抗真菌藥物的高通量藥物篩選

抗真菌藥物的高通量藥物篩選

20世紀(jì)20年代，這種系統(tǒng)性真菌感染經(jīng)常出現(xiàn)在那些患有輕度免疫疾病的患者。尸檢數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明,死于惡性腫瘤的患者,有一半以上感染了白色念珠菌?，F(xiàn)在用于治療系統(tǒng)性真菌感染的二性霉素B和咪唑類以及用于表皮真菌感染的特比萘酚等藥物,存在著活性范圍、毒性、不良反應(yīng)及耐藥性等問題。真菌感染的迅速增加及有效藥物的缺乏,使新型抗真菌藥物的研究和開發(fā)顯得尤為迫切?；诖?本研究采用兩株基因型不同的白色念珠菌菌珠(一株含Ⅰ型內(nèi)含子核酶,一株不含子核酶和一株非病原真菌啤酒酵母(不含Ⅰ型內(nèi)含子核酶,為細(xì)胞模型,應(yīng)用高通量篩選的技術(shù)平臺(tái)來篩選高效低毒的潛在抗核酶藥物、專一抗白色念珠菌藥物以及廣譜性抗真菌藥物。1材料和方法1.1真菌ca.lsu白色念珠菌4-1,它的26SrRNA上含有能進(jìn)行自我剪接的Ⅰ型內(nèi)含子核酶(Ca.LSU);白色念珠菌62-1,它的26SrRNA上不含該核酶,兩株白色念珠菌均由加拿大Montrealuniversity的LemayG教授惠贈(zèng);啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°,其線粒體上的I型內(nèi)含子已去除。1.2培養(yǎng)基白色念珠菌4-1和62-1用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng),啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°用YPAD培養(yǎng)基培養(yǎng),這3種菌株的培養(yǎng)溫度都是30℃。1.3dmso主要成分除非特別說明,所有用于高通量篩選的化合物與天然產(chǎn)物均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心提供。樣品用二甲基亞砜(DMSO)溶解成10mg·mL-1的原始濃度于4℃儲(chǔ)存,再用0.95%的氯化鈉稀釋成100μg·mL-1的終濃度后于-20℃保存。DMSO也相應(yīng)地被稀釋成1%的終濃度。共篩選10720種藥物樣品,大約有1600種屬于天然產(chǎn)物,其余的屬于化合物。正對(duì)照有兩種藥物:一種為大蒜油注射液(武漢大學(xué)中南醫(yī)院),屬于廣譜性抗真菌藥物;另一種是核酶抑制劑戊脘脒(pentamidine,美國Sigma公司),對(duì)白色念珠菌4-1的生長有一定的特異性。1.4工作站beckman公司Biomek2000實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化工作站(Beckman公司);Fluostargalaxy微板光學(xué)測定儀及配套96孔板(BMG公司產(chǎn)品)。1.5生長曲線的測定分別挑取3種菌株的單菌落,于30℃,200r·min-1的搖床上過夜培養(yǎng)13h,測3種菌株的A580nm。在96孔板的第1行12個(gè)孔,將3種菌液的起始A580nm,用新鮮液體培養(yǎng)液依次稀釋為0.02,0.05,0.1,0.2(不加入任何藥物樣品,每孔只有100μL稀釋后的菌液),30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2.5h,移至溫度設(shè)置為30℃的Fluostarggalaxy光學(xué)儀中記錄A580nm,并靜止培養(yǎng)4h,每隔1h記錄其A580nm,共5個(gè)記錄值,用Fluostar軟件作出生長曲線圖。通過生長曲線的形狀來確定篩選條件的最佳起始A580nm。1.6藥物樣品檢測首先進(jìn)行白色念珠菌4-1的篩選。