人工草地全放牧牛群bmerh-vp-e快速擴(kuò)繁技術(shù)體系的建立

人工草地全放牧牛群bmerh-vp-e快速擴(kuò)繁技術(shù)體系的建立

在1982年獲得體外受刺激的牛的卵母細(xì)胞后，在20世紀(jì)90年代中后期的10多年里，從屠宰現(xiàn)場屠宰的母離體雞蛋中采集了體外受刺激物。1988年采用超聲波(B超)引導(dǎo)從活母牛卵巢上采卵(Ultrasound-guidedtransvaginalfollicularaspiration)獲得成功,經(jīng)不斷改進(jìn)目前這已成為從活體母牛卵巢上采卵(Ovumpick-up,OPU)的主要方法。盡管OPU需要借助昂貴的設(shè)備,采卵操作難度較大,要求有豐富采卵經(jīng)驗(yàn)的操作人員,但能有效地克服用屠宰場來源卵母細(xì)胞進(jìn)行體外胚胎生產(chǎn)(Invitroembryoproduction,IVP)的諸多不足(如從卵巢采集到運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間難以保證及供體的遺傳背景不清等)。同時(shí),還可對幼齡、妊娠、繁殖障礙和老齡母牛采卵,且重復(fù)采卵對母牛生殖機(jī)能和健康不會(huì)造成不良影響。OPU與IVP和ET(Embryotransfer)技術(shù)結(jié)合,可極大地提高優(yōu)秀母牛的利用率和繁殖效率,生產(chǎn)系譜齊全、遺傳背景清楚的胚胎及其后代,緩解胚胎來源匱乏的問題,促進(jìn)胚胎移植的商業(yè)化進(jìn)程,并為克隆和轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料和必要手段。目前全球范圍內(nèi)已建立起一套牛IVP程序,并逐步走向商業(yè)化。在巴西,牛胚胎生產(chǎn)逐步由體內(nèi)胚胎(Invivo-derivedembryos)向體外胚胎(Invivo-derivedembryos)轉(zhuǎn)變。BMY牛是云南省從20世紀(jì)80年代初至今正在選育的熱帶亞熱帶肉牛,其血緣組成為1/2婆羅門(Brahman)、1/4莫累灰(Murraygrey)和1/4云南黃牛(Yunnanyellowcattle)。其特點(diǎn)是耐熱、抗蜱、適應(yīng)性強(qiáng);生長發(fā)育快、成熟早、繁殖力強(qiáng);產(chǎn)肉性能好、肉質(zhì)優(yōu)良;乳脂率、乳蛋白高。BMY牛在熱帶亞熱帶肉牛雜交改良中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)婆羅門牛、BMY牛的OPU-IVP及重復(fù)OPU對BMY母牛繁殖力的影響的研究已有報(bào)道,但尚未開展從IVP到胚胎移植的系統(tǒng)研究。為建立針對BMY牛的OPU-IVP-ET快速擴(kuò)繁技術(shù)體系,特開展本研究。1材料和方法1.1般資料,即在人工草地的放養(yǎng)前后,年在采卵前8～9d,用B超儀(SSD-900SE,Aloka,Co.Ltd,Tokyo,Japan)檢查BMY母牛子宮、卵巢(黃體、卵泡)狀況,選擇年齡3～11歲、健康、體重為(420～621)kg、膘情中等、性周期正常的空懷母牛95頭(其中供體14頭,受體81頭)。供、受體在人工草地全日制放牧飼養(yǎng),放牧草地以海法白三葉(Trifoliumrepenscv.Haifa)、威提特東非狼尾草(Pennisetumclandestinumcv.Whittet)、納羅克非洲狗尾草(Setariasphacelatacv.Narok)為主。冬、春季節(jié)補(bǔ)飼全株玉米青貯。