中草藥抗菌活性的研究

中草藥抗菌活性的研究

食品腐敗和變質(zhì)主要是由有害微生物引起的。目前食品防腐保鮮采用的主要是化學(xué)合成試劑,如苯甲酸、山梨酸及其鹽類等,但有研究表明有些化學(xué)合成的食品防腐劑具有致癌、致畸,致突變等毒副作用。隨著消費(fèi)者對食品質(zhì)量的日益重視,尋求能夠替代化學(xué)防腐劑的天然食品防腐劑,成為了食品科學(xué)研究和應(yīng)用的一個熱點,對天然植物的抗菌活性的研究也取得了一些進(jìn)展。本實驗選取了常用于臨床抗菌的十味植物源中草藥,并以六株食品中常見污染菌為供試菌,進(jìn)行體外抗菌試驗,從而為天然植物防腐劑開發(fā)和應(yīng)用提供理論。1材料和方法1.1材料表面1.1.1中藥樣品十味中草藥樣品均購于北京市前門同仁堂藥店,各中草藥樣品的名稱、產(chǎn)地、所用部位及提取方法詳見表1。1.1.2供試菌株及菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)AS1.89、大腸桿菌(Escherichiacoli)AS1.90、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)AS1.1849、啤酒酵母(Saccharomycete)AS2.430、黃曲霉(Aspergillusflavus)AS3.3800及綠色木霉(Trichoderma)3.3711,以上六種供試菌均購于中科院微生物所。1.1.3儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52上海亞榮生化儀器廠;高壓滅菌釜MLS-3750日本三洋公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司。1.1.4試劑乙醇(分析純);無菌生理鹽水依據(jù)國標(biāo)(GB)配制。1.2方法1.2.1水煎水溶液的制備取粉碎后的中草藥100g于1000ml蒸餾水中,室溫浸泡30min后煮沸10min,稍加冷卻后過濾得到水煎液;剩余藥渣中加入500ml蒸餾水煮沸10min,重復(fù)兩次;合并兩次水煎液,減壓蒸餾濃縮至100ml,經(jīng)121℃滅菌25min后,于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?此為100%的水煎藥液。100%藥液濃度定義為1g原料提取液濃縮至1ml的濃度。1.2.2%乙醇提取水溶液取粉碎后的中草藥50g于500ml的70%乙醇水溶液中,加熱回流3h,稍加冷卻后過濾得到粗提取液;通過減壓蒸餾去除其中的乙醇,使其濃縮至100ml,經(jīng)121℃滅菌25min后,于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?此為1/2的70%乙醇提取藥液?？瞻讟右撼?0ml蒸餾水代替中草藥外,其余同上。1.2.3菌種活化和活化將各細(xì)菌實驗菌種分別接種于若干營養(yǎng)瓊脂斜面上,于37℃培養(yǎng)24h;將酵母菌和霉菌實驗菌種分別接種于若干PDA斜面上,于30℃培養(yǎng)72h,進(jìn)行菌種活化。活化后的細(xì)菌和酵母,做十倍系列稀釋,并活菌計數(shù)?；罨蟮拿咕苯右迫脒m量無菌生理鹽水中,充分振蕩,制成供試菌液。1.2.4菌種和真菌培養(yǎng)用無菌蒸餾水對藥液進(jìn)行一系列二倍稀釋,得到十個系列濃度的藥液(1(原液)、l/2、1/4、l/8、l/16、l/32、1/64、1/128、l/256);將藥液與瓊脂培養(yǎng)基按1:10均勻混合,制成平板,取適量供試菌液進(jìn)行涂布接種(霉菌采用點接種);細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24h,真菌于30℃培養(yǎng)72h。以上藥液的濃度均為體積比(V/V)濃度。