挑取單菌落于30℃,200r·min-1的搖床上過夜培養(yǎng)13h后,在FluostarGalaxy上測A580nm。于無菌的生理鹽水瓶中,用新鮮的YPD培養(yǎng)液將起始菌液濃度的A580nm稀釋至0.1A600。篩選時(shí),在每塊96孔板中,2-11列共80個(gè)孔用來檢測藥物樣品,每孔含10μL藥物樣品和90μL菌液,藥物樣品終濃度是10μg·mL-1,DMSO終濃度為0.1%,此濃度的DMSO對(duì)真菌的生長幾乎沒有影響;第1列上面4孔作空白對(duì)照,即每孔10μL無菌蒸餾水和90μL菌液;第1列的下面4孔作負(fù)對(duì)照,每孔10μL無菌蒸餾水和90μL無菌培養(yǎng)液;第12列都作正對(duì)照,1∶200和1∶500的大蒜油注射液各2孔,50μmol·L-1和100μmol·L-1的pentamidine各2孔。加樣操作都是通過Biomeck2000型實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化工作站的自動(dòng)化操作系統(tǒng)完成。將96孔板送入30℃的FluostarGalaxy光學(xué)儀中第1次測A580nm。測完后于30℃培養(yǎng)箱中無菌靜止培養(yǎng)3h,測A580nm。再次培養(yǎng)3h,第3次測A580nm。所有藥物樣品測試完畢后,再以白色念珠菌62-1進(jìn)行篩選;最后以啤酒酵母a161I°II°進(jìn)行篩選,將培養(yǎng)液由YPD替換為YPAD培養(yǎng)液。操作程序同上。1.7s13s1b3-s1b3IC50為抑制真菌生長效率達(dá)50%時(shí)檢測樣品的濃度。抑菌效率采取以下公式進(jìn)行計(jì)算:抑菌濃度=1?S3?S1B3?B11-S3-S1B3-B1其中,S1代表每個(gè)檢測樣品在第1次所測的A580nm,S3代表該檢測樣品在第3次所測的A580nm,相應(yīng)地,B1代表同一塊96孔板的4個(gè)空白在第1次所測A580nm的平均數(shù),B3代表第3次所測A580nm的平均數(shù)。1.8抑菌效率檢測經(jīng)初篩計(jì)算抑菌效率后,對(duì)所有抑菌效率達(dá)50%以上的高活性藥物樣品進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩程序基本同上。在96孔板每排從第2列到第6列,以及從第7列到第11列,將每個(gè)活性藥物樣品的濃度稀釋成5個(gè)梯度,依次為10,1,1×10-1,1×10-2,1×10-3μg·mL-1,以檢測藥物樣品是否呈現(xiàn)一定的量效曲線。復(fù)篩程序重復(fù)3次。對(duì)3種真菌抑菌效率均達(dá)50%以上的藥物樣品,定義為廣譜性抗真菌藥物;只對(duì)兩株白色念珠菌抑菌效率達(dá)50%以上的藥物樣品,暫定為專一抗白色念珠菌藥物;僅對(duì)白色念珠菌4-1抑菌效率達(dá)50%以上的藥物樣品,定義為白色念珠菌4-1特異性抑制劑。2結(jié)果2.1生長曲線特征Fluostargalaxy光學(xué)儀根據(jù)所記錄的A580nm直接作的12個(gè)生長曲線圖,見圖1。由圖1可見每個(gè)生長曲線圖由5個(gè)點(diǎn)組成,每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一定培養(yǎng)時(shí)間的A580nm,其中第1個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間為2.5h,其他的4個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間依次為3.5,4.5,5.5,6.5h(第1個(gè)孔A1,由于軟件誤差只顯示了后面3個(gè)點(diǎn))。