1.2不同年齡及體重及前巢系統(tǒng)明顯的復(fù)模根據(jù)母牛卵巢上黃體(Corpusluteum,CL)和卵泡(Follicle)狀況,將供體分成2組:①CL組(n=7,年齡(8.43±1.67)歲,體重(545.00±46.98)kg):卵巢上有明顯的黃體;②對照組(Control,n=7,年齡(7.83±1.75)歲,體重(555.83±73.35)kg):卵巢上既無明顯CL、也無優(yōu)勢卵泡(Dominantfollicle,DF)或CL和DF同時(shí)存在。1.3活動(dòng)中的卵opu1.3.1其他常用的家庭暴力B超儀(B-modeultrasoundscanner,SSD-900SE)和7.5MHz扇形陰道探頭(Model:UST-M15-2512)(AlokaCo.Ltd.,Japan)、真空泵(COOK,WilliamCOOKAustraliaPTY.Ltd.)、恒溫槽(Fujihira,Industryco.,Ltd.,Japan);采卵器具包括:可更換的單腔金屬采卵針(19gauge、長度6.0或6.5cm、進(jìn)針管、采卵管、連結(jié)部(BectonDickinson,CuritibaParana,Brazil)和集卵管(50mL離心管)(Falcon)。對探頭背槽和進(jìn)針管作了必要的改良。1.3.2igma的血清D-PBS(GIBCO)+肝素鈉10IU·mL-1(Sigma)+胎犢血清(Fetuscalfserum,FCS)(Sigma)1%+青霉素(Sigma)100μL·mL-1+鏈霉素(Sigma)100μg·mL-1。1.3.3體外陰部的安裝將設(shè)備調(diào)試至工作狀態(tài),真空泵負(fù)壓調(diào)至80～85mmHg范圍。把與采卵相關(guān)的部件安裝在探頭上;連接好集卵管、真空泵和采卵針等部件,將集卵管置于37.5℃恒溫槽中。供體在保定架中站立保定,清除直腸中糞便,清洗和消毒外陰部;用2%鹽酸利多卡因(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭有限公司)3～5mL進(jìn)行硬膜外麻醉,待母牛尾根松軟無力后采卵。1.3.4陰道林布及陰道生長觀察采用超聲波引導(dǎo)穿過陰道采集卵母細(xì)胞(Transvaginalultrasoundguidedoocytecollection)。一只手把B超探頭緩慢地插入到陰道穹隆處,并把握好,另一只手通過直腸握卵巢并將其置于探頭上,從B超顯示屏觀察卵巢狀況。采卵針吸滿采卵液后插入裝在探頭上的采卵針筒中;用直腸中的手移動(dòng)卵巢使要穿刺的目標(biāo)卵泡(直徑2～8mm)位于B超顯示屏采卵線上的最佳位置,用把握探頭的手推動(dòng)進(jìn)針管,確定采卵針尖的位置,使針頭刺破陰道壁和卵泡壁,同時(shí)腳踏真空泵開關(guān),吸取卵泡內(nèi)容物(卵母細(xì)胞及卵泡液)到集卵管中。1.4卵丘-卵母細(xì)胞的形態(tài)特征卵泡液連同采卵液倒入濾器中(WTA,Brazil),用含10%FCS的PBS液稀釋、洗滌3～4次后將液體倒入培養(yǎng)皿(Falcon)或帶有側(cè)濾網(wǎng)的胚胎濾杯(Fujihira,Japan)中靜置10～15min,在實(shí)體顯微鏡(Olympus,SZ-ST,Tokyo,Japan)下收集卵母細(xì)胞。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將卵母細(xì)胞分為4級(jí):Ⅰ級(jí):卵母細(xì)胞色澤均勻,卵母細(xì)胞周圍包圍≥4層卵丘細(xì)胞,卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Thecumulusoocytescomplexes,COCs)完整,致密有序排列;Ⅱ級(jí):卵母細(xì)胞質(zhì)色澤均勻、卵母細(xì)胞周圍包有3層卵丘細(xì)胞,COCs完整;Ⅲ級(jí):卵母細(xì)胞色澤基本均勻、卵母細(xì)胞周圍包有1～2層卵丘細(xì)胞,COCs基本完整;Ⅳ級(jí):卵母細(xì)胞質(zhì)色澤基本均勻,卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞擴(kuò)散(Oocyteswithexpandedcumulus)、裸卵(Denudedoocytes)、閉鎖卵(Atresicoocytes)和退化卵(Degenerateoocytes)。