抗體藥物偶聯(lián)物的研究進展

抗體藥物偶聯(lián)物的研究進展

美國食品藥品監(jiān)督管理局（af）發(fā)布的評估結果的預期日期，對于醫(yī)療設施和分析人員來說是一個重要的日子，這一天關系到一家公司的命運。一些專業(yè)網(wǎng)站甚至投票預測結果。2013年2月22日似乎是一個例外,這一天羅氏的抗體藥物偶聯(lián)物Kadcyla(adotrastuzumabemtansine,T-DM1)毫無懸念地獲得美國FDA批準,用于治療HER2陽性同時對曲妥珠單抗和紫杉醇有抗藥性的晚期或轉移性乳腺癌患者。作為一種新型抗癌藥—抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)的代表,Kadcyla或許不應該那么引人注目,因為早在2000年第一個抗體藥物偶聯(lián)物Mylotarg(gemtuzumabozogamicin)就已經(jīng)被美國FDA批準上市,盡管后來由于療效有限和毒副作用較高,輝瑞公司主動在2010年把Mylotarg撤市,西雅圖遺傳公司的Adcetris(brentuximabvedotin,曾用名:SGN-35或cAC10-vcMMAE)在2011年8月又通過FDA快速通道評審,代表ADC藥物的真正成功。但是Mylotarg和Adcetris都是針對血液腫瘤,和固體腫瘤相比組織結構相對簡單,是ADC藥物研發(fā)的理想靶點。Kadcyla是美國FDA批準的治療固體腫瘤的第一個抗體藥物偶聯(lián)物,也是個體化治療的一大突破。根據(jù)2012年11月發(fā)表在新英格蘭醫(yī)學雜志上的EMILIA臨床實驗結果,Kadcyla治療組的客觀應答率為43.6%,顯著高于卡培他濱/拉帕替尼對照組的30.8%(P<0.001)。除此之外,Kadcyla組的所有二級實驗終點都優(yōu)于對照組。而且,3~4級不良事件的發(fā)生率也由卡培他濱/拉帕替尼組的57%降至Kadcyla組的41%。相信在不久的將來,Kadcyla將成為HER2陽性乳腺癌的一線標準療法。Kadcyla由美國ImmunoGen制藥公司研制,和羅氏屬下的基因泰克公司聯(lián)合開發(fā)。Kadcyla采用ImmunoGen的TAP專利技術把高活性的有絲分裂抑制劑DM1(一種美登素衍生物)用一個穩(wěn)定的硫醚鍵接頭連接到羅氏公司的曲拓珠單抗上。因為曲妥珠單抗對HER2有較高的親和力,Kadcyla能有效地靶向結合表達HER2的乳腺癌細胞,而后內化并釋放細胞毒DM1,剿滅癌細胞。Kadcyla把抗乳腺癌藥曲妥珠單抗和美登素衍生物DM1結合到一起,充分利用了前者靶向、選擇性強,后者活性高,而又消除了前者療效低和后者副作用大等缺點。尤其重要的是,目前的ADC技術還遠沒有完美,只有小于百分之一到達標靶細胞,而只有更少的效應分子起到抗腫瘤作用,為現(xiàn)代制藥企業(yè)留下巨大的改良空間。筆者相信,ADC在不久的將來會有更大突破,在抗腫瘤領域甚至有望取代單克隆抗體生物藥。因為最近在ADC領域已經(jīng)有很多優(yōu)秀綜述,從不同方面介紹這個領域的研究進展[4,5,6,7,8,9,10,11,12]。本文主要從化學角度出發(fā),在介紹ADC領域的最新進展之外,深度分析ADC領域技術上存在的問題,以及中國公司進入這個領域要面臨的挑戰(zhàn)和解決方案。1抗機構設計、活性分子的優(yōu)化及評價指標的確定抗體藥物偶聯(lián)物的概念可以追溯到100年前,PaulEhrilich勾畫的“魔術子彈”(MagicBullets)概念就類似于今天的免疫毒素偶聯(lián)物(immunotoxins)。ADC真正意義上的概念誕生于1958年,但技術上卻困難重重。第一個現(xiàn)代版的ADC直到1975年才被報道,直到上世紀八十年代,ADC的開發(fā)隨著非免疫性,尤其是人源化單克隆抗體的開發(fā)才出現(xiàn)重大突破。鑒于單抗優(yōu)越的選擇性和多功能性,今天抗體已經(jīng)滲透到醫(yī)藥研究的每一個方面,成為人類對付疾病的關鍵手段。第一代ADC藥物主要使用鼠源的單抗,因為人類的免疫反應造成一部分藥物難以到達標靶。其次,早期使用的包括阿霉素(doxorubicin)在內的效應分子的生物活性較低,限制了第一代抗體藥物偶聯(lián)物的療效。除此之外,抗體的來源、接頭連接的方式和數(shù)目也未得到優(yōu)化。以Mylotarg為代表的二代ADC注重腫瘤細胞相關抗原的表達情況、靶向抗體的人源化程度、效應分子的活性、新型接頭的穩(wěn)定性以及裂解效率等ADC作用機制的關鍵節(jié)點。隨著Kadcyla的成功,作者預計ADC全面發(fā)展的時代已經(jīng)來臨:無論是設計還是生產(chǎn)新型活性更高,分子量更小、滲透力更強的抗體或抗體片段的技術已經(jīng)成熟,大量高活性的效應分子已經(jīng)發(fā)現(xiàn),越來越理想的接頭也已經(jīng)產(chǎn)生。當然,設計理想的ADC藥物,在優(yōu)化每一個組件的基礎上,僅僅把各個優(yōu)化的片段組裝起來是不夠的,ADC要作為一個整體,全面、綜合地評價,進一步改良偶聯(lián)物的穩(wěn)定性、生物利用度、內化效率和效應分子的釋放度等關鍵技術指標,以便達到預期的治療目標。如圖1所示,ADC由“抗體”、“接頭”和“效應分子”三個主要組件構成。效應分子(payload)原指細胞毒素加上接頭部分,現(xiàn)經(jīng)常和細胞毒素混用。其中接頭通常還包括和抗體偶聯(lián)的隔離區(qū)(spacer)、化學或酶裂解區(qū)、釋放效應分子的消除區(qū)等。今天ADC在抗腫瘤領域已經(jīng)演變成為生物抗體藥的主要類別之一。和傳統(tǒng)的完全或部分人源化抗體或抗體片段相比,ADC因為能在腫瘤組織內釋放高活性的細胞毒素從而理論上療效更高。和融合蛋白相比,具有更高的耐受性或較低的副作用。經(jīng)過幾十年的改進,抗體藥物偶聯(lián)物的設計已經(jīng)逐步完善,成為目前腫瘤研究的重要方向和研究熱點之一。1.1其他化學成分化療藥物、毒素、放射性核素等對腫瘤細胞具有較大殺傷作用的細胞毒性物質理論上都可以作為抗體藥物偶聯(lián)物的效應分子?；熕幬镌瓌t上在足夠高的濃度下都可以殺死癌細胞,但由于缺乏特異性,在殺傷腫瘤細胞的同時,也易損傷機體正常細胞,導致嚴重的毒副作用。ADC通過化學方法把細胞毒素和單克隆抗體偶聯(lián),偶聯(lián)物在理想狀況下對正常細胞,尤其在循環(huán)系統(tǒng)內不顯示活性,只有在腫瘤組織內釋放效應分子。