3種菌株在起始A580nm為0.02和0.05時(shí),在30℃培養(yǎng)6.5h的過程中,生長都比較緩慢;白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1的生長曲線向里凹,即斜率在逐步增加,說明到后期生長才開始加速,而啤酒酵母a161I°II°在這段時(shí)間的生長曲線近乎水平,生長最緩慢。而在起始A580nm為0.1時(shí),3種菌株的生長速度大大升高,生長曲線都近似直線,斜率最大,說明生長最為旺盛。當(dāng)起始A580nm升到0.2時(shí),3種菌株在最后2h,生長曲線向外凸出,斜率逐漸降低,表明生長速度漸趨緩慢。由此看來,在總體積為100μL,時(shí)間為6.5h的培養(yǎng)過程中,不同起始A580nm的菌液的生長狀態(tài)也各不相同。由圖可知,當(dāng)菌液的起始A580nm為0.1時(shí),真菌生長和分裂的速度達(dá)到最大,代謝最活躍。因此我們將篩選時(shí)菌液的起始A580nm定為0.1。2.2抑菌活性藥物的篩選在經(jīng)過1次初篩和3次復(fù)篩的統(tǒng)計(jì)分析之后,發(fā)現(xiàn)初篩結(jié)果與復(fù)篩結(jié)果都基本一致。第1次復(fù)篩后的分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。共發(fā)現(xiàn)了23種有活性的潛在抗真菌藥物,其中有抗白色念珠菌4-1特異性藥物1種,即藥物樣品S-3,它對(duì)含Ⅰ型內(nèi)含子核酶的白色念珠菌4-1的抑菌效率高達(dá)98.02%,而對(duì)不含Ⅰ型內(nèi)含子的白色念珠菌62-1和啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的抑菌效率分別只有-1.67%和1.18%。因?yàn)楹髢烧吲c前者的共同區(qū)別是不含Ⅰ型內(nèi)含子核酶,所以該活性藥物樣品的分子靶標(biāo)很可能是I型內(nèi)含子核酶。在所發(fā)現(xiàn)的4種抗白色念珠菌藥物,包括藥物樣品S-1,S-2,S-4和S-19等,其中樣品S-19抑制白色念珠菌生長的特異性最強(qiáng)。在所發(fā)現(xiàn)的18種廣譜性抗真菌藥物中,有個(gè)別藥物的抑制效果仍然有輕微的菌珠差異性,可能反應(yīng)菌珠基因組和個(gè)體代謝的不同。在表1中,如果藥物樣品的抑菌效率為負(fù)值,表示它促進(jìn)真菌細(xì)胞的生長。作為正對(duì)照的pentamidine在50μmol·L-1時(shí),對(duì)白色念珠菌4-1的抑制率為62%,對(duì)白色念珠菌62-1的抑制率為28%,對(duì)啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的生長無影響;而大蒜油注射液在1∶200的稀釋濃度時(shí)對(duì)3種菌株均有少量抑制。很顯然,本實(shí)驗(yàn)所篩出的活性藥物樣品S-3對(duì)含有Ⅰ型內(nèi)含子核酶的菌珠的抑制特異性比pentamidine要強(qiáng)很多。2.3活性成分s-19的濃度在所篩選出的23種活性樣品中,有13種樣品對(duì)3種菌株都呈穩(wěn)定的量效曲線。即隨著藥物樣品的濃度逐步降低,它們對(duì)3種菌株的抑菌率也相應(yīng)地下降。活性樣品S-19在不同濃度梯度時(shí)抑制3種真菌生長的量-效曲線見圖2。隨著活性樣品S-19的濃度從10,1,0.1,0.01,0.001μg·mL-1依次降低時(shí),它對(duì)白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1抑菌效率也隨著下降,呈穩(wěn)定的量-效曲線。