京尼平對(duì)抑郁癥模型大鼠海馬內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響

京尼平對(duì)抑郁癥模型大鼠海馬內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響

京尼平是傳統(tǒng)中醫(yī)梔子的主要活性成分。京尼平可由梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解得到,可以與初級(jí)胺反應(yīng)生成天然的色素應(yīng)用于食品及染料工業(yè)。京尼平的藥理活性主要包括保肝利膽、抗菌消炎、抗血栓形成、抑制脂質(zhì)過氧化以及促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生與修復(fù)等。近年來,京尼平的抗抑郁作用引起了關(guān)注,本課題組前期采用1HNMR方法對(duì)大鼠血液和尿液進(jìn)行代謝組學(xué)研究,明確了京尼平的抗抑郁效果,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究旨在以被認(rèn)為與抑郁癥關(guān)系最為密切的腦內(nèi)海馬組織為研究對(duì)象,采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)其抗抑郁作用機(jī)制進(jìn)一步探討。Duman等認(rèn)為海馬神經(jīng)元的損傷和功能紊亂是抑郁癥發(fā)病的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)之一。慢性應(yīng)激與抑郁癥發(fā)病密切相關(guān),可引起大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元萎縮、變性和死亡。長(zhǎng)期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致HPA軸功能亢進(jìn),引起海馬神經(jīng)元退行性損傷、數(shù)目減少及再生障礙。研究還發(fā)現(xiàn)抑郁癥大鼠海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素等含量顯著降低,單胺氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性改變以及抑制性氨基酸(γ-氨基丁酸、甘氨酸)和興奮性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)含量改變,臨床研究及神經(jīng)成像分析也表明海馬組織參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。代謝組學(xué)是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物變化的一種新的系統(tǒng)生物學(xué)方法,其通過揭示新陳代謝動(dòng)態(tài)進(jìn)程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,較全面了解病理變化過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)、病理機(jī)制研究及藥物療效評(píng)價(jià)中展現(xiàn)了其特色和優(yōu)勢(shì)。本文在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用1HNMR代謝組學(xué)技術(shù)探討京尼平對(duì)大鼠海馬組織內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響,為進(jìn)一步闡明京尼平抗抑郁作用機(jī)制提供依據(jù)。造模、造模和損害是否被長(zhǎng)期給藥藥品、試劑和儀器鹽酸文拉法辛膠囊(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,規(guī)格:25mg/粒,批號(hào):090705);D2O(美國(guó)默克試劑公司);京尼平(臨川之信生物科技有限公司,規(guī)格:98%,批號(hào):20110505);UP-250超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Bruker600MHzAvanceIIINMR譜儀(德國(guó)布魯克公司);大鼠曠場(chǎng)行為測(cè)試箱,自制。動(dòng)物SPF級(jí)成年雄性SD大鼠,體重(200±10)g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2011-0012。