轉移因子的研究與臨床應用

轉移因子的研究與臨床應用

轉移因素是細胞中具有免疫活性的淋巴酸鹽釋放的低分子脂肪酸和多媒體物質。這種物質可以通過特定體為特定體細胞的免疫功能而轉移到受體。1945年,Chase氏首次發(fā)現(xiàn)了豚鼠的遲發(fā)型超敏反應能被活的淋巴樣細胞轉移。1949年,Lawrence氏發(fā)現(xiàn)將結核菌素陽性反應人的活淋巴細胞,注射給對此反應陰性的人,能使受體迅速出現(xiàn)陽性結核菌素皮試反應。1954-1955年,Lawrence氏又發(fā)現(xiàn)活的外周血白細胞的提取物也能轉移人的結核菌素、遲發(fā)型超敏反應,并具有一些獨特性質,因而定名為轉移因子(TransferFactor,簡稱TF)。近年來,國內(nèi)外醫(yī)學界對TF進行了廣泛的研究和臨床應用。1972、1975、1976年相繼召開了三次國際性TF專業(yè)性會議。目前研究的主要內(nèi)容是集中在異種動物特異性TF的試制和在人醫(yī)臨床上應用;TF的純化;TF的活性測定及臨床適應癥的研究;動物模型的建立等。國內(nèi)對TF的研究開始于1971年,上海、北京、長春、廣州等地先后試制了人血白細胞TF,人脾淋巴細胞TF;人扁桃體淋巴細胞TF,并對制備TF的方法、理化特性、生物學特性、免疫特性、熱源性、毒性及安全性進行了廣泛深入的研究。在治療先天性免疫缺陷病、乙型肝炎、乙型腦炎等病毒病和肝癌、類風濕癥方面進行了試驗治療,取得了一定療效。目前,非特異性TF已大量用于臨床,實踐證明,該制劑對人體安全無毒,但仍有許多問題需解決:(1)非特異性TF的活性受供體的免疫功能影響,差異甚大,致使臨床效果不一致;(2)缺乏適宜的動物模型和理想的活性測定方法。近年來,開始探索異種動物特異性TF的試制和應用研究,上海第二醫(yī)學院用人肝癌細胞懸液免疫綿羊,取其脾、淋巴結制備TF,治療肝癌,取得60%-70%療效,結果提示了異種動物特異性TF應用于人醫(yī)臨床的可能性。1免疫預防試驗隨著細胞免疫學理論的發(fā)展和對實驗動物TF的深入研究,大量的實驗結果證明,TF不僅存在人類和靈長類,且存在于家兔、豚鼠、大白鼠、小白鼠、牛、綿羊、豬、狗和馬屬動物等多種動物,在部分動物種間能相互轉移。1978年Klesius氏用牛卵形球蟲免疫牛,并使其對結核菌素敏感,然后取其牛的淋巴制備TF。用這種TF給10只小白鼠腹腔注射(120μg/g),結果可保護該鼠對卵形球蟲的臨床感染,而注射非免疫牛TF后的小鼠,則經(jīng)不住卵形球蟲的攻擊;未注射TF的對照組小鼠,經(jīng)卵形球蟲攻擊后均發(fā)病(表現(xiàn)為被毛粗亂、便血、精神不振、食欲減少、體重下降)。更有趣的是把注射過卵形球蟲牛TF的小鼠作為供體,取其淋巴細胞3×106個注射給其它正常小白鼠,該小白鼠也可部分地保護其免于卵形球蟲的臨床感染。實驗證明,?？孤研吻蛳x特異性TF,不僅可以把其細胞免疫反應轉移給小白鼠,而且還可以在小白鼠間連續(xù)轉移。證明特異性牛TF是預防牛球蟲病的有效藥物。1981年藏廣田用豬非特異性TF,治療雞傳染性喉氣管炎98例,治愈81例,治愈率達82.7%。治療人工感染雞新城疫30例,治愈11只,治愈率達36.6%。1981年周富榮應用豬脾TF,治療豬瘟16例,治愈4例,顯效3例;治療雞新城疫119例,治愈92例,治愈率77.3%;治療雛雞球蟲病99例,治愈76例,治愈率76.8%。并用TF對新城疫流行病區(qū)的部分未發(fā)病雞進行了免疫預防試驗,對25只雞免疫注射1次,每次2ml,保護率達80%;20只雞免疫注射2次,保護率為90%;13只雞免疫注射3次,保護率達100%。1981年盧景良用驢白細胞弱毒苗免疫的馬血白細胞和脾臟制備的TF,給11匹健康驢注射,40天后用強毒攻擊,結果有6/11的驢無異常反應,3/11的驢發(fā)病耐過,死亡2匹;而注射免疫血清和非免疫馬脾TF的各6匹驢,全部發(fā)病,各死亡4頭。