選擇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)及Ⅳ級(jí)中卵質(zhì)較好的部分半裸卵和裸卵供IVM。1.5biongeanratchalhartraft、l-1h-1e2的生長培養(yǎng)液為TCM-199(Gibco)+5%FCS(Gibco)+10μL·mL-1FSH(Folltropin-V,BioncheAnimalhealthCanadaINC)、10μL·mL-1LH和10μL·mL-1E2。培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中將其做成多個(gè)100μL的培養(yǎng)微滴,每個(gè)微滴中放入COCs20～30枚,覆蓋石蠟油,在38.5°C、95%空氣、5%CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱(Forma3111,ThermoFisher)中IVM20～22h。1.6精子活力的測定8057號(hào)BMY公牛冷凍精液(規(guī)格:0.25mL;批號(hào):080126,云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院和云南省家畜冷凍精液站生產(chǎn))按常規(guī)方法解凍后倒入離心管內(nèi),加入7mL精子獲能液(Sperm-TALP),用離心機(jī)(H-103N,Kokusan,Japan)以1800r·min-1離心5min,盡快吸棄上清液,留1～2mL,用同樣方法第2次離心,留1mL,加1mL受精液(Fert-TALP),使稀釋后精子活力達(dá)0.40～0.45,密度3×106個(gè)·mL-1以上。經(jīng)IVM的卵母細(xì)胞放入已加入精液的受精液微滴中(每滴15～20枚),在與IVM相同的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h。1.7囊胚類型的篩選受精卵用含5%FCS的合成輸卵管液(Thesyntheticoviductfluid,SOF)微滴,在與IVM相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～8d,在第7天統(tǒng)計(jì)囊胚數(shù)。在倒置顯微鏡(DMIL,Leica,Germany)下觀察胚胎形態(tài),按國際胚胎移植學(xué)會(huì)(Theinternationalembryotransfersociety,IETS)的胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí),選擇A、B級(jí)囊胚供移植。BMY牛供體的采卵(OPU)、IVP程序如圖1所示。1.8受體牛類型配合比移植用B型超聲波診斷儀(SSD-900SE)對BMY空懷母牛的子宮、卵巢(黃體、卵泡)狀況進(jìn)行檢查,共選擇81頭受體。根據(jù)受體卵巢上黃體與卵泡發(fā)育狀況分為3個(gè)組:①CL組(n=34):卵巢上有明顯的黃體;②CL-DF組(n=15):卵巢一側(cè)存在明顯的CL,另一側(cè)有DF;③DF-H-OV組(n=32):卵巢上存在DF,或母牛正處于發(fā)情(Heat)或剛排卵(Ovulation)。