分組及給藥所有大鼠飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境,然后隨機(jī)分成空白組(control)、模型組(model)、文拉法辛組(venlafaxine)、京尼平低劑量組(25mg·kg-1)、中劑量組(50mg·kg-1)和高劑量組(100mg·kg-1),每組8只。除空白組外,所有動(dòng)物前兩周只造模不給藥,后兩周邊造模邊給藥,給藥組分別灌胃相應(yīng)的藥物,空白組和模型組灌胃等量注射用生理鹽水。造模方法模型組及給藥組通過慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(CUMS)程序進(jìn)行抑郁造模,造模的方法參照文獻(xiàn),給予的刺激因素包括夾尾5min、禁水24h、禁食24h、電擊足底、陌生物體、4℃冰水游泳5min、束縛應(yīng)激4h、45℃熱刺激5min以及噪音刺激3h。每天給予各組大鼠1種應(yīng)激刺激,持續(xù)4周。體重及糖水偏愛測(cè)定造模第0、7、14、21和28天分別測(cè)定大鼠體重。糖水偏愛實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn),造模前一周對(duì)大鼠進(jìn)行1%糖水偏愛訓(xùn)練(每個(gè)鼠籠放置事先定量的兩個(gè)水瓶:1瓶純水、1瓶1%糖水)。造模第0、7、14、21和28天分別測(cè)定純水和糖水消耗量,以糖水偏愛率(糖水消耗量/總液體消耗量×100%)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。糖水偏愛訓(xùn)練和測(cè)定均在大鼠禁水24h后進(jìn)行。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)于造模第0、14和28天進(jìn)行,參照文獻(xiàn),將大鼠放入自制曠場(chǎng)行為測(cè)試箱的中心位置,適應(yīng)2min后,觀察4min內(nèi)大鼠的直立次數(shù)、靜止時(shí)間和穿格數(shù)。海馬組織的采集實(shí)驗(yàn)第28天,以20%烏拉坦腹腔注射麻醉后,對(duì)大鼠海馬解剖,并將海馬組織置于2mL凍存管中,液氮速凍后保存于-80℃冰箱,待分析。海馬組織的1HNMR測(cè)定參考文獻(xiàn)方法,稱取海馬組織40mg于1.5mL離心管中,加入含TSP的磷酸鹽緩沖液(D2O配制,pH7.4)700μL,超聲勻漿,以13000r·min-1離心15min,取上清液600μL置于5mm核磁管中,于600MHzNMR儀上進(jìn)行1HNMR測(cè)定。采用弛豫時(shí)間編輯(Carr-Purcell-Meiboom-Gill,CPMG)脈沖序列,弛豫延遲320ms,譜寬為8kHz,掃描次數(shù)為64。1HNMR譜圖數(shù)據(jù)處理與分析核磁圖譜采用MestReNova(MestrelabResearch,SantiagodeCom-postella,Spain)處理,以TSP的化學(xué)位移為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)譜圖進(jìn)行校正并進(jìn)行相位、基線調(diào)整,參照文獻(xiàn)并結(jié)合ChenomxNMRSuite(ChenomxInc.,Edmonton,AB,Canada)軟件對(duì)譜圖中的信號(hào)進(jìn)行歸屬,δ0.5~4.7區(qū)域按δ0.02分段積分,所得積分值歸一化處理,導(dǎo)入SIMCA-P13.0(Umetric,Sweden)軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。R2X、R2Y表示PLS-DA模型的擬合情況,Q2表示模型的可預(yù)測(cè)度,它們的大小直接反映模型的可靠程度,其值越大越可靠。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件處理,以u(píng)e0af±s表示,采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)對(duì)行為學(xué)指標(biāo)及差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和比較,以P<0.05,P<0.01為差異具有顯著性。結(jié)果1探索和運(yùn)動(dòng)能力以及緊張恐懼狀態(tài)體重、糖水偏愛率和曠場(chǎng)行為是CUMS造模的行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)。體重直接反映了大鼠飲食和消化情況;糖水偏愛率反映動(dòng)物對(duì)獎(jiǎng)賞反應(yīng)程度;曠場(chǎng)行為反映大鼠在新異環(huán)境中的探索和運(yùn)動(dòng)能力以及緊張恐懼狀態(tài)。