1999年郭定宗等用豬傳染性胃腸炎弱毒疫苗分兩次接種豬,取其脾臟制備特異性豬傳染性胃腸炎轉移因子(TGE-TF),試驗結果表明,豬傳染性胃腸炎轉移因子能非特異性地增強小鼠吞噬細胞的吞噬功能。2001年李相安等用3日齡羅曼雛雞每只肌注或口服0.5mL的雞脾TF原液,結果表明:雞脾TF可顯著提高雛雞外周血液ANAE+T淋巴細胞百分率,且免疫器官脾和法氏囊的相對濕重增加明顯。2000年李文學等用犬瘟熱弱毒苗免疫犬,提取了特異性犬TF,經(jīng)實驗測定表明,該制品無菌、無熱原、無毒性、無抗原性,兔注射特異性犬脾TF后,經(jīng)酯酶染色法測定,外周血T淋巴細胞和B淋巴細胞的比值由注射前的40.41%上升到注射后的63.45%。1999年張君等將6只健康山羊分別連續(xù)注射普通脾轉移因子(CommonTransferfactor,CTF)及免疫脾轉移因子(ImmuneTransferfactor,ITF)3d后,發(fā)現(xiàn)TF能提高外周血白細胞總數(shù),促使外周血嗜酸性粒細胞增加,增加外周血T淋巴細胞和促使外周血淋巴細胞活化等,證明TF具有提高機體免疫功能的作用?；钕x攻擊的結果顯示,CTF和ITF均不能使機體獲得完全的保護,但可使弓形蟲急性感染向慢性感染轉化。隨著非特異性TF在人醫(yī)臨床上應用和對實驗動物TF的深入研究,近十幾年來我國已開始對畜禽TF的研究和應用。先后試制了豬、羊、馬、兔、牛等動物的非特異性TF和特異性TF。在畜禽疾病的防治上收到了意想不到的效果。2動物轉移因素的制備2.1非特異性tf的制備TF的生物活性,與供體的細胞免疫反應密切相關,制備非特異性TF應選擇成年的和細胞免疫功能強的畜禽作供體。制備特異性TF應選擇對該病原易感,經(jīng)免疫后對該抗原皮試陽性的個體作為供體。2.2準備方法2.2.1粗制tf的制備無菌采集供體動物的外周血,加肝素抗凝,用離心法吸取棕黃色的白細胞層,加入一定體積的0.87%NH4CL破壞紅細胞,離心沉淀白細胞,用生理鹽水洗滌2-3次,取樣作白細胞計數(shù)和活性檢查。將白細胞置于-40℃冰箱中過夜,然后在37℃水浴中速融,反復10次,使白細胞破裂,將裂解的白細胞置于透析袋中,加2倍量去離子水,在4℃條件下透析24-48h,透析外液經(jīng)凍干成淡黃色粉末,即為粗制TF。如以脾臟或淋巴結為原料,方法是:取新鮮或冰凍保存的脾,去其表面被膜,脂肪等結締組織,剪碎,置高速組織搗碎機中搗碎(10000-12000rpm,開機3min,停5min,反復3次),鏡檢組織勻漿中無完整的淋巴細胞,然后置-40℃冰凍72h,融凍后透析,以下步驟同上。2.2.2細胞濾和轉細胞取致敏動物的淋巴結或脾臟,去除被膜,脂肪等結締組織,剪碎,制成淋巴細胞懸液,用不銹鋼篩將細胞濾到Hanks液中,調pH為7.3;細胞濃度為1×109個/15mL,置37℃恒溫水浴中,孵育4h,并不斷攪拌,后離心1500-2000rpm,取其上清液,用10倍量的去離子水,在4℃條件下,透析16-18h,取其透析外液,即為粗制TF。2.2.3膜法制備法取新鮮淋巴組織(包括脾、淋巴結及外周血白細胞),切成小塊,加1倍體積冷卻的80%乙醇及3倍體積的40%乙醇,高速搗碎3min,調pH5.0-5.1,隨后在冰浴中放置30-60min,后在0-4℃條件下離心(2500rpm)20min,取其上清液,加等體積去離子水,冷凍干燥,按每克淋巴組織抽取物加2mL去離子水溶解,進行超濾,然后除菌分裝。國外的試驗證明,在淋巴細胞培養(yǎng)液中加入相應抗原或加入微量TF,都可刺激淋巴細胞產(chǎn)生大量TF。