基因工程制藥技術 基因工程操作流程

生化制藥工藝AcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplan項目五基因工程制藥1基因工程的概念2基因工程操作工具3基因工程操作流程目錄CONTENTS基因工程操作流程03Part2基因工程操作工具一、基因重組基本原理1、基本原理目的基因的獲取→→克隆載體的選擇和構建→→外源基因與載體的連接→→DNA導入受體菌→→重組體的篩選→→克隆基因的表達Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取1、化學合成法已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列基因數(shù)據(jù)庫核酸合成儀Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取2、基因組文庫存在于轉化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取3、cDNA文庫以mRNA為模板，利用反轉錄酶合成與mRNA互補的DNA，再復制成雙鏈cDNA，與適當載體連接后轉入受體菌，即獲得cDNA文庫Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取4、PCR（聚合酶鏈式反應）概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術原理：DNA復制條件：已知基因的核苷酸序列、四種脫氧核苷酸、一對引物、DNA聚合酶方式：以指數(shù)方式擴增，即2n（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）結果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增Part2基因工程操作工具二、目的基因的獲取4、PCR（聚合酶鏈式反應）過程DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板，在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA退火（復性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接1、連接工具T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶2、連接方式粘性末端連接（1）同一限制酶切位點連接Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式粘性末端連接（2）不同限制酶切位點連接Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式平末端連接適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式同聚物加尾連接在末端轉移酶（terminaltransferase）的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接Part2基因工程操作工具三、目的基因與載體的連接2、連接方式人工接頭（linker）連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠPart2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌1、受體細胞是指能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持、具有應用價值和理論研究價值的細胞條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)（competent）種類微生物受體細胞（原核、真核）植物受體細胞動物受體細胞Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌1、受體細胞原核生物受體細胞的特點沒有纖維素組成的細胞壁，便于外源DAN進入細胞內(nèi) 基因組簡單，便于進行遺傳分析單細胞生物，易于獲得一致性受體細胞培養(yǎng)條件簡單，生長快，實驗周期短主要的原核受體細胞大腸桿菌枯草桿菌應用構建基因組文庫表達基因產(chǎn)物保存和擴增目的基因Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌1、受體細胞酵母受體細胞結構簡單、遺傳背景比較清楚。具有真核生物蛋白翻譯后加工和修飾系統(tǒng)。不含特異性病毒和毒素，對人類安全。培養(yǎng)條件簡單，可進行大規(guī)模發(fā)酵。能將表達產(chǎn)物分泌到細胞外應用構建基因組文庫表達外源基因Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌1、受體細胞植物受體細胞具有體細胞全能性，一個分離的活細胞在合適的條件下可分化成植株具有堅硬的細胞壁，可以纖維素酶處理獲得原生質(zhì)體應用轉基因棉花水稻玉米馬鈴薯煙草Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌1、受體細胞動物受體細胞的特點體細胞一般無全能性，只能分化到細胞株生殖細胞、胚胎細胞等具有全能性，可分化、培養(yǎng)成轉基因動物應用轉基因羊轉基因鼠轉基因兔轉基因豬轉基因牛等Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌2、導入方式轉化（transformation）（1）鈣轉化細菌細胞在一定的生理狀態(tài)（感受態(tài)），或經(jīng)CaCl2處理，或制備成原生質(zhì)體的情況下，都可吸收外源DNA，利用這一特性可將重組DNA導入受體細胞中，用質(zhì)粒作載體的遺傳工程一般使用這種方法由于E.coli不會自發(fā)地產(chǎn)生感受態(tài)，因此E.coli的轉化一般采用鈣轉化法。該方法是將E.coli用冷CaCl2（0℃）

致敏，而后在高溫（42℃）下熱休克，這樣可使外原DNA進入受體細胞Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌2、導入方式轉化（transformation）（1）電穿孔轉化在高壓電場下使細胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外原DNA進入受體細胞。電穿孔法的轉化效率比鈣轉化法高2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉染Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌2、導入方式轉染（transfection）轉化感染（Transfection來自于transfomation與infection）凡是以噬菌體（如M13）或病毒為載體，以轉化的方法將DNA導入細胞的方法均稱為轉染。因此轉染就方法來說與轉化是一樣的Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌2、導入方式轉導（transduction）通過病毒將一個宿主的DNA轉移到另一個宿主的細胞中而引起的基因重組現(xiàn)象Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌2、導入方式顯微注射通過微量注射器將重組DNA直接注入受體細胞中基因槍基因槍顯微注射Part2基因工程操作工具四、重組DNA導入受體菌2、導入方式脂質(zhì)體介導法將重組DNA包裹在人工構建的磷脂雙分子層脂質(zhì)體中，通過原生質(zhì)體與脂質(zhì)體的融合或原生質(zhì)體的吞噬作用而將DNA轉移到細胞內(nèi)Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法抗藥性標記選擇利用載體DNA分子上的抗藥性篩選標記進行篩選的方法。主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉化子篩選。重組質(zhì)粒DNA分子攜帶特定的抗藥性選擇標記基因，在含有相應選擇藥物的選擇培養(yǎng)基上正常生長Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法標志補救（markerrescue）若克隆的基因能夠在宿主菌表達，且表達產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補，那么就可以利用營養(yǎng)突變菌株進行篩選Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法利用報告基因篩選植物轉化細胞在植物轉基因研究中，載體攜帶的選擇標記基因（selectivegene）經(jīng)常稱為報告基因（reportorgene），常用的報告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他特殊產(chǎn)物的基因等Part2基因工程操作工具五、重組體的篩選1、直接選擇法分子雜交法原位雜交Southern印跡形成噬菌斑篩選法外源DNA插入

噬菌體載體后，導入受菌體后，轉化子在培養(yǎng)基平板上被裂解形成噬菌斑，而非轉化子能正常生長，兩者很容易區(qū)分2、免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等Part2基因工程操作工具六、克隆基因的表達1、原核表達系統(tǒng)E.coli表達體系最為常用不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)很難表達大量可溶性蛋白2、真核表達系統(tǒng)酵母、昆蟲、