受體牛同期發(fā)情處理與胚胎移植程序如圖1所示:第0天放置孕酮陰道栓CUE-MATETM(含1.56g孕酮,DuirsPfarmAgLtd.),同時(shí)注射苯甲酸雌二醇(Estradiolbenzoate,EB)2mg(寧波市三生藥業(yè)有限公司);第8天撤出CUE-MATETM,并注射PGF2α類似物(Analogue)-氯前列烯醇0.4mg(上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所控股企業(yè)丹東市和華動(dòng)物藥有限公司)和注射FSH100IU(寧波第二激素廠);不觀察發(fā)情,在第16～17天用B型超聲波診斷儀(SSD-900SE)檢查受體的CL狀況,選擇CL合格的受體進(jìn)行鮮胚(通過OPU-IVP獲得)移植。對受體用2%鹽酸利多卡因(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭有限公司)3～5mL進(jìn)行硬膜外麻醉后用非手術(shù)法移植胚胎;移植時(shí)隨機(jī)選擇26頭受體注射GnRH(Factrel,FortDodgeAnimalHealth,USA)100mg·頭-1,30頭不注射GnRH作為對照組,在移植后45d用便攜式超聲波診斷儀(HS-101V,HONDA,Japan)進(jìn)行妊娠診斷。1.9統(tǒng)計(jì)分析采用SPPS11進(jìn)行t檢驗(yàn)(t-test)和χ2(Chi-squaretest)檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1wo和ivp2.1.1iiim及級(jí)卵母細(xì)胞的選擇對14頭BMY牛供體OPU一次,累計(jì)獲卵母細(xì)胞329枚(頭均(23.50±10.56)枚),其中Ⅰ～Ⅲ級(jí)242枚(頭均(17.29±7.63)枚);獲卵母細(xì)胞數(shù)10枚以下、11～20、21～30、31～40和41枚以上的個(gè)體分別占7.1%、35.7%、21.4%、28.6%和7.1%。選用272枚卵母細(xì)胞供IVM,占獲卵母細(xì)胞總數(shù)的82.7%,其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)卵母細(xì)胞138枚,占獲卵母細(xì)胞總數(shù)的42.0%,占供IVM卵母細(xì)胞總數(shù)的50.7%。經(jīng)IVP的囊胚率(囊胚數(shù)/IVM卵母細(xì)胞數(shù)×100%)為26.8%(73/272),可移植胚率(可移植囊胚數(shù)/IVM卵母細(xì)胞數(shù)×100%)為20.6%(56/272);頭均囊胚數(shù)和移植胚數(shù)分別為(5.21±7.41)和(4.00±5.95)枚。但OPU獲得的卵母細(xì)胞數(shù)及IVP的囊胚數(shù)供體間差異較大(圖2)。2.1.2地位上的卵母細(xì)胞數(shù)和多克隆抗體的結(jié)合體的陰血工酶模型如表1所示,CL組供體,OPU頭均獲卵母細(xì)胞數(shù)比對照組多7.28枚(P<0.05)。由表2可見,CL組供體頭均獲可供IVM的卵母細(xì)胞數(shù)比對照組顯著多8.28枚(P<0.05);IVP的囊胚數(shù)和可用胚數(shù)分別比對照組顯著多7.29和6.00枚(P<0.05);CL組的囊胚率和可用胚率比對照組高27.3%和23.2%(P<0.01)。受精卵經(jīng)IVC8d后,正常囊胚可發(fā)育到孵化階段。采集到的COCs見圖3,IVP孵化囊胚見圖4。2.2bmiq-h-ov的表達(dá)受體經(jīng)同期發(fā)情處理后能正常排卵(形成CL)的占74.1%(60/81),CL合格率(可移植率)為69.1%(56/81),胚胎移植妊娠率和產(chǎn)犢率分別為37.5%(21/56)和35.7%(20/56)。