3通過形態(tài)和生物活性測試3.1供體動物tfTF具有可透析性;不含蛋白;粗制TF中含多肽、核酸,其活性不為胰蛋白酶和DNA酶、RNA酶所破壞;在-20℃條件下可長期保存;56℃30min可被滅活;分子量小于5000;經(jīng)sephadex凝膠過柱,洗脫峰為2-3個;紫外光譜測定TF在260/280nm處的比值為2左右。經(jīng)不同制備方法的不同動物TF,有一定差異(表1)。表1說明,由于供體動物不同,制備方法不同,制品中所含成份數(shù)量有差異,但主要成份和紫外吸收光譜基本一致?；境煞菔嵌嚯暮投嗪塑账?。3.2生物學特征3.2.1細胞致敏與恢復需要的劑量小(0.01IU就能使受體產(chǎn)生局部或全身反應),作用時間快(3-4h就可激活宿主的淋巴細胞,使受體致敏),持續(xù)時間可長達一年之久,在體外TF可使未致敏的淋巴細胞致敏,胸腺嘧啶摻入增加,使喪失與綿羊紅細胞形成玫瑰花環(huán)能力的淋巴細胞部分地恢復。過去認為TF不能在種間交叉轉移,現(xiàn)已證明,動物種間、成人與動物之間均可相互轉移,僅僅是轉移程度有差異。3.3.2增強免疫保護方式目前尚未完全搞清,就現(xiàn)有資料所知,其作用有四點:(1)特異地將供體某一細胞免疫功能轉移給受體;(2)非特異地增強受體的細胞免疫功能;(3)改善單核細胞與含有1g復合體的結合能力;(4)具有干擾素釋放機能。作用機制有許多假設:Lawrence認為TF是一種載信息分子,是細胞免疫的觸發(fā)劑,它既可將供體淋巴細胞內(nèi)的信息轉移給受體,也是受體細胞合成和釋放TF及可溶性介質的板機。3.2.3皮膚反應和體外反應體內(nèi)測定是應用皮膚試驗測定。受體接受TF后對特定抗原可誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應,以此判定細胞免疫功能的轉移。測定局部反應時,先在皮內(nèi)注射TF,24h后在同一部位注射皮試抗原,于24、48、72h觀察判定皮膚反應。測定全身反應,同樣于皮內(nèi)注射TF,24-120h后,于另一部位皮內(nèi)注射皮試抗原,然后于24、48、72h觀察并判定皮膚反應。體外測定法:有淋巴細胞轉化試驗,白細胞游走抑制試驗。據(jù)劉慶亮報導,應用活性T花環(huán)增高試驗的方法評價TF活性,以此判定TF的轉移功能。選用正常人外周血分離淋巴細胞,用一定濃度的胰酶處理,使淋巴細胞暫時失去形成活性E花環(huán)的能力,洗去胰酶后,加TF在37℃中培育4-9h,測定E花環(huán)形成率,與對照組相比,如果試驗組比對照組E花環(huán)形成率增高20%即表示TF具有活性,以增高的程度說明TF轉移活性的大小。4動物tf的研究現(xiàn)狀TF作為一種細胞免疫制劑,對人和動物的某些細胞內(nèi)感染的細菌性、病毒性和寄生蟲性疾病的防治作用是今人鼓舞的。目前國內(nèi)外對動物TF的研究仍處于試驗階段。如何制備高效特異性的動物TF,用于畜禽疾病的防治,尚需作大量的研究工作。4.1加強動物疾病的基礎理論研究闡明一些主要疾病的免疫性質,是以體液免疫為主,還是以細胞免疫為主,或是兩者皆有。4.2進行免疫的特異性tfTF的方法用于畜禽疾病防治的動物TF,據(jù)已有資料說明,只有特異性TF才有可能在畜禽疾病的防治中發(fā)揮重要作用。人醫(yī)制備大量特異性TF,在供體選擇和種屬轉移方面受到限制,而獸醫(yī)用特異性TF,供體來源方便,生產(chǎn)產(chǎn)量也大,無論是異種動物或同種動物進行免疫制備大量特異性高效TF都很方便。對馬傳貧、牛羊布病、結核、仔豬付傷寒等細胞內(nèi)感染的疾病,以其病原免疫同種動物,制備特異性TF,用于防治該病,通過激發(fā)其細胞免疫功能,有希望達到消滅潛伏病原的目的,解決抗菌素和體液免疫所不能解決的問題。對于危害嚴重的球蟲病,可以牛、羊大動物制備異種特異性TF,用于防治雞、兔的球蟲病。隨著免疫學的深入研究,逐步探