這樣ADC既有特異性識別腫瘤抗原的能力,也保留了效應分子殺傷腫瘤細胞的毒性,給藥后定向濃聚到腫瘤組織,選擇性地殺傷腫瘤細胞。圖2列出ADC領域常用細胞毒素的化學結構。用于和單抗偶聯(lián)的化療藥物的基本要求主要有三點:(1)作用機制清楚,如抗有絲分裂和DNA損傷劑等;(2)高活性,一般要求EC90小于1nmol·L-1;(3)可以采用化學方法偶聯(lián),并在腫瘤細胞內釋放高活性的細胞毒素本身或其高活性衍生物。目前最常見的ADC效應分子包括兩類微管蛋白抑制劑auristatins和美登素衍生物(maytansine)。Auristatins是全合成藥物,化學結構相對容易改造,以便優(yōu)化其物理性質和成藥特征。用于和抗體偶聯(lián)的auristatins衍生物主要包括auristatinE(MMAE,1)和auristatinF(MMAF,2),前者是由天然微管蛋白聚合酶抑制劑多拉司他汀(dolastatin)-10衍生的合成五肽,在C-端加上一個2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇而成。MMAE對多種人類腫瘤細胞株的抑制活性小于一個納摩爾。為了降低MMAE自身細胞毒活性,MMAF結構上在dolastatin-10的C-端加上一個苯丙氨酸,因為羧基的離子化,MMAF透析細胞膜的能力較差,因此對細胞的生物活性顯著降低。但是和抗體偶聯(lián)以后,MMAF對細胞的抑制活性能提高2000倍以上。合成的cAC10-Val-Cit-MMAF或者anti-CD70-ValCit-MMAF在動物實驗中顯示明顯的療效,尤其重要的是對部分耐藥癌細胞也顯示療效。ADC藥物的療效風險比從而得到顯著地提高。美登素(3)發(fā)現(xiàn)于20世紀70年代初期,是從非洲灌木(Maytenusovatus)樹皮中分離得到的。通過與長春花位點結合,抑制微管蛋白聚集,從而導致腫瘤細胞凋亡。美登素衍生物可以通過從發(fā)酵制備的ansamitocins半合成而成。更重要的是修飾C3位得到含有N-酰基-N-甲基-L-丙氨酰側鏈的美登素,這個側鏈可以進一步修飾而且并不顯著影響其活性。DM1(3b)和DM4(3c)都是美登素(maytansine)的衍生物、直接或間接地由雙硫鍵(DMDS)或穩(wěn)定硫醚鍵(SMCC)與抗體相連接。美登素衍生物DM1SMe和母體本身的細胞毒性相近,對很多細胞的IC50約為1×10-11mol·L-1,但DM4SMe的活性要高20~50倍左右,其IC50高達1×10-12mol·L。ADC常用的另外一類效應分子是作用于DNA的細胞毒素,包括calicheamicins(刺孢霉素,例如calicheamicinsγ,化合物4)、duocarmycins(例如duocarmycinA,化合物5和adozelesin,化合物6)以及pyrrolobenzodiazepines(PBDs,例如anthramycin,化合物7)等。刺孢霉素是天然的抗腫瘤抗生素,1987年最早自土壤微生物(Micromonosporaechinosporassp.Calichensis)中分離提取獲得,是一族既有廣譜抗菌活性又能強效殺傷多種腫瘤細胞的抗生素細胞毒素。刺孢霉素和DNA雙螺旋結構的小溝結合,通過Bergman環(huán)化反應產(chǎn)生苯環(huán)雙自由基,切割DNA雙螺旋骨架并殺傷腫瘤細胞。刺孢霉素有7個主要衍生物,其中calicheamicinγ(4,CLMγ)活性最高,在臨床上運用最多。刺孢霉素含有寡糖、刺孢酮和甲基三硫三個部分,其中甲基三硫充當引發(fā)裝置,還原后啟動Bergman重排反應并導致DNA裂解。包括duocarmycinA(5)、adozelesin(6)、CC-1065在內的duocarmycins家族來自抗腫瘤抗生素鏈霉菌。Duocarmycins能特異性地識別DNA小溝,并有效地烷基化DNA堿基N3位的腺嘌呤,具有很高的抗癌活性。遺憾的是這類衍生物同樣具有較高的毒性。和其他DNA作用劑不同,duocarmycin是前藥,在和DNA小溝結合以后,分子活化并打開高張力的環(huán)丙烷和腺嘌呤結合。采用這類化合物作為效應分子并使用聚乙二醇為接頭的發(fā)明已經(jīng)被報道。和duocarmycin一樣,pyrrolobenzodiazopine(PBD)是另一類天然存在的抗腫瘤抗生素,同樣和包括嘌呤-鳥嘌呤-嘌呤序列的DNA小溝結合,和腺嘌呤的N2位置形成共價鍵。連接兩個PBD產(chǎn)生的細胞毒素的活性可以高達1×1010~1×1012mol·L-1。早期使用的細胞毒素包括doxorubincin(阿霉素,10)或其同系物11,以及psymberin(9,irciniastatinA)。因為這些藥物活性不夠高,開發(fā)新一代ADC化合物已經(jīng)很少采用這些化合物作為效應分子。1.2br98—接頭ADC的接頭極為關鍵。簡單地說,接頭至少要符合兩個標準:(1)在體內足夠穩(wěn)定,不會在血液循環(huán)中脫落,避免因效應分子脫落產(chǎn)生毒性;(2)在靶點有效地釋放效應分子。實際上接頭的設計會因ADC的不同而非常復雜,相同的接頭在不同的ADC分子中會表現(xiàn)不同性能。除此之外,有些偶聯(lián)物即使接頭不在腫瘤細胞內釋放藥物也能產(chǎn)生療效。一部分接頭也會因偶聯(lián)的方式或抗體不同而導致沉淀(聚合)反應等。本文首先簡單介紹目前經(jīng)常使用的接頭,而后分類討論在不同情況下接頭的選擇。總之,通過選擇適當?shù)慕宇^和在適當位點偶聯(lián)適當個數(shù)的效應分子,ADC在抵達靶點之前應該表現(xiàn)和裸單抗(nakedmAb)相同特征,其中包括和單抗本身同等的穩(wěn)定性和半衰期以便減少給藥頻率,對抗原相同的親和力以保持同等的靶向性,以及類似單抗或更高的細胞內化功能等。因為不同細胞表面表達有不同豐度的抗原,而且細胞內化常常是單抗藥物表現(xiàn)活性的關鍵,同樣也是ADC顯示療效的關鍵。經(jīng)過近三十年的改造、進化,抗體和效應分子的連接技術已經(jīng)趨于完善。接頭從性能上可以分為兩大類:可裂解性接頭和穩(wěn)定性接頭?？闪呀庑越宇^又包括化學裂解性接頭和酶催化接頭兩種。表1列出常用的幾類可裂解性接頭的化學結構、特征以及設計要點。