不飽和脂肪酸(馬龍等,2007),圖2清楚顯示了這一過(guò)程。表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析DOX基因在油茶果實(shí)膨大期中豐度表達(dá)且油脂合成高峰期表達(dá)下調(diào),并未隨α-亞麻酸的積累表達(dá)加強(qiáng),這有利于油脂合成高峰期α-亞麻酸的積累。LOX廣泛存在于需氧生物中(Hartmutetal.,2002),調(diào)控α-亞麻酸氧化生成脂肪酸氫過(guò)氧化物(Alexander,1998),LOX表達(dá)貫穿于植物生活史的整個(gè)過(guò)程(Portaetal.,2002)。圖2顯示LOX作用形成的脂肪酸氫過(guò)氧化物一方面經(jīng)AOS調(diào)控進(jìn)一步氧化形成環(huán)氧-十八碳三烯酸等多種不飽和脂肪酸,這些氧化物的形成不利于油茶優(yōu)良品質(zhì)形成,另一方面經(jīng)HPL調(diào)控分解形成斷鏈的醛(C6-或者C9-)和相應(yīng)