如表3所示,在選擇的81頭BMY牛受體中,同期發(fā)情處理時(shí)卵巢上有CL、CL-DF和DF-H-OV的母牛分別占42.0%、39.5%、18.5%;受體經(jīng)同期發(fā)情處理后,移植時(shí)能形成CL的個(gè)體分別占82.4%、73.3%和65.6%,CL和CL-DF組高于DF-H-OV組(P>0.05),但CL和CL-DF組、CL-DF和DF-H-OV組比較,差異也不顯著(P>0.05);受體CL合格率(可移植率)同樣以CL組和CL-DF組高于DF-H-OV組,移植妊娠率以CL-DF組最高,高于其他2組,但均無顯著差異(P>0.05)。2.3自然發(fā)酵條件下的自然主觀條件表1,原理如下如表4所示,BMY牛受體(n=81)經(jīng)同期發(fā)情處理的同期排卵率(能形成CL母牛占處理總數(shù)的百分比)為74.1%(60/81),高于母牛在自然發(fā)情條件下的61.7%(50/81)(P>0.05)。在自然發(fā)情排卵的50頭母牛中,左、右卵巢排卵各占一半;經(jīng)同期發(fā)情處理后,右側(cè)卵巢排卵率極顯著高于左側(cè)(P<0.01);左、右側(cè)的CL合格率差異不顯著(P>0.05),右側(cè)CL合格受體的胚胎移植妊娠率高于左側(cè)CL合格的受體,但差異不顯著(P>0.05)。2.4在胚胎移植中，gnrh藥物的使用對受體的妊娠率的影響如表5所示,受體牛在胚胎移植時(shí)注射GnRH,其妊娠率比對照組高16.2%(P>0.05),表明GnRH有利于提高妊娠率。3討論3.1篩選可移植胚采用OPU可對母牛以每周1～2次的頻率采卵,但OPU-IVP的效率不盡一致。A.Garcia和A.W.VanWagtendonk-de-leeuw等對母牛OPU一般可獲卵母細(xì)胞5～8枚·頭-1·次-1,IVP后僅有17%左右的發(fā)育成可移植胚;N.Akyol等對8頭3～7歲荷斯坦母牛每周OPU一次,共采卵122次,頭均獲卵母細(xì)胞1.9枚·次-1,經(jīng)TCM-199培養(yǎng)液IVM,BO液IVF和CR1aa培養(yǎng)液IVC培養(yǎng),僅獲囊胚7枚;K.Roschlau等對1～17歲荷斯坦母牛每周OPU一次,3年內(nèi)累計(jì)OPU3437頭(其中70%為妊娠母牛),卵母細(xì)胞經(jīng)IVP獲可移植囊胚數(shù)僅為1.9枚·頭-1·次-1;G.A.Presicce等對20頭6～8歲經(jīng)產(chǎn)荷斯坦牛母牛OPU,卵母細(xì)胞經(jīng)IVP的囊胚率為5%～66%,個(gè)體間差異很大;R.T.Beltrame等對20619頭Nelore瘤牛供體累計(jì)采卵71602次,經(jīng)IVP獲囊胚7.12枚·頭-1·次-1。3.1.1bmip的opu結(jié)果有研究表明,不同年齡和生理狀況,COCs的數(shù)量和質(zhì)量存在明顯差異。采用OPU可從性成熟前的母牛、青年母牛和經(jīng)產(chǎn)母牛獲得卵母細(xì)胞。對12～14月齡西門塔爾牛OPU,頭均獲Ⅰ、Ⅱ級(jí)卵母細(xì)胞為12.2枚,IVP第7天的桑椹胚/囊胚率和第9天的孵化囊胚率分別達(dá)44.7%和35.6%;蘇雷等對BMY青年牛、經(jīng)產(chǎn)牛和老齡牛,間隔4d采卵1次,共采卵10次,每次頭均獲卵母細(xì)胞數(shù)分別為7.30、6.10和4.20枚,Ⅰ級(jí)卵母細(xì)胞率分別為10.4%、12.3%和6.2%,青年牛和經(jīng)產(chǎn)牛高于老齡牛。但OPU獲得的卵母細(xì)胞經(jīng)IVP的平均囊胚數(shù)青年母牛(1.36枚)低于經(jīng)產(chǎn)母牛(1.97枚)。本研究對BMY經(jīng)產(chǎn)母牛OPU結(jié)果,頭均獲卵母細(xì)胞數(shù)和Ⅰ級(jí)卵母細(xì)胞率均高于蘇雷等的結(jié)果,IVP的平均囊胚數(shù)高于K.Roschlau等的結(jié)果。這主要與供體的選擇強(qiáng)度和OPU熟練程度等有關(guān),但供體間差異大。