1.2.1化學裂解型接頭腙鍵接頭——可裂解性接頭是根據(jù)正常細胞和腫瘤細胞之間的區(qū)別來設計,以便體現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向性。依據(jù)腫瘤細胞內呈弱酸性,比如溶酶體(lysosome)pH4.5~5.0及核內體(endosome)pH5.0~6.5,而循環(huán)系統(tǒng)呈中性pH7.3~7.5的特點,早期化學可裂解性接頭采用酸性不穩(wěn)定而在中性條件下較穩(wěn)定的腙鍵(hydrazone)接頭。體外實驗表明,部分腙鍵接頭在循環(huán)系統(tǒng)中24h大約有5%~6%的細胞毒素脫落,而在癌細胞內會高達97%~98%。BR96—MHH-阿霉素抗體藥物偶聯(lián)物就是采用在酸性環(huán)境中能被分解的腙鍵接頭,MHH(表1)把人源化單克隆抗體BR96通過抗體表面的半胱氨酸(cysteine)和阿霉素連接而成。然而,腙鍵接頭選擇性相對較低,在循環(huán)系統(tǒng)中能釋放一定的細胞毒素從而半衰期較短(43h),而很多裸抗體(nakedantibody)本身在人體內的半衰期可達至少幾天甚至幾周。盡管該施貴寶ADC在動物模型中高劑量下(100mg·kg-1體重)對腫瘤產(chǎn)生非常好的抑制效果,但臨床實驗卻沒有顯示明顯療效。因為阿霉素對人體細胞株的活性相對較低,EC50只有0.1~0.2μmol·L-1。雙硫鍵接頭——依據(jù)雙硫鍵能在細胞內還原的環(huán)境中被分解,而在循環(huán)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定的特征,雙硫鍵接頭是目前抗體藥物偶聯(lián)物領域常用的化學可裂解接頭之一。但是,循環(huán)系統(tǒng)還原劑的濃度也相當高,比如谷胱甘肽(glutathione)的濃度高達微摩爾/升數(shù)量級。為了避免在血液中裂解,提高ADC的穩(wěn)定性,常見的雙硫鍵接頭的一端通常引入一個(MDS,表1)或兩個甲基(DMDS、DSDM,表1)修飾。在細胞內,尤其是相對缺氧環(huán)境的腫瘤細胞內谷胱甘肽的濃度要高一千倍(毫摩爾數(shù)量級),以致ADC化合物在腫瘤細胞內順利裂解,釋放細胞毒素。紐約州立大學的Ojima教授及其他研究人員采用單甲基修飾的雙硫鍵接頭(MDS)把靶向表皮生長因子受體(EGFR)的單抗KS77和紫杉醇衍生物10-MDSPrTaxoid(8,圖2)偶聯(lián),得到的偶聯(lián)物KS77-MDS-Taxoid在體外實驗中對多種腫瘤細胞株顯示EGFR誘導的抑制作用。小鼠接種實驗表明,KS77-MDS-Taxoid能有效地抑制腫瘤生長,而紫杉醇本身沒有顯示任何療效。利用相同的MDS接頭,ImmunoGen研究人員把美登素衍生物TM1(3b)和人源化單抗huC242連接,得到的huC242-MDS-TM1(cantuzumabmertansine)每分子抗體含有4~5個藥物。實驗表明,cantuzumabmertansine在小鼠體內的半衰期為42.2h,和以上紫杉醇偶聯(lián)物的結果相仿,都明顯低于抗體本身的半衰期。針對相同的抗體和效應分子,采用二甲基修飾的接頭DSDM偶聯(lián)的ADC顯示更長的半衰期。雙功能接頭——腙鍵或雙硫鍵接頭不僅可以單獨使用,聯(lián)合應用有時能提高釋放細胞毒素的效率,表現(xiàn)更好療效。美國FDA早在2000年通過快速通道批準上市的Mylotarg(gemtuzumabozogamincin)就是采用雙硫鍵和腙鍵聯(lián)用的NDMDS接頭(表1),來連接人源化單克隆抗體CD33IgG4k和刺孢霉素(calicheamicin)而成(化合物12,圖3)。4-(4-乙酰苯氧基)丁酸能選擇性地和抗體表面的賴氨酸偶聯(lián),而后乙酰基和N-乙酰-γ-刺孢霉素二甲基酰肼縮合生成gemtuzumabozogamincin。借助抗體-抗原的相互作用,Mylotarg靶向性地內化到CD33陽性的血癌細胞,因為癌細胞內部pH值明顯低于循環(huán)系統(tǒng),加速了ADC腙鍵的裂解速度。Mylotarg臨床上用于治療急性髓細胞樣白血病(ALL)的劑量為9mg·m-2,每兩周給藥兩次,完全緩和率約30%。盡管多數(shù)臨床前研究表明,采用雙功能接頭(NDMDS)制備的ADC通常顯示更好的療效,體外、體內實驗卻顯示采用雙硫鍵接頭(DMDS)把鼠源單抗CTM01和刺孢霉素偶聯(lián)的ADC(化合物13,圖3)和采用NDMDS接頭制備的偶聯(lián)物相比活性相仿。1.2.2氨基芐基氨基甲酸酯衍生物二肽接頭——循環(huán)系統(tǒng)和腫瘤的組織環(huán)境差異不夠大,通?；瘜W裂解型接頭在血液中的穩(wěn)定還不夠充分,會因為細胞毒素脫落而導致系統(tǒng)不良反應。依據(jù)組織蛋白酶(cathepsin)、血漿酶(plasmin)等蛋白酶(protease)在腫瘤組織中高度表達,而這些酶在正常組織外因pH值較高而失去活性的事實,以及一些肽鍵能被溶酶體中的蛋白酶分解的特征,西雅圖遺傳(SeattleGenetics)公司率先采用含有一個纈氨酸-瓜氨酸的二肽接頭(MHVCBC,表1)把微管抑制劑auristatinE或F偶聯(lián)到人源化單克隆抗體。含有纈氨酸-瓜氨酸(vc)的二肽接頭是目前應用最廣泛的接頭之一。利用還原單抗的雙硫鍵產(chǎn)生多個游離巰基,比如還原抗CD30的單抗cAC10能得到8個游離巰基,而這些巰基可以與馬來酰胺基團作用,生成cAC10-vcMMAE(14),也就是SGN-35或Adcetris。因為抗體上只有那些接近溶劑的巰基可以發(fā)生偶聯(lián)反應,形成相對均一的ADC衍生物。如圖4所示,該類ADC在抗原誘導內化后,腫瘤細胞內高度表達的組織蛋白酶、血漿酶切斷二肽(vc)和苯胺之間的兩個酰胺鍵,導致對氨基芐基氨基甲酸酯(18)的自身消除,釋放細胞毒素MMAE。與化學裂解性接頭相比,酶催化接頭對循環(huán)系統(tǒng)有更高的穩(wěn)定性。有數(shù)據(jù)表明,二肽接頭比化學裂解性接頭在人類循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定性要高一百倍,在小鼠和猴體內的半衰期大約6~10天。和其他篩選的二肽相比,纈氨酸-瓜氨酸顯示更高的血漿穩(wěn)定性并在如組織蛋白酶(cathepsinB)催化下更容易裂解,是目前最理想的已知二肽接頭。