本研究中,與空白組相比,模型組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢、糖水偏愛率低、穿格數(shù)和直立次數(shù)明顯偏少(P<0.05,P<0.01),表明CUMS造模程序引起了大鼠食欲下降、快感缺乏以及運(yùn)動(dòng)能力和探索能力下降,模型復(fù)制成功,連續(xù)給予京尼平兩周后,與模型組相比,大鼠體重、糖水偏愛率升高(P<0.05),自主活動(dòng)及探索行為增強(qiáng)(P<0.05),表明京尼平具有良好的抗抑郁作用。2麻醉劑烏拉坦光譜圖中的代謝成分空白組大鼠海馬組織1HNMR典型譜圖(圖1)主要來源于小分子化合物,圖中δ1.24處的三重峰來自麻醉劑烏拉坦,信號(hào)指認(rèn)及統(tǒng)計(jì)分析時(shí)均予以排除。譜圖中的信號(hào)參照文獻(xiàn)并結(jié)合ChenomxNMRSuite軟件分析,共指認(rèn)出17種代謝物,主要來源于氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和能量代謝。其化學(xué)位移及譜峰歸屬見表1。3京尼平對(duì)大鼠海馬代謝產(chǎn)物的活性影響1HNMR圖譜提供了海馬組織中內(nèi)源性代謝物的基本信息,但直觀分析難以確定各組間的代謝物差異。如果要準(zhǔn)確反映各組之間的微小差異,需通過對(duì)復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理,有效消除多信息共存中重疊部分而提取出主要成分進(jìn)行分析。采用有監(jiān)督的偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)對(duì)各組進(jìn)行差異分析,結(jié)果見圖2?？瞻捉M和模型組沿t軸明顯分開(R2X:50.7%,R2Y:76.2%,Q2:67.3%),表明大鼠抑郁癥模型復(fù)制成功。各給藥組與模型組沿t軸明顯分開,京尼平低劑量與高劑量有部分重疊,中劑量組與文拉法辛組更為接近,表明京尼平中劑量具有更好的抗抑郁作用。為進(jìn)一步確定造模前后及藥物干預(yù)后代謝物的變化情況,采用PLS-DA分析對(duì)模型組、空白組和各給藥組進(jìn)行單獨(dú)分析,得到PLS-DA得分圖和S-VIPplot圖(圖3)。圖中“S”曲線中每一個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)變量,變量對(duì)分類的重要程度由VIP(variableimportanceintheprojection)值的大小來衡量,變量越遠(yuǎn)離原點(diǎn),VIP值越大。根據(jù)VIP值對(duì)變量進(jìn)行篩選,VIP>1作為尋找差異代謝物候選物質(zhì)。通過對(duì)空白組和模型組的PLS-DA分析(圖3A),空白組和模型組明顯分開,與行為學(xué)結(jié)果一致。對(duì)“S”曲線上VIP>1的代謝物峰面積用SPSS軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),得到8個(gè)具有顯著性差異(P<0.05)的潛在生物標(biāo)志物,由圖3A和圖4可知,模型組海馬代謝產(chǎn)物中乳酸、谷氨酸、肌醇、丙氨酸、谷氨酰胺和?；撬岷可?而N-乙酰天冬氨酸、甘氨酸含量下降(P<0.05,P<0.01,圖3A)。藥物干預(yù)后(圖3B,C,D,E),與模型組比較,PLS-DA得分圖顯示給藥組與模型組都能明顯分開,與行為學(xué)結(jié)果一致,文拉法辛和京尼平均能不同程度地使7種潛在代謝標(biāo)志物(除?；撬嵬?向正常狀態(tài)回調(diào)(圖4)。文拉法辛組乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺和肌醇含量下降,N-乙酰天冬氨酸和甘氨酸含量升高,均有顯著性差異(P<0.05,圖3B,圖4)。京尼平高、中、低劑量可以使抑郁模型大鼠海馬組織中N-乙酰天冬氨酸、甘氨酸含量升高,肌醇含量降低(P<0.05);中劑量還能顯著調(diào)節(jié)乳酸、丙氨酸和谷氨酸含量,恢復(fù)至正常狀態(tài)(圖3C,D,E,圖4),表明京尼平中劑量具有更好的抗抑郁效果。京尼平對(duì)抑郁癥患者多態(tài)性化合物結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用抑郁癥是一種以情緒低落、思維遲緩以及言語動(dòng)作減少為主要特點(diǎn)的情志障礙性精神疾患,嚴(yán)重危害人類身心健康。大量文獻(xiàn)報(bào)道海馬與抑郁癥有著密切的關(guān)系,應(yīng)激和抑郁可引起海馬體積萎縮,中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。現(xiàn)有抗抑郁藥通過促進(jìn)海馬細(xì)胞增殖和神經(jīng)元數(shù)目增加、抵抗或克服應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元萎縮和丟失,實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。