原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物菌種選育中的應(yīng)用

原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物菌種選育中的應(yīng)用

20世紀60年代，原生質(zhì)體融合（proto癌）技術(shù)始于20世紀60年代。1960年法國Karski研究小組在兩種不同類型的動物細胞混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)融合現(xiàn)象。1974年,匈牙利Ferenczy報道了白地霉(Geotrichumcandidum)的營養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體的融合。原生質(zhì)體融合育種已從微生物種內(nèi)融合擴展到界間的融合(如光合細菌與酵母菌的融合)。1979年匈牙利的Pesti首先報道融合育種提高青霉素產(chǎn)量,原生質(zhì)體融合技術(shù)成為改良工業(yè)菌株的手段之一。本文綜述原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物菌種選育中的應(yīng)用。1種間原生質(zhì)體融合對農(nóng)抗穿刺活性的影響利用原生質(zhì)體融合技術(shù)不但可用于提高抗生素產(chǎn)量,同時還可用于融合子產(chǎn)生新的抗生素的研究,特別是在鏈霉菌育種中。賀敏霞等通過諾卡氏菌原生質(zhì)體融合重組研究發(fā)現(xiàn)3株融合子產(chǎn)生親本沒有的抗生物質(zhì),還得到1株甾體轉(zhuǎn)化活力明顯高于親本的融合子。林榮團等以天然無抗菌活性的變青鏈霉菌1326與鏈霉菌1254營養(yǎng)缺陷型突變株進行種間原生質(zhì)體融合,篩選到5株抗菌活性較穩(wěn)定的融合菌株。曾洪梅等通過原生質(zhì)體融合的方法提高了農(nóng)抗武夷菌素的效價。陳五嶺等通過比較He-Ne激光和聚乙二醇(PEG)對紅霉素鏈霉菌(SE)和龜裂鏈霉菌(SR)滅活原生質(zhì)體的誘導(dǎo)融合,篩選得到幾株紅霉素產(chǎn)量與親本相比有明顯差異的融合子,產(chǎn)抗生素能力與親本的相比,最多提高了28.04%。王金盛等以小諾霉素(Micronomicin,MCR)產(chǎn)生菌棘孢小單胞菌(Micromonsporaechinospora)為出發(fā)菌株,通過單親致死原生質(zhì)體融合,以鏈霉素為選擇條件選出融合株,篩得4株MCR百分含量高于親株的融合子。2原生質(zhì)體融合技術(shù)龐小燕等以酒精酵母和熱帶假絲酵母為親本,通過原生質(zhì)體融合技術(shù),獲得了既具有糖化酶活性又能高產(chǎn)酒精的穩(wěn)定的酵母融合株,酒精發(fā)酵產(chǎn)量可達8.8%和11.5%。高年發(fā)等將釀酒酵母與粟酒裂殖酵母進行屬間原生質(zhì)體融合選育到降解蘋果酸強的菌株。高玉榮利用發(fā)酵力強的葡萄酒酵母與降酸能力強,發(fā)酵性能好的粟酒裂殖酵母融合,獲得的融合子酵母具有:(1)安全性能好,穩(wěn)定性強;(2)單菌株發(fā)酵,易管理,操作簡單穩(wěn)定;(3)生產(chǎn)產(chǎn)品口味好,口感穩(wěn)定,用原生質(zhì)體融合技術(shù)的培養(yǎng)選育出的優(yōu)良菌株降酸率可達30.4%,比葡萄酒酵母的降酸性提高20%。Kumari等將能夠分解纖維素的TrichodermareeseiQM9414和從葡萄糖產(chǎn)酒精的SaccharomycescerevisiaeNCIM3288進行融合,得到2株(M14和M62)具有很強的將濾紙纖維素轉(zhuǎn)化為酒精的能力。趙華等成功地對酒精酵母(K酵母)和產(chǎn)酯酵母(F2)進行了屬間細胞融合,得到既具有酒精酵母的高產(chǎn)酒特性,又具有產(chǎn)酯酵母的高產(chǎn)酯特性的發(fā)酵性能穩(wěn)定的融合子。杜連祥等進行糖化酵母單倍體H-3(2)-2菌株與優(yōu)良嗜殺啤酒酵母5-24菌株的原生質(zhì)體細胞融合,將糖化酵母的糖化酶基因轉(zhuǎn)移到嗜殺啤酒酵母中,獲得1株高發(fā)酵度嗜殺啤酒酵母F-35-88菌株。啤酒酵母(S.cerevisiae)凝集性良好,可使啤酒發(fā)酵液澄清速度加快,降低分離酵母時的能量還可防止酵母細胞自溶而影響啤酒風(fēng)味。啤酒酵母的凝集特性由其本身的遺傳特性決定。一般凝集性較好的啤酒酵母往往發(fā)酵度偏低。陳海昌等應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出的融合子FP19,既具有較高的發(fā)酵度又具有較強的凝集性。許多種微生物能在45-65℃生存,有的甚至更高。微生物耐熱性的機理還不很清楚,但其耐熱性卻有重要的價值。在酒精釀造中,釀酒酵母于40℃時產(chǎn)酒明顯下降。為此必需消耗大量能源降低發(fā)酵液的溫度。文鐵橋等通過PEG誘導(dǎo)碘乙酸滅活呼吸缺陷克魯維酵母原生質(zhì)體與釀酒酵母原生質(zhì)體融合,獲得45℃發(fā)酵產(chǎn)酒率高達8.7%的高溫酵母菌株AY006。3原生質(zhì)體融合技術(shù)通過原生質(zhì)體融合技術(shù)使兩個菌株的遺傳物質(zhì)得到重組,從而建得兼具兩個親本優(yōu)良性狀的新菌株。張清文等以多糖產(chǎn)生菌T和胡蘿卜素產(chǎn)生菌C1-B為雙親,用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出了1株既產(chǎn)多糖又產(chǎn)胡蘿卜素的雜交品系。