mAb-vcMMAE偶聯(lián)物的療效風險比(therapeuticwindow)高達200以上,也就是說在耐受劑量的二百分之一的劑量下,采用mAb-vcMMAE治療,可以得到治愈或完全緩解。西雅圖遺傳生物制藥公司的這一專利技術已經(jīng)得到廣泛應用。值得注意的是,二肽接頭中的纈氨酸-瓜氨酸酶裂解區(qū)不僅可以放在隔離區(qū)和釋放區(qū)的中間(比如MHVCBC接頭,表1),也可以象MPVCBC接頭(表1)一樣,連到釋放區(qū)的對位氨基上。只是這樣連接方式的效果尚未見具體報道。β-葡糖醛酸接頭——西雅圖遺傳生物制藥公司根據(jù)腫瘤細胞葡糖醛酸酶的濃度要遠遠高于循環(huán)系統(tǒng)率先開發(fā)了β-葡糖醛酸接頭(GBC)。如圖5所示,葡糖醛酸接頭的作用原理和二肽接頭相似,偶聯(lián)物21中的葡糖醛酸官能團在腫瘤細胞內被葡糖醛酸酶水解,釋放的對-羥基表現(xiàn)一定負電性,并沿著苯環(huán)推動電子轉移(22),釋放細胞毒素。β-葡糖醛酸接頭親水性強,通常不會因為水溶性差而聚合,而且在循環(huán)系統(tǒng)體現(xiàn)較高的穩(wěn)定性,個別含有葡糖醛酸接頭的ADC半衰期長達81天。如果把傳統(tǒng)β-葡糖醛酸接頭在氨基甲酸酯和細胞毒素之間加上一個二甲基乙二胺隔離棒(24),β-葡糖醛酸接頭就可以適用于含有任何羥基的細胞毒素。β-葡糖醛酸接頭已經(jīng)被廣泛使用。Duocarmycin前藥接頭——如圖6所示,SyntargaADC接頭技術含有二肽切斷區(qū)、自身消除區(qū)和前藥釋放區(qū)三個分子組成部分,最大的特色是效應分子duocarmycin以氯代物前藥形式存在(27,圖6)。在腫瘤細胞內組織蛋白酶切斷偶聯(lián)物27中二肽的酰胺鍵,啟動對氨基芐基氨基甲酸酯的自身消除并形成中間體29。29中的氨基繼而親核進攻羰基并環(huán)化,釋放duocarmycin前藥30,并重排產(chǎn)生DNA切割劑duocarmycin。Syntarga技術有如下幾個特點:和接頭偶聯(lián)以后效應分子則失去活性,以便降低對循環(huán)系統(tǒng)的毒性。該技術適用于所有含有羥基的效應分子。Synthon制藥公司在2011年收購Syntarga以后,進一步擴展了Syntarga接頭技術,把二肽酶解區(qū)連接到duocarmycin吲哚環(huán)6位的氨基上,和DNA雙螺旋結構結合的吲哚環(huán)采用水溶性官能團保護。雖然不少技術細節(jié)未被公開,但是Synthon公司透露他們的偶聯(lián)物在人類乳腺癌和非小細胞肺癌動物模型中顯示驚人的藥效,給藥后導致動物腫瘤完全消失。不僅如此,這類化合物和其他ADC相比耐受性更好,療效風險比有望居同類之最。當然,目前報道的僅僅是動物結果,這個藥效是否能轉化到人體還有待進一步考證。1.2.3生物活性分子的活性ImmunoGen發(fā)現(xiàn)硫醚鍵接頭MHN和SAHN(表1)純屬偶然,如圖3所示,最初他們制備由硫醚鍵連接的T-DM1抗體偶聯(lián)物15只是用作對照品,結果顯示這個ADC在循環(huán)系統(tǒng)內的半衰期顯著提高。這些含有巰基的美登素衍生物能和微管蛋白結合,有效地抑制微管解聚,顯示抗有絲分裂活性。不僅如此,對照品偶聯(lián)物15顯示很強的生物活性。被腫瘤細胞吞噬后,ADC的抗體部分在溶酶體內被破壞,釋放了仍然帶有賴氨酸但具有同等活性的美登素細胞毒素。估計因為可離子化的賴氨酸的存在,美登素衍生物不能通過細胞膜,因而無法滲透到相鄰細胞并顯示細胞毒性。所以這類ADC對不同細胞株的廣譜性還有待確認。有數(shù)據(jù)表明,以T-DM1為代表的含有穩(wěn)定性接頭的ADC藥物顯示更高的穩(wěn)定性和耐受性。和ImmunoGen相仿,西雅圖遺傳生物制藥公司也采用類似的穩(wěn)定硫醚鍵接頭,把MMAF和抗CD30單抗或抗LeY單抗偶聯(lián),生成的偶聯(lián)物保持原有的生物活性。降解后效應分子的質譜研究顯示降解的MMAF含有一個半胱氨酸,盡管MMAE的結構相仿,但采用同樣方式連接的ADC不顯示明顯療效。PeterSenter等報道ADC化合物mAb-MHN-MMAF的效應分子可能和白蛋白交換,而這種交換可以通過乙酰胺取代馬來酰胺抑制(表1),偶聯(lián)物mAb-SAHN-MMAF非常穩(wěn)定,在循環(huán)體系內14天沒有觀察到明顯的降解。與二肽酶催化接頭相比,適應于穩(wěn)定接頭的效應分子有很大隨機性,到目前為止還沒有一個明顯規(guī)律可循。DM4和人源化單抗huC242偶聯(lián),形成的偶聯(lián)物在體外顯示良好的抗腫瘤活性,但是動物實驗沒有觀察到顯著的抗腫瘤效果。和以上相同,降解后效應分子也是Lysine-DM4。1.2.4以化合物類型為原料的adc化合物藥物還可以直接通過共價鍵連接到單克隆抗體或抗體片段,并顯示類似活性。這類ADC化合物的設計原理和采用穩(wěn)定硫醚鍵接頭的偶聯(lián)物相仿,ADC內化并分解后,釋放具有高活性的含有氨基酸殘基片段的效應分子。其中連接藥物和抗體之間的隔離區(qū)越短越有益于偶聯(lián)物的穩(wěn)定性和藥效。1.3抗自身蛋白藥物的作用抗體是抗體藥物偶聯(lián)物的制導部分。原則上說任何在腫瘤細胞表面表達的抗原,包括多肽、維生素、核酸適體等都可以成為ADC的靶標。雖然很罕見,理想抗體是針對那些僅僅生長在腫瘤細胞表面,而在健康組織或細胞表面不表達的抗原。除此之外,抗體藥物偶聯(lián)物不僅能在腫瘤細胞內釋放效應分子,也必須能保持抗體或抗體片段原有的特征,比如保持IgG1抗體Fc鏈引入的免疫效應、抗體引起的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬或Fc介導的補體依賴性細胞毒性(CDC)等。ADC的抗體部分至少具有三方面作用:(1)和裸抗體一樣,能有效地把偶聯(lián)物輸送到靶向細胞表面,是“生物導彈”的制導系統(tǒng);(2)誘導單克隆抗體的細胞吞噬(internalization),進入前溶酶體并導致效應分子細胞內的有效釋放。對于靶向造血分化抗原的抗體,內化過程有時需要補體的參與;(3)保持裸抗體的全部或部分性質,誘導抗體依賴性的細胞毒性(ADCC),也就是說單抗部分也是有效的藥物。目前常用的抗腫瘤單抗藥物理論上都可以和藥物偶聯(lián),制備抗體藥物偶聯(lián)物,靶向特異抗原高表達的腫瘤。