文拉法辛是一種選擇性5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑類抗抑郁藥,能增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些神經(jīng)遞質(zhì)的活性。本實(shí)驗(yàn)中,以海馬為研究對(duì)象、文拉法辛為陽性對(duì)照藥研究京尼平抗抑郁效果及其作用機(jī)制。復(fù)制與抑郁癥患者臨床癥狀最為接近的CUMS抑郁模型,行為學(xué)結(jié)果表明模型復(fù)制成功。代謝組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),海馬組織的N-乙酰天冬氨酸、乳酸、肌醇、?；撬?、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺受CUMS程序影響較大,具有顯著變化(P<0.05,P<0.01),可能為抑郁癥模型大鼠海馬組織中潛在的生物標(biāo)志物。給予京尼平后,N-乙酰天冬氨酸、乳酸、丙氨酸、肌醇、甘氨酸和谷氨酸水平不同程度地向正常水平回調(diào),其中以京尼平中劑量的調(diào)節(jié)作用最為顯著。海馬中顯著變化的乳酸和丙氨酸在CUMS模型大鼠血液中也發(fā)現(xiàn)有同樣的變化趨勢(shì)。模型組大鼠海馬組織中高濃度的乳酸可能是組織中能量代謝異常導(dǎo)致腦部供能供氧不足而產(chǎn)生,過多的乳酸可引起酸中毒,在腦部加劇細(xì)胞毒性腦水腫,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞也具有直接的損傷作用。丙氨酸是一種脂肪族的非極性氨基酸,具有協(xié)助葡萄糖代謝、改善機(jī)體能量供應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)中乳酸和丙氨酸水平的顯著變化表明抑郁癥的發(fā)生涉及到能量代謝異常。給予京尼平后,丙氨酸和乳酸濃度降低,趨向正常水平,提示京尼平可改善抑郁癥能量代謝異常而發(fā)揮抗抑郁效果。模型大鼠海馬中N-乙酰天冬氨酸水平降低、肌醇水平升高。N-乙酰天冬氨酸不存在于成熟的神經(jīng)膠質(zhì)及血液中,只在神經(jīng)元細(xì)胞中才能檢測(cè)到,是神經(jīng)元的特有內(nèi)標(biāo)物,其濃度的下降能夠反映神經(jīng)元的凋亡、功能損害或活性降低。肌醇是一種“生物活素”,參與體內(nèi)的新陳代謝活動(dòng),具有免疫、預(yù)防和治療某些疾病等多種作用。在神經(jīng)系統(tǒng)方面,肌醇可作為第二信使影響神經(jīng)遞質(zhì)功能的平衡,而且在維護(hù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)中起重要作用。N-乙酰天冬氨酸和肌醇的顯著變化表明在模型大鼠海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞已經(jīng)受到一定程度的功能或活性的損害,肌醇為了調(diào)節(jié)腦內(nèi)代謝異常以維持平衡而升高。京尼平能有效地回調(diào)N-乙酰天冬氨酸和肌醇,顯示了其具有增強(qiáng)神經(jīng)元活性、保護(hù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和促進(jìn)神經(jīng)元功能的作用。綜上所述,在海馬組織中檢測(cè)到的17種代謝物中,甘氨酸、谷氨酸、肌醇、N-乙酰天冬氨酸、乳酸、谷氨酰胺、丙氨酸、?；撬釣橐钟舭Y海馬組織中潛在的標(biāo)志性代謝物。京尼平可不同程度回調(diào)甘氨酸、谷氨酸、肌醇、N-乙酰天冬氨酸、乳酸和丙氨酸水平,其中京尼平中劑量(50mg·kg-1)調(diào)節(jié)作用最為顯著,抗抑郁效果最好。變化的代謝物對(duì)能量代謝以及海馬組織神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮具有重要影響。京尼平可能是通過增強(qiáng)海馬組織中神經(jīng)元的活性、修復(fù)和改善神經(jīng)元的功能、改善抑郁癥組織中能量代謝異常而發(fā)揮作用。代謝組學(xué)技術(shù)為藥物作用機(jī)制的研究提供了一個(gè)良好的平臺(tái),能較為全面地反映生物體藥物干預(yù)作用下的代謝狀態(tài)的變化,并能通過某些代謝物含量的差異推斷藥物的作用機(jī)制,具有較好的應(yīng)用前景。神經(jīng)元的損傷或功能障礙是抑郁癥發(fā)生的重要機(jī)制之一。抑郁癥患者腦組織中神經(jīng)膠質(zhì)功能受損影響谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)