飼料級啤酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化

飼料級啤酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化

食物級祖母不僅可以補(bǔ)充蛋白素，還可以通過激活的母細(xì)胞菌或其他活性因素來改善動物胃腸的微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)微生物蛋白的合成，提高腸道養(yǎng)分的消化和吸收。此外酵母培養(yǎng)物還可在腸道中競爭性抑制病原微生物生長,改善腸壁結(jié)構(gòu)與形態(tài),抑制霉菌毒素的危害。因此,酵母培養(yǎng)物在畜禽飼養(yǎng)與飼料工業(yè)上具有重要意義。然而經(jīng)濟(jì)適用的酵母培養(yǎng)條件的選擇與優(yōu)化是生產(chǎn)優(yōu)良的酵母產(chǎn)品的關(guān)鍵。本研究旨在通過對酵母培養(yǎng)條件的篩選建立優(yōu)良的酵母菌培養(yǎng)工藝。1材料和方法1.1培養(yǎng)基的制備啤酒酵母、黃豆、葡萄糖、精面粉、麩皮、玉米粉、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、結(jié)晶硫酸鎂、麥芽糖、土豆、瓊脂。ATUOCLAVEMLS-2420、THZ-82型恒溫振蕩器、PHS-3C精密pH計(jì)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(420型)、SMX-1水平單人超凈工作臺豆?jié){機(jī)、大型蒸箱、錐形瓶、移液器、血球計(jì)數(shù)板、酒精燈、計(jì)數(shù)器。啤酒酵母(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)系試驗(yàn)室保存)。將土豆去皮,切成1cm3左右的小塊,加入兩倍量的水煮沸30min后過濾去除土豆并補(bǔ)足蒸發(fā)水制備土豆液。然后在土豆液中加入其它成分制備各種增菌培養(yǎng)基?，F(xiàn)將各種增菌培養(yǎng)基的成分列表如下。固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基由麩皮、玉米芯、玉米粉(4∶4∶2)、2‰的葡萄糖、1.8‰的麥芽糖、0.5‰硫酸銨、0.5‰氯化鉀、0.5‰硫酸鎂、0.5‰氯化鈉構(gòu)成。將黃豆浸泡24h,加入50倍的水,磨制成豆汁后,用豆汁調(diào)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備固體生產(chǎn)培養(yǎng)基。1.2方法1.2.1生產(chǎn)工藝生產(chǎn)菌種制備→液體增菌培養(yǎng)→固體發(fā)酵。1.2.2母菌的數(shù)量平板計(jì)數(shù)法。1.2.3生產(chǎn)消毒菌制備土豆培養(yǎng)基,滅菌后傾倒斜面若干,將原菌種于斜面?zhèn)鞔鷱?fù)蘇后置4℃保存。1.2.4液體擴(kuò)散鉤取一環(huán)斜面菌種,接種于10mLl液體土豆培養(yǎng)基,31℃培養(yǎng)48h后,按一定的接種量進(jìn)行液體的擴(kuò)大培養(yǎng)。1.2.5固體發(fā)酵將酵母種子液按一定量的接種于固體生產(chǎn)培養(yǎng)基,一定溫度下發(fā)酵一段時間后進(jìn)行酵母計(jì)數(shù)。2結(jié)果與分析2.1檢測細(xì)菌的質(zhì)量菌種形態(tài)呈圓形,革蘭氏染色陽性,菌體直徑10～12μm,大小均勻。2.2培養(yǎng)時間對酵母菌活發(fā)酵的影響接種酵母菌在液體土豆培養(yǎng)基中培養(yǎng)168h,每隔48h計(jì)數(shù)1次酵母菌數(shù)。由表3可見,從48h至72h,兩個平行樣的菌數(shù)增加幅度較大,72h之后菌數(shù)基本不再增加,120h后活菌數(shù)反而減少,培養(yǎng)時間越長酵母菌的活性越低且越有可能造成污染。因此酵母最佳培養(yǎng)時間為72h,但如若作為二代菌種,培養(yǎng)時間為48h為宜,此時酵母的純度最高,活力最強(qiáng)。2.3金屬離子對酵母菌增殖的影響按表1制備4種培養(yǎng)基,并分別進(jìn)行48h擴(kuò)增培養(yǎng),然后進(jìn)行酵母菌的計(jì)數(shù)。由表4可見葡萄糖,麥芽糖,硫酸銨都對酵母菌的增值有顯著的影響,所以在土豆培養(yǎng)基中加入上述物質(zhì)有利于酵母菌的增殖。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步討論硫酸鎂,氯化鎂,氯化鉀,對酵母菌增值的影響,同時用5%的淀粉液代替土豆液,觀察對比此時的酵母增殖狀況。按表2制備10種培養(yǎng)基,并分別進(jìn)行48h培養(yǎng),然后進(jìn)行酵母菌的計(jì)數(shù)。