原生質(zhì)體融合技術(shù)在優(yōu)良釀酒酵母研究中的應(yīng)用

原生質(zhì)體融合技術(shù)在優(yōu)良釀酒酵母研究中的應(yīng)用

母乳喂養(yǎng)是酒精工業(yè)的靈魂。良好的酵母不僅可以保證產(chǎn)品的質(zhì)量,還可以提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本。因此,選育優(yōu)良的酵母菌株,改善酵母菌的生產(chǎn)性能,對(duì)釀酒工業(yè)尤為重要。但是,由于工業(yè)用酵母菌株優(yōu)良特性的遺傳控制背景十分復(fù)雜,同時(shí)由于長(zhǎng)期人為培養(yǎng)使用等原因,很多菌株已喪失了產(chǎn)生孢子能力或成為孢子不育株,這使得傳統(tǒng)雜交育種和現(xiàn)代的基因工程育種手段都受到一定程度的限制。而原生質(zhì)體融合技術(shù)可克服細(xì)胞壁的天然屏障,排除接合型的限制,實(shí)現(xiàn)多基因重組,還可直接采用生產(chǎn)性狀好的菌株作為親株,加速工業(yè)酵母菌種改良進(jìn)程,為優(yōu)良工業(yè)酵母的選育提供了一個(gè)嶄新的途徑。1助融作用的融合原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)也稱細(xì)胞融合(cellfusion),是將雙親株細(xì)胞通過酶解破壁(動(dòng)物細(xì)胞除外),使之成為球狀的原生質(zhì)體,然后等量混合于高滲緩沖液中,在物理的(如電融合)或化學(xué)的(如聚乙二醇)或生物的(如仙臺(tái)病毒)助融作用下,使雙親的原生質(zhì)體發(fā)生相互凝集,通過細(xì)胞質(zhì)融合(plasmogamy)、核融合(karyogamy),進(jìn)行基因組建的交換、重組,然后在適宜的條件下再生出細(xì)胞壁,獲得融合子(fusant)的過程。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行酵母菌育種一般包括以下幾個(gè)步驟:融合親株的篩選、融合子篩選方法的確定、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、融合子的篩選與鑒定、融合株生產(chǎn)性能的測(cè)試等。2原生質(zhì)體融合的探索1912年Lamnbent在觀察多核細(xì)胞形成的過程時(shí)發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞融合現(xiàn)象。此后,Muller和Barski也相繼觀察到了細(xì)胞融合現(xiàn)象。1958年Okada發(fā)現(xiàn)并證明了紫外滅活仙臺(tái)病毒可誘發(fā)體內(nèi)艾氏腹水癌細(xì)胞彼此融合,開拓了細(xì)胞融合研究的先河。1953年,Weibull等首次用溶菌酶制備得到了巨大芽孢桿菌的原生質(zhì)體,并提出了原生體的概念。之后Eddy,Emmerson,Cocking又以酶法相繼制備出了酵母菌、絲狀真菌和番茄幼根細(xì)胞的原生質(zhì)體,為微生物和植物的細(xì)胞融合開辟了道路。1974年,加拿大籍華人高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)在Ca2+參與下能促進(jìn)植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合,這一發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展。以后又發(fā)展了電場(chǎng)誘導(dǎo)融合法、激光誘導(dǎo)融合法。1978年,第三屆工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上,把原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段提出來,引起了全世界的關(guān)注。此后,越來越多的研究者認(rèn)識(shí)到它的重要應(yīng)用價(jià)值,不斷提出并完善了一系列技術(shù)方法,并將其運(yùn)用到微生物的遺傳、生理、代謝、形態(tài)方面的研究和工業(yè)菌株選育工作中,極大地推動(dòng)了微生物研究的進(jìn)程。3釀酒酵母的應(yīng)用自1977年Sipiczki等首次實(shí)現(xiàn)了酵母原生質(zhì)體融合以來,國(guó)內(nèi)外研究者開展了廣泛的研究,已成功地實(shí)現(xiàn)了酵母的種、屬間的融合,構(gòu)建了一些有重要應(yīng)用價(jià)值的釀酒酵母。有的研究者還進(jìn)行了酵母與霉菌、酵母與細(xì)菌的融合,極大地豐富了酵母的遺傳多樣性,促進(jìn)了酵母菌的形態(tài)、生理和遺傳研究,加速了優(yōu)良工業(yè)酵母菌株的選育。