2結(jié)果與討論2.1對細(xì)菌的活性十味中草藥對真菌的抗菌活性:其濃度為1/10時對黃曲霉均未表現(xiàn)出抗菌活性,只有黃柏和黃芩在濃度為1/20時對啤酒酵母和綠色木霉有抗菌活性,厚樸在濃度為1/40時對啤酒酵母有抗菌活性。十味中草藥對細(xì)菌的抗菌活性:抗金黃色葡萄球菌活性>抗枯草芽孢桿菌活性>抗大腸桿菌活性。除川芎外的九種中草藥表現(xiàn)出一定抗金黃色葡萄球菌活性,其中黃連和黃芩在濃度小于1/640時仍有活性;對枯草芽孢桿菌,只有川芎和金銀花濃度為1/10時未表現(xiàn)出抗菌活性,而黃連在濃度為1/640時仍有活性;對大腸桿菌,只有黃芩、連翹、厚樸、艾葉和五味子在濃度為1/10到1/80之間時有抗菌活性。黃芩對黃曲霉外的其它供試菌均表現(xiàn)出一定抗菌活性,并在濃度為1/640時表現(xiàn)出抗金黃色葡萄球菌活性。黃柏濃度為1/10時對大腸桿菌和黃曲霉未表現(xiàn)出抗菌活性。厚樸濃度為1/10時對黃曲霉和綠色木霉未表現(xiàn)出抗菌活性。黃連在濃度為1/1280時仍對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抗菌活性,但對大腸桿菌未表現(xiàn)出活性。連翹、艾葉和五味子濃度為1/10時對酵母和霉菌未表現(xiàn)出抗菌活性,對供試細(xì)菌均有抗菌活性。甘草在濃度為1/20時對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抗菌活性,金銀花在濃度為1/80時對金黃色葡萄球菌有抗菌活性,其濃度為1/10時對其它供試菌無抗菌活性。川芎原液對所有供試菌均無抗菌活性。2.2空白對照處理采用70%乙醇對黃芩進(jìn)行提取,并對提取液進(jìn)行體外抗菌實驗,同時以水和70%乙醇溶液分別做空白對照。表3中詳細(xì)列出了黃芩水煎液和70%乙醇提取液的抗菌效力和最小抗菌濃度,所做空白對所有供試菌均無抗菌活性。2.3菌種抗菌活性由圖1可知,黃芩水煎液和70%乙醇提取液對其中五種供試菌均表現(xiàn)出抗菌活性。兩種樣液對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出了相同的抗菌活性,最小抗菌濃度為1/640;對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和綠色木霉也有不同程度的抗菌活性,70%乙醇提取液抗菌效力明顯大于水煎液,尤其是對枯草芽孢桿菌,70%乙醇提取液最小抗菌濃度為1/360,而水煎液最小抗菌濃度為1/20;但兩種藥液對黃曲霉無抗菌作用。2.4抑菌圈邊界不明顯體外抗菌試驗包括連續(xù)稀釋試驗和擴(kuò)散試驗,擴(kuò)散試驗加藥量少、抑菌圈界限不明顯,導(dǎo)致結(jié)果不易準(zhǔn)確記錄;連續(xù)稀釋法簡單、快速并且易于觀察結(jié)果,適宜于對抗菌活性好的中草藥進(jìn)行初步篩選,因此,本實驗采用連續(xù)稀釋法作為體外抗菌試驗方法。3乙醇提取液的抗菌活性測定十味中草藥水煎液的抗細(xì)菌活性大于抗真菌活性。其抗細(xì)菌活性又表現(xiàn)為對革蘭氏陽性菌的抗菌活性高于革蘭氏陰性菌;其抗酵母活性大于抗霉菌活性,并且對黃曲霉均未表現(xiàn)出抗菌活性。黃芩、黃柏和黃連表現(xiàn)出的抗菌活性相對較強(qiáng),其中黃芩抗菌活性好、抗菌譜寬;黃連對部分供試菌有較強(qiáng)抗菌活性,但其抗菌范圍較窄。連翹、厚樸、艾葉和五味子表現(xiàn)出的抗菌活性次之。甘草、川芎和金銀花抗菌活性較差,其中川芎對所有供試菌無抗菌活性。實驗表明,70%乙醇提取液的抗菌活性高于水煎液,這是由于乙醇將中草藥中的一些具有強(qiáng)抗菌活性成分提取出來,從而使醇提液表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌活性。對乙醇提取液中抗菌有效成分及其相互作用的研究將是下一步研究的重點,這將為植物源天然