由表5可以看出:①鉀、鎂、鈉等無機(jī)鹽離子對酵母菌的增殖也有重要得促進(jìn)作用。而且鉀離子的影響大于鎂離子大于鈉離子。②淀粉液完全可以代替土豆液來進(jìn)行酵母菌的擴(kuò)增。用5%的淀淀粉液代替土豆液(培養(yǎng)基的其他成分、培養(yǎng)條件完全相同的情況下),進(jìn)行酵母菌的擴(kuò)增時,擴(kuò)增后菌數(shù)為土豆液的1/3～1/4。2.4固體培養(yǎng)條件的優(yōu)化2.4.1豆汁的加入量由圖2可見,在培養(yǎng)溫度為31℃,接種量為0.1%的條件下,酵母菌數(shù)隨豆汁的拌入量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)豆汁拌入量為投料量的60%時培養(yǎng)效果最好,菌數(shù)可達(dá)80億個/g。當(dāng)拌豆汁量低時,通氣性高,但不利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。拌豆汁量高則正好相反,最終細(xì)胞數(shù)低且細(xì)胞死亡率也很高,分析原因可能與氧嚴(yán)重不足有關(guān)。2.4.2培養(yǎng)活細(xì)胞數(shù)由圖3可見,在含豆汁量為投料量的60%,培養(yǎng)溫度為31℃的條件下,接種量為0.2%時酵母的活細(xì)胞數(shù)最高,活菌數(shù)可達(dá)83億個/g。培養(yǎng)所得活細(xì)胞數(shù)與接種量在一定范圍內(nèi)成正比,因?yàn)榕囵B(yǎng)基所提供的營養(yǎng)水平只能滿足一定數(shù)量酵母細(xì)胞生長繁殖所需。當(dāng)接種量超過這一數(shù)值后,必然造成一部分細(xì)胞的營養(yǎng)供給不足,從而限制這一部分菌體的生長繁殖。因此,過高的接種量對增加酵母數(shù)沒有積極的影響。2.4.3發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響由圖4可見,在拌豆汁量為投料量的60%,接種量為0.2%的條件下,培養(yǎng)溫度為31℃時培養(yǎng)效果最佳。活菌數(shù)可達(dá)79億個/g。培養(yǎng)溫度偏低,使得菌體細(xì)胞內(nèi)酶的催化活性較低,延緩了菌體組成物質(zhì)的合成速度;在實(shí)驗(yàn)過程可發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)溫度偏高,培養(yǎng)初期細(xì)胞生長繁殖很快,但由于供氧速度的限制和不利于生長的代謝產(chǎn)物的積累,影響了最終產(chǎn)品的細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量。3培養(yǎng)基組成的確定微生物在生長繁殖時需要不斷從外界環(huán)境吸收各種營養(yǎng)物質(zhì),并將這些營養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞以及為細(xì)胞的生命活動提供能量。細(xì)菌體的化學(xué)成分有水,糖類,葡萄糖,蛋白質(zhì),脂類和無機(jī)鹽類等。合成這些成分的原料以及合成過程中所需要的能量,都是由培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)組成。所以培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分成為了制約細(xì)菌增殖的關(guān)鍵因素。一般培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分包括水,氮源,碳源,無機(jī)鹽類,微量元素和生長因子。本文通過以上酵母菌培養(yǎng)時間的篩選,液體培養(yǎng)基的篩選以及固體培養(yǎng)條件的優(yōu)化等一系列實(shí)驗(yàn)說明,進(jìn)行飼料級酵母菌的培養(yǎng)時,液/固體發(fā)酵結(jié)合進(jìn)行時效果最好。在進(jìn)行酵母菌的液體培養(yǎng)時,其培養(yǎng)基的組成以2‰的葡萄糖,1.8‰的麥芽糖,0.5‰硫酸銨,0.5‰氯化鉀,0.5‰硫酸鎂,0.5‰氯化鈉及土豆液構(gòu)成,培養(yǎng)時間48h時,酵母繁殖力最強(qiáng),培養(yǎng)效果最好。在進(jìn)行酵母菌的固體培養(yǎng)時加豆汁量為投料量的60%,酵母菌的接種量為2%,培養(yǎng)溫度以31℃,培養(yǎng)時間為72h時,酵母菌的擴(kuò)增效果可達(dá)83億個/g。本研究的液體培養(yǎng)基制備是以土豆液替代水進(jìn)行培養(yǎng)基的配制,而固體培養(yǎng)基的調(diào)和則是以豆汁代替水進(jìn)行的。無論土豆液,還是豆汁都能極大的促進(jìn)酵母的增殖,這可能與其中含有的某些未知的生長因子有關(guān)。而