根據(jù)不同靶點,常見單抗藥物大致可分為以下幾類:(1)以白細胞分化抗原CD分子為靶點的單抗,如抗CD20、CD33、CD52等單抗,多用于治療白血病和淋巴瘤;(2)以血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)為靶點的單抗,如貝伐單抗(bevacizumab)等,多用于治療結腸癌和胃癌;(3)以表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)家族為靶點的單抗,如抗EGFR單抗、抗表皮生長因子受體2(epidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)單抗,多用于治療實體腫瘤。近年來,抗HER2的治療性單抗備受關注。HER2是EGFR成員,參與乳腺癌的發(fā)生,且與乳腺癌患者的預后有關。相應單抗與HER2結合可阻止HER2與相應的生長因子結合,抑制乳腺腫瘤細胞的分裂和轉移,加速腫瘤細胞的清除。本實驗室近期發(fā)現(xiàn),抗HER2單抗還可以刺激機體的適應性免疫(adaptiveimmunity),阻止腫瘤轉移并提高治療效果。依據(jù)抗原分類,林莉等最近已經(jīng)對不同抗體制備的偶聯(lián)物做過詳細的描述?？贵w的選擇對ADC的成功起著關鍵性的作用。腫瘤細胞表面抗原表達的數(shù)量、細胞吞噬抗體的速率、以及靶標從細胞膜上脫落等因素都會影響到ADC的活性。CD19、CD20、CD22、CD30、以及HER2均為常見的標靶。理想的抗體是那些單克隆抗體或抗體片段能高效率地識別、結合絕大部分腫瘤表面的抗原或受體,并且在細胞表面上有效地被腫瘤細胞吞噬,進入前溶酶體并破壞腫瘤細胞。這樣,除了抗體本身的抗癌作用以外,釋放的細胞毒素進一步擴大對腫瘤細胞的殺傷范圍。2抗藥物偶聯(lián)物的分子特征很多數(shù)據(jù)顯示,臨床上成功的ADC具有幾乎所有抗體藥本身的優(yōu)點,同時又避免了裸抗體的缺陷,尤其重要的是因為能釋放高活性的效應分子,ADC療效明顯優(yōu)于抗體本身。隨著Kadcyla和Adcetris的上市,ADC尤其在抗腫瘤領域將來有望成為生物抗體藥的主流。經(jīng)過幾十年的探索,ADC在技術上也日趨成熟。ADC既可以看作是一種理想的前藥設計理念,也可以是精確靶向腫瘤的藥物輸送系統(tǒng)。設計成功的抗體藥物偶聯(lián)物不僅要優(yōu)化每一個組件,也要注重每個組件的配搭和相互影響。如圖7所示,ADC藥物要達到設計目標至少要突破四項主要屏障。對固體腫瘤而言,ADC首先需要滲透到腫瘤組織才能和靶向抗原結合,而抗體的分子大小、對抗原的親和力等性能是決定偶聯(lián)物的滲透性和對靶向細胞粘合性的主要因素。其次,只有被靶向細胞吞噬的偶聯(lián)物才能進入酶溶體,已有數(shù)據(jù)表明只有小部分ADC才能被腫瘤細胞吞噬并產(chǎn)生作用?？贵w藥物偶聯(lián)物的下一個屏障是酶溶體內的裂解,尤其對于那些以穩(wěn)定性接頭相連的ADC,只有被酶溶體裂解的偶聯(lián)物才能釋放效應分子并產(chǎn)生抗體依賴性細胞毒性。當然,有效地釋放效應分子并誘導細胞凋亡是抗體藥物偶聯(lián)物的最終目標。除此之外,設計理想的ADC藥物還要明確突破以上屏障的關鍵作用節(jié)點和理想的分子特征,而后優(yōu)化每一個可能影響的因素。理想ADC應該有下列分子特征:(1)穩(wěn)定性。ADC通常采用靜脈注射給藥,既要方便患者減少給藥頻率,又要保持一定的血藥濃度,理想的ADC藥物必須在循環(huán)系統(tǒng)有足夠的穩(wěn)定性。而穩(wěn)定性又和抗體的天然特征如鼠源還是人源化的,分子大小、偶聯(lián)物接頭的穩(wěn)定性、效應分子性質和個數(shù)等相關。(2)滲透性。由于腫瘤尤其是固體腫瘤組織的復雜性,良好的滲透性是生物抗體藥有效抵達靶點組織的必備條件。通常滲透性和藥物的分子量成反比。(3)抗體對抗原適當?shù)挠H和力。腫瘤細胞表達抗原的豐度和抗體對抗原的親和力直接影響抗體藥物偶聯(lián)物的粘合效率,其中藥物動力學又起到關鍵性作用。(4)吞噬率(rateofinternalization)。包括抗體和抗原的天然性能等很多因素影響腫瘤細胞對抗體藥物偶聯(lián)物的吞噬率。(5)效應分子的釋放。藥物在腫瘤細胞內從偶聯(lián)物上的脫離效果(通常通過溶酶體起作用)對ADC的療效起關鍵性作用。(6)效應分子的擴散。鑒于細胞表面抗原表達豐度的不同導致細胞吞噬的不均一性,在很多情況下效應分子必須遷移到周圍細胞才能殺傷這些癌細胞。再者,效應分子在細胞內也需要遷移到靶向區(qū)域比如細胞核(DNA)或微管等才能發(fā)生作用。下面分別從抗體、彈頭和接頭三個方面分別探討優(yōu)化改良每個關鍵接點的策略和技巧。2.1以單克隆抗體或抗體片段為制導系統(tǒng)的adc藥物很多ADC理想的成藥性能和抗體自身的天然特征相關,而且也可以通過修飾抗體改善。前面指出,任何靶向生長在腫瘤細胞表面的多肽、維生素以及核酸適體等抗原的分子體系原則上都可以作為ADC藥物的制導系統(tǒng)。因篇幅限制,本文主要討論以單克隆抗體或抗體片段為制導系統(tǒng)的ADC藥物。下面是選擇和優(yōu)化抗體需要慎重考慮的一些因素。2.1.1免疫原h(huán)is抗原、抗體和偶聯(lián)物的性質都會影響內化的速率和效率,從而影響偶聯(lián)物的細胞吞噬和安全性,其中抗原的分布和豐度是選擇靶點的關鍵。無論是腫瘤還是其他適應證的靶點,理想情況下,ADC靶向的抗原應當分布于靶標細胞的表面,而正常細胞不表達同樣的抗原。當然這樣的理想狀況并不存在,一般認為雖然癌細胞不大生長全新抗原,因為一旦形成就被機體的免疫系統(tǒng)清除,但癌細胞表面表達的抗原數(shù)目和正常細胞有明顯區(qū)別。所以,正常組織或多或少地表達一定豐度的相同抗原,而腫瘤細胞和正常細胞表達該抗原的比值,以及抗原在腫瘤細胞表面表達的均一性直接影響抗體藥物偶聯(lián)物的選擇性。除此之外,對于不同的ADC,其標靶抗原表達的數(shù)目差異較大。比如CD33陽性的急性髓性白血病細胞(AML)的抗原表達相對較低,每個細胞表達約5千至1萬個受體。靶向CD33的Mylotarg在臨床前以及臨床實驗中表現(xiàn)明顯的療效。相反,部分HER2陽性的轉移性乳腺癌患者中,每個細胞有時表達超過3百萬個抗原。以HER2為靶標的Kadcyla也表現(xiàn)明顯的療效。所以,腫瘤細胞表面抗原的表達數(shù)目和ADC的療效有一定相關性,但只要設計合理,靶向低表達抗原的ADC同樣能產(chǎn)生顯著療效。