韋革宏等將RhizobiumleguminosoumUSDA2370和SinorhizobiumxinjiangnesisCCBAU110進行原生質(zhì)體融合,獲得了USDA2370和CCBAU110的屬間融合菌株,該融合菌株可分別在雙親寄主植物上結(jié)瘤。JianxiuYu等將BacillusthuringiensisS184和TnX兩菌株進行融合,將cyt1Aa和cry11Aa基因成功地組合到一個菌株中,得到高毒力菌種。林紅雨等將串聯(lián)發(fā)酵D-葡萄糖產(chǎn)生2-酮基-L-古龍酸的歐文氏菌和棒桿菌的細胞融合,獲得能夠穩(wěn)定地將D-葡萄糖一步轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸的融合子。唐寶英等將具有解鉀活性的硅酸鹽細菌-膠質(zhì)芽孢桿菌(B.mucilaginesus)W9-12與具有殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)B179208原生質(zhì)體進行了融合,融合子既具解鉀活性,又具有殺蟲活性。陳五嶺等在雙親滅活原生質(zhì)體融合選育蘇云金桿菌新菌株的過程中,最終篩選出1株毒力效價較雙親分別提高41%和117%的新菌株。王憲川等應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù),得到了即殺鱗翅目昆蟲,又殺雙翅目害蟲的重組菌株。又如枯草芽胞桿菌(B.subtilisTG26)產(chǎn)生抗菌蛋白,能抑制同種或不同種屬微生物的生長。B.thuringiensissubsp.PacifeusAS1.904產(chǎn)生伴胞晶體蛋白,能殺植物害蟲。王雅平等通過原生質(zhì)體融合獲得了能表達親株抗菌蛋白和毒素蛋白的融合株。原生質(zhì)體融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于酶的研究。研究最多的是淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶,主要用于提高菌種的產(chǎn)酶活力、改變菌種酶分泌的種類或使產(chǎn)酶菌種獲得新的優(yōu)良性狀等。日本W(wǎng)aseda大學(xué)應(yīng)用此技術(shù)以檸檬酸生產(chǎn)菌株黑曲霉(A.niger)和纖維素酶產(chǎn)生菌綠色木霉(Trichodermaviride)為親本,融合后篩選到一類融合子能在甘蔗渣固體培養(yǎng)基上生長產(chǎn)生檸檬酸。融合子兼具了綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的能力和黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的能力。王萍等以多粘芽胞桿菌(β淀粉酶高產(chǎn)菌株)和芽胞桿菌菌株(產(chǎn)耐熱性β淀粉酶,活性低)進行融合研究,得到了產(chǎn)酶能力介于兩親株之間,酶的熱穩(wěn)定性較高的融合株。曹軍等以棲土曲霉種內(nèi)非營養(yǎng)缺陷型進行原生質(zhì)體融合,融合子為雜合二倍體,產(chǎn)角蛋白酶活力較親本顯著提高。4菌株融合技術(shù)微生物處理污水技術(shù)往往涉及多種微生物、多種菌的優(yōu)化組合,原生質(zhì)體融合技術(shù)可以將多個菌的功能組合到一個菌。許燕濱等采用原生質(zhì)體融合技術(shù),將兩株具有含氯有機化合物降解特性的菌,假單胞菌T-1和諾卡氏菌RB-1融合構(gòu)建成一株高效降解含氯有機化合物工程菌。應(yīng)用于造紙漂白廢水,融合菌去除CODCr和TCL的能力,比混合菌分別提高了72.05%和190%。周德明采用原生原體融合技術(shù)將球形紅假單胞菌和釀酒酵母構(gòu)建成高效降解工程菌,用于廢水處理的比降解率明顯提高。裘娟萍等以紅發(fā)夫酵母(Phaffiarhodozyma)AS2.1557為出發(fā)株,經(jīng)誘變育種總色素含量提高8.5倍,總色素產(chǎn)量提高2倍。用生長弱、含量高的突變株與生長快、含量低的野生型進行原生質(zhì)體融合,融合子產(chǎn)量比高產(chǎn)親株提高169%。程樹培等將光合細菌與酵母菌進行原生質(zhì)體融合,用于連續(xù)發(fā)酵豆制品廢水處理。將釀酒酵母與熱帶假絲酵母原生質(zhì)體融合而成的雜種酵母細胞,在凈化味精廢水產(chǎn)生單細胞蛋白方面優(yōu)于雙親菌株,該雜種細胞以無菌液體石臘復(fù)蓋,存放于4℃冰箱1年之后,測定其菌體的比增長率,對淀粉的利用率、耐熱性能、絮凝性能和菌體蛋白的水平,同時與雙親株的同類指標進行比較,發(fā)現(xiàn)該雜種酵母細胞仍然綜合了雙親的優(yōu)勢,顯示出多功能性的特征。5原生質(zhì)體融合技術(shù)裘娟萍等以原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建廣譜抗噬菌體菌株。通過原生質(zhì)體融合技術(shù)還可對耐熱機理進行研究。如有一株耐高溫酵母一旦經(jīng)EB誘變失去線粒體變?yōu)樾【浜?即失去耐高溫特性。說明耐熱性與線粒體有關(guān)系。因而應(yīng)用原生質(zhì)體技術(shù)對耐熱性的轉(zhuǎn)移和對耐熱機理進行研究將是一條途徑。蔣文泓等以禽多殺性巴氏桿菌5A弱毒菌株與禽大腸桿菌02弱毒菌