OPU-IVP最突出的應(yīng)用是通過激素處理強(qiáng)制利用青春期前(Pre-pubertal)尚不具繁殖能力的母牛生產(chǎn)胚胎,提高母牛的利用率,而且OPU來源的卵母細(xì)胞經(jīng)IVP發(fā)育到囊胚的能力比屠宰場來源卵巢上采集的卵母細(xì)胞強(qiáng),胚胎質(zhì)量更好,但對青春期前BMY母牛的OPU-IVP效率如何有待進(jìn)一步研究。3.1.2頭、頭、細(xì)胞數(shù)和前藥濃度供體牛在OPU前是否用FSH處理對獲卵母細(xì)胞數(shù)量及IVP后囊胚率的影響,有不同的報(bào)道。供體牛在OPU前用FSH處理能增加卵母細(xì)胞數(shù)及IVP的可用胚數(shù);對比利時(shí)蘭(Belgianblue)經(jīng)產(chǎn)牛用FSH處理后OPU,獲COCs數(shù)和IVP的囊胚率分別為11.8枚和29.0%,分別顯著高于對照組的4.1枚和17%;對荷斯坦經(jīng)產(chǎn)奶牛用FSH處理后OPU,頭均獲COCs數(shù)和卵裂率低于對照組的7.15枚和48.40%,但I(xiàn)VP的囊胚率(25.20%)極顯著高對照組(12.8%)。對BMY母牛在OPU前用FSH處理并不能增加OPU獲卵數(shù)量,但有利于提高卵母細(xì)胞IVP的囊胚率。本研究在沒有注射FSH的條件下對BMY經(jīng)產(chǎn)牛OPU,頭均獲卵母細(xì)胞數(shù)高于相關(guān)報(bào)道,接近J.H.F.Pontes等對瘤牛種Nelore牛OPU的結(jié)果(25.6枚);平均囊胚率高于G.A.Presicce等、R.DeRoover等、S.A.Machado等和S.A.Chaubal等的結(jié)果,與L.Su等和Z.Roth等的結(jié)果相近;可移植胚數(shù)達(dá)到在同等放牧管理?xiàng)l件下通過超數(shù)排卵-胚胎回收的水平。提示,在本研究基礎(chǔ)上通過選擇OPU時(shí)機(jī)和改善IVP條件,OPU-IVP的效率有望進(jìn)一步提高。3.1.3不同壓力對bmi牛采卵雙和雙采卵牛的生長和產(chǎn)品品質(zhì)的影響當(dāng)OPU真空泵的壓力超過50mmHg時(shí),就會(huì)減少獲卵母細(xì)胞數(shù),并增加裸卵數(shù)。本研究以80～85mmHg的壓力對BMY牛采卵收到了良好的效果,這可能與采卵針的規(guī)格及真空泵的型號(hào)等有關(guān)。因此,真空泵的壓力大小應(yīng)根據(jù)采卵設(shè)備的性能和采卵操作熟練程度進(jìn)行調(diào)整。3.1.4分離體的細(xì)胞培養(yǎng)IVM的時(shí)間、IVF程序、培養(yǎng)液、培養(yǎng)氣相等條件均會(huì)影響IVP的效果。牛卵母細(xì)胞IVM19h后經(jīng)IVF、IVC的囊胚率(25.9%)高于IVM24和26h時(shí);受精卵用TCM和SOF培養(yǎng)的平均囊胚數(shù)差異不顯著,但用SOF培養(yǎng)發(fā)育到囊胚的時(shí)間僅為6d,比TCM培養(yǎng)的早1d;對OPU來源卵母細(xì)胞用TCM-199和Menezo-B2培養(yǎng)液培養(yǎng)的囊胚率分別為21%和22%。本研究中,BMY牛卵母細(xì)胞IVM20～22h,經(jīng)IVF、IVC獲得較高的囊胚率,但批次間差異較大。3.1.5發(fā)情期和發(fā)病時(shí)間對前發(fā)期的影響母牛發(fā)情周期中從卵泡出現(xiàn)到發(fā)育至優(yōu)勢卵泡和排卵需要11d,一般出現(xiàn)2或3個(gè)卵泡波,每個(gè)卵泡波后總有8～41個(gè)新的卵泡補(bǔ)充,Nelore牛(Bosindicus)甚至有3～4個(gè)卵泡波,且瘤牛母牛每個(gè)卵泡波產(chǎn)生的卵泡數(shù)多于歐洲牛。出現(xiàn)3個(gè)卵泡波的母牛,第1個(gè)、第2個(gè)和第3個(gè)卵泡波分別發(fā)生在發(fā)情周期的第6天、第15～17天和發(fā)情前期,其中第3個(gè)卵泡波可發(fā)育成為排卵卵泡。