因此在立項之前,研究人員必須對靶點尤其是靶向該靶點的抗體有較多的了解,挑選那些已經(jīng)做過大量研究的單抗制備偶聯(lián)物,相反,則可考慮采用上市或臨床證實過療效的單抗為起點。2.1.2人類免疫藥物主要利用1975年英國科學家Milstein和其博士后Kohler共同發(fā)明的雜交瘤單克隆抗體技術,早期開發(fā)的單抗藥物大部分是鼠源的。然而,人類免疫系統(tǒng)能夠清除外來物質,在很大程度上限制了鼠源抗體的療效。在以后的一段時間里,尤其在抗腫瘤領域,降低抗體的自身免疫性成為生物抗體研究領域的重點之一。嵌合型、改型或表面重塑、以及抗體庫技術也應運而生。因為人源化改造過程復雜、工作量大,而且鼠源成分較難消除徹底,目前制備全人源單抗或抗體片段通常采用抗體庫篩選技術、基因工程小鼠以及包括大腸桿菌、酵母、昆蟲桿狀病毒、哺乳動物細胞等人源單克隆抗體表達系統(tǒng)。2.1.3抗原螯蝦的分子通常認為,只有遠低于百分之一靜脈注射的效應分子真正能抵達腫瘤細胞并起作用。其中抗體分子的大小起著舉足輕重的作用。血管壁、組織屏障、血腦屏障的穿透性直接和抗體分子的大小相關,在其他條件相等的情況下,分子量越小穿透力越強,但也越容易被腎臟清除,導致半衰期降低。所以,在構建治療性重組抗體時要同時兼顧表達產(chǎn)物的分子量大小,以便改善抗體的穿透性及代謝動力學、半衰期長短和清除率等。如果抗體分子很大,超過腎清除體積,或者較小但具有相當高的親和力,則能延長半衰期并提高吸收率。在保持抗原性和親和力不受影響的前提下,改善相應的抗體大小、抗體結合價的數(shù)目和融合蛋白的形式,可以保證目標ADC有足夠長的半衰期和血藥濃度。2.1.4人源化抗體的培養(yǎng)抗體對抗原的親和力是發(fā)揮抗體效應功能的首要條件,也是重組單抗人源化改造的主要瓶頸之一。一般來說,人源化抗體只能達到最初鼠源抗體親和力的1/2~1/3。所以保持或提高原始抗體的親和力是構建人源抗體的重要目標之一。很多實驗證明,抗體親和力的改良也需要一個平衡,太高了雖然有利于和抗原結合,但也更易被機體清除,通常保持偶合常數(shù)在1×10-7~1×10-9mol·L-1為最佳。2.1.6偶聯(lián)效應分子的優(yōu)化除了極少部分抗體可以利用抗原結合位置和藥物結合以外,重組DNA技術也可以引入需要的氨基酸,所以偶聯(lián)通常不是設計抗體藥物偶聯(lián)物的一個主要障礙。為了保持裸抗體包括半衰期、親和力等原有的特征,尤其保證引入細胞毒素的固定個數(shù)和偶聯(lián)物的均一性,偶聯(lián)氨基酸殘基(接點)的位置和性質非常關鍵。最常見的偶聯(lián)方式是通過賴氨酸(lysine)或半胱氨酸(cysteine)偶聯(lián)。其他適用于偶聯(lián)的官能團還包括谷氨酸(glutamine)、糖基、或SNAP-tag。多數(shù)抗體富含活潑的賴氨酸,比如trastuzumab含有88個賴氨酸,所以賴氨酸是最常見的偶聯(lián)接點之一。但必須注意,采用表面賴氨酸為接點,有可能改變抗體攜帶的正電荷,甚至顯著降低其穩(wěn)定性。所以以賴氨酸為接點的ADC化合物對偶聯(lián)藥物的個數(shù)更敏感。第一代抗CD30-vc-MMAE是通過還原抗體的雙硫鍵形成8個巰基而后偶聯(lián)而成。因為單抗只有4個雙巰鍵能被還原,所以最多只能形成8個半胱氨酸巰基。這樣得到的ADC具有較高的均一性,每分子抗體可以引入8個效應分子。但是實驗證明,這樣形成的ADC和抗體本身相比,在循環(huán)系統(tǒng)內清除率要快很多。盡管Adcetris每個抗體分子只含有4個MMAE,體外活性也比抗CD30-vc-MMAE低一半,動物實驗顯示出相似的療效。這兩個化合物頭對頭比較顯示,前者含有8個細胞毒素的ADC血液清除率比后者快一半,更重要的是耐藥性和細胞毒素個數(shù)直接相關,成正比,也就是說盡管這兩個ADC化合物展現(xiàn)類似的藥效,但是含有4個效應分子的后者耐藥性能好一倍,即療效風險比高一倍。所以優(yōu)化偶聯(lián)效應分子的個數(shù)非常重要。通過蛋白重組(recombinant)技術制備含有固定氨基酸殘基的單抗用于偶聯(lián)是一個更理想的辦法。第一個按照這個思路開發(fā)的cAC10把相關半胱氨酸(cysteine)采用基因工程用絲氨酸(serine)取代。采用這個方法制備的ADC,每分子抗體含有2~4個藥物,偶聯(lián)均一性明顯優(yōu)于其他偶聯(lián)的模式。頭對頭臨床前實驗比較發(fā)現(xiàn),親和力、細胞毒性、體內耐藥性、以及藥效僅僅和偶聯(lián)藥物的個數(shù)相關,無論是Adcetris還是重組蛋白取代絲氨酸的化合物,含有4個MMAE的ADC顯示同等的藥效和耐受性。其他常見的偶聯(lián)途徑是在固定位點構筑半胱氨酸。如在抗-muc16單抗thiomab固定區(qū)域構筑兩個分子的半胱氨酸,通過和含有Val-Cit-MMAE的馬來酰胺縮合,得到含有每分子1.6個MMAE的偶聯(lián)物TDC。尤其重要的是這樣制備的TDC和傳統(tǒng)方法制備的含有3.1個細胞毒素的ADC在小鼠接種動物實驗中顯示相同的藥效,但是耐受性有顯著提高。所有數(shù)據(jù)都表明每抗體分子含有2~4個效應分子是最佳比例。除了在大部分情況下有礙單抗的半衰期以外,攜帶更多細胞毒素的另一個副作用是過多的細胞毒素可能使抗體整體的變化較大,導致人體免疫系統(tǒng)認為抗體有損傷或破壞,以致啟動清除機制,排出體外。不同接點或偶聯(lián)方式明顯地影響偶聯(lián)物的均一性。以Mylotarg為例,通過修飾表面的賴氨酸進行偶聯(lián)得到的平均藥物抗體比(DAR)約2~3,但大約50%的抗體連有4~6個細胞毒素,而另一半抗體根本就是裸著的。T-DM1平均DAR是3.5個,但范圍是1~7個。Adcetris的DAR是4,其分布是每分子抗體含有0~8個藥物分子。Hutchins等最近還報道在IgGFc抗體的C端嵌入一個非天然氨基酸selenocysteine(Sec),并用于和效應分子偶聯(lián)。2.1.7偶聯(lián)條件traut在設計ADC化合物,尤其是挑選合適的接頭和抗體的時候同時必須考慮適用的偶聯(lián)反應。除此之外,還要考慮到抗體在偶聯(lián)條件下的穩(wěn)定性。