3.1糖化酵母融合子的檢測(cè)釀酒酵母缺乏編碼淀粉水解酶的基因,不能直接利用淀粉生產(chǎn)酒精。而糖化酵母、黑曲霉、內(nèi)孢霉等則可分泌淀粉酶,水解淀粉。糖化性狀的表達(dá)受多基因控制,且受到雜合型a/α的限制。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù),將其它菌株中的糖化基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中,則將大大縮短工藝流程,降低生產(chǎn)成本。國(guó)內(nèi)研究者將釀酒酵母和糖化酵母等具有淀粉酶活性的菌株進(jìn)行種、屬間融合,構(gòu)建出一些具有淀粉糖化酶活性的酵母菌株[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。左小明等研究發(fā)現(xiàn),STA1、STA2、STA3的劑量效應(yīng)并不總是隨著核倍性遞增,而只有當(dāng)各自純合時(shí)才表現(xiàn)出表達(dá)的劑量效應(yīng);Masaokishida等在研究S.fibuligera和糖化酵母融合時(shí)發(fā)現(xiàn),融合子染色體電泳遷移方式只有細(xì)微的差別,α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶編碼基因的DNA雜交結(jié)果表明,這兩種基因在融合重組時(shí)或是被復(fù)制或是被消除,導(dǎo)致融合子形成了嵌和型染色體。李桃生等認(rèn)為釀酒酵母和糖化酵母親緣關(guān)系較近,容易形成穩(wěn)定的融合子。研究發(fā)現(xiàn),釀酒酵母與Aureobasidiumpullulans、Endomycesfibuligena、S.fibuligera、Endomycopsisfibnligera、Candidatropicalis等進(jìn)行的屬間融合不易獲得穩(wěn)定的融合子。黎碧蓮等為提高屬間融合子的穩(wěn)定性,避免糖化酶分泌性狀發(fā)生分離,采用間接選擇法,以糊精發(fā)酵為選擇壓力,促使融合子向發(fā)酵淀粉原料方向穩(wěn)定。在啤酒酵母應(yīng)用方面,陳海昌等將啤酒酵母(S.carlsbergenisis)和糖化酵母進(jìn)行融合,獲得了具有糖化能力的啤酒酵母。3.2酵母菌種的培養(yǎng)酒精發(fā)酵過程中,由于環(huán)境高溫和發(fā)酵過程放熱等原因,造成發(fā)酵醪溫度過高,普通酵母難以進(jìn)行正常的生長(zhǎng)和發(fā)酵,衰老過程加快,出酒率低,必須外加制冷設(shè)備維持正常的生產(chǎn)。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù),將某些耐高溫菌株與工業(yè)菌株融合,構(gòu)建耐高溫產(chǎn)酒率高的酵母菌株,具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。日本的品川早苗最早將高產(chǎn)酒精酵母和耐高溫酵母進(jìn)行種內(nèi)融合,得到了可以在40℃產(chǎn)酒精的酵母;隨后,國(guó)內(nèi)外研究者開展了一系列研究,實(shí)現(xiàn)了種屬間融合,構(gòu)建了一些耐高溫菌株[13,14,15,16,17,18,19]。文鐵橋等將釀酒酵母與呼吸缺陷型耐高溫克魯維酵母融合,在TTC培養(yǎng)基上篩選,得到的融合子在45℃產(chǎn)酒率可達(dá)7.4%。孫君社等采用呼吸缺陷型遺傳標(biāo)記結(jié)合高溫(45℃)條件培養(yǎng)對(duì)融合產(chǎn)物進(jìn)行篩選,得到了穩(wěn)定的融合子。楊汝德等利用加熱(80℃,30min)和紫外線照射(功率30w,距離30cm,2min)滅活雙親后進(jìn)行融合,獲得了成功,徹底避免了遺傳標(biāo)記對(duì)親株生產(chǎn)性狀造成的不利影響,為原生質(zhì)體融合技術(shù)在工業(yè)酵母菌株育種上的廣泛應(yīng)用開辟了新的途徑。3.3高效利用嗜殺酵母酒類釀造過程中,常常易出現(xiàn)酵母雜菌污染的情況,輕者影響了產(chǎn)品的質(zhì)量,重者造成巨大的浪費(fèi),嚴(yán)重影響企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。嗜殺酵母細(xì)胞內(nèi)具有嗜殺質(zhì)粒,控制菌體分泌毒素,可殺死敏感菌株。將嗜殺酵母中的嗜殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到具優(yōu)良發(fā)酵特性的菌株中,對(duì)防治酵母污染,凈化發(fā)酵體系,具有重要意義。BortolA等將經(jīng)紫外線滅活的嗜殺酵母與糖化酵母融合,再利用嗜殺酵母對(duì)融合產(chǎn)物進(jìn)行篩選,得到了糖化型嗜殺酵母。