但對(duì)啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°只在濃度為10μg·mL-1時(shí)呈現(xiàn)少許抑制作用,而當(dāng)它的濃度降得更低時(shí)則促進(jìn)啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的生長,表明此藥物的毒性可能不大。而且從圖2可以看出,它對(duì)兩株基因型不同的白色念珠菌的抑菌效率并無明顯差異,表明它抑制兩株白色念珠菌生長的分子靶標(biāo)應(yīng)該相同,極有潛力發(fā)展為抗白色念珠菌的藥物。但具體的分子作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。3s-3活性藥物的篩選在本研究的篩選體系中,由于篩選時(shí)3種菌液的起始A580nm高達(dá)0.1,而培養(yǎng)時(shí)間比較短,只有6h,所以即便空氣中含有極微量的雜菌,也很難在溫度為30℃靜止培養(yǎng)時(shí)間為6h的條件下長起來,這樣減少了因空氣中雜菌污染所造成實(shí)驗(yàn)困難的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明96孔板中4個(gè)負(fù)對(duì)照的A580nm在整個(gè)培養(yǎng)過程中無明顯升高,說明負(fù)對(duì)照在篩選過程中不存在明顯的污染問題。而且6h的培養(yǎng)時(shí)間可以足夠使有效的樣品發(fā)揮抑菌活性。這樣每天大約可以篩選3000種藥物樣品,加快了篩選的速度。并且,由于篩選時(shí)菌液的起始A580nm高達(dá)0.1,所篩選出的活性藥物樣品可能適合于深度和中度真菌感染的治療。本研究所用的抗真菌藥物篩選模型,唯有白色念珠菌4-1含有Ⅰ型內(nèi)含子核酶,其他兩個(gè)菌株不含。我們發(fā)現(xiàn)藥物樣品S-3強(qiáng)烈抑制含有Ⅰ型內(nèi)含子核酶的白色念珠菌4-1的生長而對(duì)不含此核酶的白色念珠菌62-1和啤酒酵母a161Ⅰ°Ⅱ°的生長基本沒有影響,暗示S-3所作用的分子靶標(biāo)非常專一,是白色念珠菌4-1特有的。盡管除了Ⅰ型內(nèi)含子核酶以外,白色念珠菌4-1與另外兩株菌株在基因型上可能存在其他差異,但這種可能性應(yīng)該是微乎其微的。因此,我們推測樣品S-3的分子靶標(biāo)可能是Ⅰ型內(nèi)含子核酶,當(dāng)然進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)還是很必要的。如果S-3被開發(fā)成臨床藥物,其不良反應(yīng)很小。作為核酶抑制劑的戊脘脒(pentamidine)對(duì)白色念珠菌4-1的生長抑制比白色念珠菌62-1要強(qiáng)一些,我們發(fā)現(xiàn)S-3對(duì)白色念珠菌4-1的特異性比戊脘脒要強(qiáng)很多,說明S-3在體內(nèi)的分子靶標(biāo)專一性比pentamidine要強(qiáng)。因?yàn)樗械蘑裥蛢?nèi)含子核酶都有相似的催化核心結(jié)構(gòu)并催化同樣的反應(yīng),白色念珠菌Ⅰ型內(nèi)含子核酶的抑制劑很有可能對(duì)其他Ⅰ型內(nèi)含子核酶,比如其他病源念珠菌和卡氏肺囊蟲的Ⅰ型內(nèi)含子核酶均有效。因此,S-3是一種很值得進(jìn)一步研究和開發(fā)的專一性抗真菌藥物。本研究發(fā)現(xiàn)有4種藥物樣品抑制白色念珠菌生長呈現(xiàn)較強(qiáng)特異性,而對(duì)啤酒酵母生長只呈輕微抑制作用。由于白色念珠菌是機(jī)遇型致病真菌,啤酒酵母是非致病真菌,所以這4種藥物的抑菌分子靶標(biāo)很可能與白色念珠菌的致病基因相關(guān),可能也會(huì)抑制那些與白色念珠菌類似的其他致病真菌的生長。因?yàn)榘袠?biāo)的專一性強(qiáng),這些活性樣品的毒性應(yīng)該不大。對(duì)這些白色念珠菌特異性的抑制藥物的抑菌機(jī)制、適用范圍、和藥效等均需要進(jìn)一步研究。因?yàn)榘咨钪榫c啤酒酵母在分子水平