因而,一般選擇在母牛發(fā)情后3～4、9～10和15～16d進(jìn)行OPU。本研究在發(fā)情第14～16天OPU,獲卵母細(xì)胞數(shù)量多、質(zhì)量好,且囊胚數(shù)和可用胚數(shù)均高,這主要是檢查時(shí)卵巢上有CL的供體在OPU時(shí)正值第2個(gè)卵泡波的結(jié)果。與R.T.Beltrame等報(bào)道基本一致。提示,加大對供體的選擇力度(性周期正常)和有效把握OPU時(shí)間可提高OPU-IVP效果。3.2bmi的催化作用S.E.Echternkamp等通過直腸檢查和腹腔鏡檢查結(jié)果表明,青年母牛右側(cè)卵巢的排卵率(60.68%)顯著高于左側(cè)的39.32%;R.A.Cushman等對3910頭青年母牛調(diào)查表明,在1個(gè)情期中右側(cè)卵巢平均排卵數(shù)(0.66個(gè)CL)極顯著高于左側(cè)卵巢(0.55個(gè)CL)。和占星等對52頭BMY牛供體用CUE-MATE+PG同期發(fā)情處理的排卵率為94.23%,其中右側(cè)卵巢占59.18%,顯著高于左側(cè)的40.82%。本研究表明,BMY母牛在同期發(fā)情處理前,左、右側(cè)卵巢的排卵基本一致,而經(jīng)同期發(fā)情處理后不僅右側(cè)卵巢的排卵高于左側(cè),而且右側(cè)卵巢排卵母牛的胚胎移植妊娠率也高于左側(cè)卵巢。和占星等對奶牛受體用CUE-MATE+PG同期發(fā)情處理結(jié)果表明,處理開始時(shí)卵巢上同時(shí)存在CL和FL的受體的同期發(fā)情率和CL合格率比只有CL或FL的高8～10個(gè)百分點(diǎn)。本研究中,BMY牛受體在同期發(fā)情處理時(shí),卵巢上同時(shí)存在CL和FL的胚胎移植妊娠率高于只有CL或FL及正在發(fā)情、剛排卵的受體。3.3體外胚胎移植opu-iiip的妊娠率N.Kawate等用Ovcych+CIDR對日本黑毛和牛受體同期發(fā)情處理,結(jié)果同期發(fā)情率、可移植率和妊娠率分別比單獨(dú)用PGF處理的高。本研究采用CUE-MATE+FSH+PG+EB對BMY牛受體同期發(fā)情處理后定時(shí)胚胎移植(TET),由于在處理第8天撤CUE-MATE的同時(shí)注射了PG和FSH,第9天注射EB,在PG作用下溶解黃體,使受體血中孕酮含量降低,同時(shí)在FSH和EB的共同作用下,促進(jìn)卵泡的發(fā)育、成熟和排卵,從而提高了受體的黃體合格率,而且不用發(fā)情觀察,是一種有效的同期發(fā)情方法,適合在規(guī)?；疶AI和TET中應(yīng)用。與體內(nèi)胚胎(超排-沖胚獲得)相比,體外胚胎(IVP)其耐凍性差、移植妊娠率低。OPU-IVP來源荷斯坦奶牛鮮胚和凍胚的移植妊娠率分別為49%和40%;泌乳期奶牛經(jīng)Ovcych法同期發(fā)情處理后移植OPU-IVP來源鮮胚的妊娠率為26.7%,顯著高于玻璃化冷凍胚的移植妊娠率7.4%;以雜交牛為受體移植OPU-IVP鮮胚后30和60d的妊娠率分別為37.40%和33.52%,分別顯著低于移植體內(nèi)胚胎的妊娠率45.60%和41.51%,表明體內(nèi)胚胎的移植妊娠率高于體外胚胎,鮮胚高于凍胚。此外,體外胚胎移植存在妊娠和分娩異常、增加流產(chǎn)、犢牛先天畸形、巨大后代綜合癥(Largeoffspringsyndrome,LOS)、增加圍產(chǎn)期的死亡率等問題。本研究OPU-IVP來源的BMY牛鮮胚移植的妊娠率高于Y.M.Al-Katanani和J.H.F.Pontes等的結(jié)果;低于K.Roschlau等的結(jié)果。本研究中所使用的供體、公牛(凍精)和受體均為BMY牛,IVP胚胎移植后未出現(xiàn)母牛的妊娠、分娩異常及犢?；蔚痊F(xiàn)象。3.4外源