以后,杜連祥等,SuloP等,王昌祿等也進(jìn)行了探索,獲得了具有嗜殺活性的啤酒酵母。杜金華等選擇具有核缺陷的嗜殺菌株(kar1-1,his4)作為供體成功地將嗜殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到了蘋果酵母中,避免了嗜殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)引起不必要的核基因改變,為細(xì)胞質(zhì)基因的有效轉(zhuǎn)移提供了可靠途徑。3.4酵母原生質(zhì)體融合子選育酵母細(xì)胞的絮凝性是衡量?jī)?yōu)良酵母生產(chǎn)菌株的一個(gè)重要指標(biāo)。良好的絮凝性不僅能加快發(fā)酵液的澄清速度,降低酵母分離能耗,而且還可以防止因酵母自溶所導(dǎo)致的風(fēng)味敗壞。將絮凝性酵母與非絮凝性酵母進(jìn)行融合重組,提高優(yōu)良酵母的絮凝性,對(duì)啤酒生產(chǎn)具有重大意義。deFigueroa等,江慧修等,陳海昌等,JavadekarVS等,周東坡等及Watari等將非絮凝性酵母與絮凝性強(qiáng)的酵母進(jìn)行原生質(zhì)體融合,獲得了絮凝性好、發(fā)酵力強(qiáng)的融合子。其中,江慧修等利用紅霉素抗性突變和小菌落呼吸缺陷突變作為篩選標(biāo)記,將發(fā)酵力強(qiáng)的酵母與絮凝性好的酵母進(jìn)行電誘導(dǎo)融合,所得融合子經(jīng)凝集性、發(fā)酵力、細(xì)胞表面疏水性能、細(xì)胞DNA含量、穩(wěn)定性測(cè)定和小型發(fā)酵試驗(yàn)證明,具有雙親的優(yōu)良性狀。同時(shí)也證明,誘導(dǎo)線粒體基因突變標(biāo)記對(duì)工業(yè)菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合育種是一種有效途徑。JavadekarVS等利用benomyl(一種真菌毒素)抗性作為篩選標(biāo)記,將嗜殺酵母和高絮凝性酵母融合,得到了絮凝性好的嗜殺酵母,但在甘蔗糖蜜中發(fā)酵試驗(yàn),絮凝性狀消失,其原因尚不清楚。3.5酵母菌種的選擇在降解蘋果酸強(qiáng)的葡萄酒酵母和增香酵母選育上也有研究者進(jìn)行了探索。高年發(fā)等將釀酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)進(jìn)行屬間融合,選育出降解蘋果酸能力強(qiáng)的葡萄酒酵母。王瑞明等,趙華等將異常漢遜酵母異常變種(Hansenulaanomala)產(chǎn)乙酸乙酯能力部分地轉(zhuǎn)到釀酒酵母中,得到了產(chǎn)香能力強(qiáng)的酵母菌株;日本學(xué)者M(jìn)unekazukishimoto將嗜冷酵母與中溫酵母融合,構(gòu)建出低溫果酒增香酵母,發(fā)酵試驗(yàn)證明,蘋果酸、乙醇、苯乙醇、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯的產(chǎn)率較中溫釀酒酵母有所提高。因?yàn)榭刂平湍赴l(fā)酵產(chǎn)香性狀的基因眾多,很難利用轉(zhuǎn)基因、定點(diǎn)突變等技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建,所以通過原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建增香酵母最有可能解決某些果酒上長(zhǎng)期存在的香氣不足的問題。4原生質(zhì)和生物化合技術(shù)的應(yīng)用前景和現(xiàn)有問題4.1原生質(zhì)體融合技術(shù)釀酒工業(yè)一般要求所使用的酵母具有耐高溫/低溫、耐酒精、高產(chǎn)酒精、糖化能力強(qiáng)、嗜殺、產(chǎn)香、絮凝性好等優(yōu)良的生產(chǎn)性狀。生產(chǎn)不同產(chǎn)品所需的酵母性狀有所不同,但每一種產(chǎn)品的生產(chǎn)都需要具有多種優(yōu)良性狀的菌種,而真正具有多種優(yōu)良性狀的菌株又寥寥無幾。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù),實(shí)現(xiàn)多種優(yōu)良性狀的整合,構(gòu)建出理想的酵母菌株,將對(duì)釀酒工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。而且,通過原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行優(yōu)良酵母菌選育的同時(shí),還可以通過對(duì)融合子的遺傳分析,研究產(chǎn)量性狀的表達(dá)機(jī)制,各種性狀之間的影響以及各種代謝途徑中關(guān)鍵控制酶的作用,從而更加深入的研究酵母的發(fā)酵性能,提高生產(chǎn)