如果為了更有效地控制偶聯(lián)位點,用游離巰基為接點,常見的偶聯(lián)條件包括Traut試劑(2-iminothiolane)、SATA(N-succinimidylS-acetylthioacetate)、SAMSA(S-acetylmercaptosuccinicanhydride)?？贵w表面的巰基既可以采用DTT(dithiothreitol)、AET(2-aminoethylisothiouroniumbromide)或TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)還原雙硫鍵獲得,也可以通過基因改造,直接在抗體表面引入游離的半胱氨酸、或硒代半胱氨酸殘基(Sec)。2.2在臨床試驗中的應用如果說抗體的重要性相當于是導彈的制導部分,那么細胞毒素的作用就相當于彈頭。第一代ADC失敗的主要原因之一就是細胞毒素活性不夠。比如施貴寶研究人員早期采用腙鍵接頭(MHH)把阿霉素(doxorubincin)連到人源化單抗BR96上。因為阿霉素活性較低,形成的BR96-MHH-doxorubincin需要高達100mg·kg-1體重的劑量才可以完全清除小鼠或大鼠腫瘤。一期臨床試驗最大耐受劑量高達700mg·m-2。另外,實驗還發(fā)現(xiàn)該ADC藥物的半衰期在人體內僅為43h,而且對腫瘤沒有明顯的抑制作用。其中阿霉素的低活性、接頭的不穩(wěn)定性、以及非腫瘤細胞也表達相當數(shù)量的抗原是這次失敗的主要原因。除此之外,BR96-MHH-doxorubicin中每個抗體含有8個阿霉素分子,藥物/抗體比值偏高,可能是導致半衰期顯著降低的另一個重要因素。早期的經(jīng)驗教訓使研究人員認識到細胞毒素活性的重要性,隨后一系列包括刺孢霉素(calicheamicin)等高活性藥物被連接到抗體上。和阿霉素抗體偶聯(lián)物相比,連接刺孢霉素ADC的活性遠遠高于前者,給藥劑量顯著降低。頭對頭比較發(fā)現(xiàn),采用刺孢霉素為效應分子的ADC在2mg·kg-1體重的劑量時可以達到阿霉素100mg·kg-1體重的劑量療效。這個結果和體外實驗一致,如刺孢霉素衍生物ADC對多種細胞的活性比阿霉素同系物要高1000倍以上。事實上,第一個上市的ADC藥物Mylotarg(12)就是采用刺孢霉素為彈頭的。臨床上在9mg·m-2的劑量下,大約有30%的AML患者得到完全緩解。但該產(chǎn)品因較大副作用且不能有效延長患者的總存活期在2010年撤出市場。很有可能因為雙硫鍵-腙鍵雙功能接頭的血液穩(wěn)定性不是足夠好,比如其半衰期僅有72h。這也是很多不表達CD33的AML患者也顯示療效的原因。盡管如此,Wyeth(現(xiàn)輝瑞公司)的一個類似ADC化合物inotazumabozogamicin(CMC-544)使用和Mylotarg相同的雙硫鍵-腙鍵雙功能接頭,把一個人源化抗CD22單抗和刺孢霉素連接,這個ADC的穩(wěn)定性或半衰期遠遠高于Mylotarg,4天的裂解率只有1%~2%,說明ADC的穩(wěn)定性不僅和使用的接頭有關,也和連接的單抗結構相關。然而,輝瑞剛剛披露inotazumabozogamicin在一個三期臨床試驗中和對照組相比沒有顯著提高患者的總生存率(OS)。這個代號為B1931008的隨機、開放標簽、雙組的臨床試驗評價inotuzumabozogamicin對不適合高劑量化療、復發(fā)性或難治性非霍奇金淋巴瘤患者的安全性及療效。在這項研究中,治療組采用inotuzumabozogamicin和美羅華聯(lián)合用藥,每月給藥一次,對照組采用苯達莫司汀(bendamustine)或吉西他濱/美羅華組合。中期數(shù)據(jù)統(tǒng)計指出,inotuzumabozogamicin聯(lián)合用藥組和對照組相比沒有提高總生存率(OS),輝瑞因此終止了該臨床試驗。Inotuzumabozogamicin的這個三期臨床試驗失敗說明,ADC藥物的開發(fā)可能遠不止技術上的突破,還有更多前所未知的分子機制有待探討。不過,inotuzumabozogamicin的其他兩個二期臨床試驗還在進行,治療非霍奇金淋巴瘤,一個三期臨床試驗因為注冊患者人數(shù)太少而流產(chǎn)。效應分子的選擇非常廣,原則上只要對腫瘤細胞的抑制活性足夠高,比如說IC50小于0.1nmol·L-1的化合物都可以用作偶聯(lián)藥物。近年來很多公司甚至采用靶向藥物作為ADC的彈頭,并且取得可喜結果。為了取得細胞毒素的最大活性,通常在設計ADC化合物時盡量做到在腫瘤內釋放細胞毒素本身,當然在很多情況下化學修飾過的彈頭表現(xiàn)同等或甚至更高的活性。除了刺孢霉素以外,最常用的細胞毒素還有auristatin、美登素(maytansine)、duocarmycin衍生物等。鑒于活性高、化學修飾簡單、以及廣譜性,作者更推薦美登素和auristatin衍生物作為理想的彈頭,更重要的是前者沒有專利保護,而后者在2017年專利即將到期,考慮到ADC的開發(fā)時間,因此也不會有知識產(chǎn)權糾紛。Auristatin類細胞毒素中的MMAF因為含有一個羧基,在循環(huán)系統(tǒng)內帶有負電荷難以滲透細胞膜,因此MMAF本身的活性較低,而和一些抗體偶聯(lián)以后顯示和MMAE類似的活性,是ADC理想的彈頭。當然,采用自主知識產(chǎn)權,活性更高,而又符合以上偶聯(lián)條件的細胞毒素或靶向藥物是更好的選擇。2.3穩(wěn)定接頭偶聯(lián)物接頭的分子結構不僅對ADC的穩(wěn)定性起關鍵作用,還可以直接影響偶聯(lián)物的生物活性、聚合狀態(tài)(沉淀反應)、生物利用度和體內分布。理想的接頭除了要滿足前面談到的循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定性和在腫瘤細胞內有效地釋放效應分子這兩個基本要求以外,在選擇或設計接頭時尤其還要注意以下幾點:(1)水溶性。接頭對水溶性的要求根據(jù)效應分子的不同而變化。如果效應分子的水溶性較差,則盡可能選用水溶性較大的接頭,以避免ADC的聚合或沉淀。除了設計或挑選象葡萄糖醛酸接頭(GBC)等水溶性高的接頭以外,還可以在裂解區(qū)兩邊增加水溶性(比如聚乙二醇)的隔離棒(spacer)來提高接頭的水溶性。另外,偶聯(lián)反應通常也是在水溶液中進行。(2)接頭類型。接頭的分子結構因靶標、抗體以及效應分子而異。對不太容易被分解的靶點環(huán)境應選用裂解性接頭,一般來說,采用裂解性接頭偶聯(lián)的ADC或多或少地會在循環(huán)系統(tǒng)中脫落,以致造成非靶標性的毒性;反之,對吞噬率相對較高的單克隆抗體或抗體片段還可以采用穩(wěn)定接頭。采用這類接頭的ADC對腫瘤靶標的選擇性通常較高,因此系統(tǒng)性的毒性會相對較低,有望起到療效高毒性小的理想效果。(3)連接效應分子的數(shù)目。選擇不同的接頭也會影響連接效應分子的數(shù)目:連接藥物個數(shù)不夠直接導致ADC的活性不夠,而過多藥物導致偶聯(lián)物半衰期和耐受性的降低,并可能損害抗體對抗原的親和力。理想的偶聯(lián)個數(shù)每個單抗分子含有2~4個藥物。傳統(tǒng)的偶聯(lián)方式主要利用單抗表面的氨基酸殘基比如賴氨酸、半胱氨酸等和偶聯(lián)試劑反應。已經(jīng)報道通過這個方法可以連接高達16個阿霉素到抗體上,但是這樣的偶聯(lián)物因為聚合而損害了其生物活性。為了降低聚合程度,第一個上市的偶聯(lián)物gemtuzumabozogamicin每個抗體平均只含有2~3個細胞毒素,實際上按照這個方法制備的偶聯(lián)物非常不均一,據(jù)稱有一半抗體實際上沒有和藥物偶聯(lián)。偶聯(lián)技術一直在改良,比如加入一種添加劑可以有效地提高以上calicheamicin偶聯(lián)的均一性。考慮穩(wěn)定性、裂解性、水溶性等參數(shù),作者認為對各種抗體和效應分子應用面最廣的接頭當屬纈氨酸-瓜氨酸二肽接頭(如MHVCBC,表1)。當然,纈氨酸-瓜氨酸二肽接頭還需要嵌合不同水溶性的隔離棒進一步修飾,以符合各種抗體和效應分子的要求。目前采用西雅圖遺傳生物制藥公司mAb-vcMMAE(F)技術的抗體有:BCMA、CD19、CD20、CD70。另外值得注意的是:抗體偶聯(lián)物領域的一個重要努力是提高接頭的循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定性,但是西雅圖遺傳生物制藥公司的研究人員觀察到,一旦ADC的穩(wěn)定性超過6~7天,進一步提高穩(wěn)定性在臨床前試驗中已經(jīng)無附加優(yōu)勢。盡管ADC每一個組件都可以單獨優(yōu)化,但最終偶聯(lián)物的特征也有一定個性?；蛱┛说难芯咳藛T系統(tǒng)地頭對頭地比較了抗非霍奇金淋巴癌的一系列ADC化合物中抗體、接頭對最終ADC的影響。他們發(fā)現(xiàn),在篩選的7種抗CD19、CD20、CD21、CD22、CD72、CD79B、CD180偶聯(lián)物中,由酶解接頭相連的偶聯(lián)物在動物實驗中都顯示明顯療效,而由穩(wěn)定性接頭相連的ADC只有針對CD和CD79B的偶聯(lián)物才表現(xiàn)明顯效果。采用穩(wěn)定性接頭形成的ADC安全性要更高一些,可能是由于在循環(huán)系統(tǒng)裂解的藥物更少,這似乎提供臨床上更多的選擇。為了深度比較采用硫醚鍵接頭的Kadcyla(T-DM1)和雙硫鍵接頭的優(yōu)劣,基因泰克的研究人員從體外到體內頭對頭的比較了Kadcyla(15)和T-SPP-DM1的活性、藥物動力學特征、標靶效應分子的釋放以及療效。結果發(fā)現(xiàn),盡管這兩個ADC化合物在多種體外、體內實驗有許多差別,但對DM1的靶向輸送效果完全相同。3抗癌藥的研發(fā)雖然抗體藥物偶聯(lián)物是一個“古老”的概念,但早期的研究沒有實質性進展。直到第二代抗體藥物偶聯(lián)物Adcetris和Kadcyla的上市才把開發(fā)ADC類抗癌藥推向腫瘤研究的制高點。目前幾乎所有制藥巨頭都有ADC在研項目。作者認為,目前開發(fā)ADC類新藥至少有來自三個方面的挑戰(zhàn)。3.1從孤兒藥向一線用藥的策略單克隆抗體是到目前為止最成熟也是最重要的生物類藥之一。在抗腫瘤研究領域,ADC是提高生物抗體藥活性最有效的方法。經(jīng)過幾十年的進化,ADC的設計日趨完善,已經(jīng)成為目前腫瘤研究的重要方向之一。據(jù)美中藥源不完全統(tǒng)計,到目前為止抗體藥物偶聯(lián)物領域至少有一百個在研項目,其中超過30個ADC化合物已經(jīng)進入不同階段的臨床試驗。ADC類新藥研發(fā)靶點清楚,技術成熟,是抗腫瘤領域典型和理想的切入點之一。Adcetris(14,brentuximabvedotin,曾用名:SGN-35和cAC10vcMMAE)是西雅圖遺傳制藥公司研發(fā)的ADC,在2011年8月19日被美國FDA批準上市,用于治療間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)和霍奇金淋巴瘤。根據(jù)美國FDA網(wǎng)站信息,Adcetris至少正在進行4個臨床試驗,都是作為一線抗腫瘤用藥。其中一個試驗是Adcetris聯(lián)合環(huán)磷酰胺、阿霉素和潑尼松(A+CHP),作為一線用藥治療表達CD30的成熟T-細胞淋巴瘤(MTCL)。此外,Adcetris的研發(fā)過程也是ADC藥物研發(fā)的典范。Adcetris的開發(fā)采取從孤兒藥著手而后擴大適應癥的策略,鑒于復發(fā)性間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)和霍奇金淋巴瘤缺少有效的治療手段,而Adcetris在臨床試驗中取得超過百分之七十的應答,很快取得監(jiān)管部門的認可。之后,由于二線用藥市場有限,Adcetris在上市以后進行了多項一線用藥的三期臨床,有望在不久將來迅速擴大市場占有率。因為首先開發(fā)孤兒藥,臨床試驗的成本相對較低,而成功帶來的回報足以投資以后的擴展實驗。最后,Adcetris的開發(fā)也是個體化治療的典范,西雅圖遺傳和Ventana醫(yī)療器械公司合作開發(fā)CD30配搭診斷試劑盒,用于篩選合格的臨床實驗對象。第三個或許是目前最重要的一個獲得美國FDA批準的ADC新藥是羅氏的Kadcyla(15,通用名:adotrastuzumabemtansine,T-DM1)。今年2月22日FDA通過快速審查通道批準了Kadcyla,用于治療HER-2陽性,對曲妥珠單抗和紫杉醇有抗藥性的晚期或轉移性乳腺癌患者。ImmunoGen的TAP技術是到目前為止臨床上最認可的抗體藥物偶聯(lián)物技術之一,Kadcyla也是唯一一個FDA批準上市的,用于治療固體腫瘤的ADC。這是美國FDA繼曲妥珠單抗(1998年)、拉帕替尼(2007年)和帕妥珠單抗(2012年)以后批準治療HER2陽性乳腺癌的又一藥物。Kadcyla也和Adcetris一樣采用從孤兒藥著手而后擴大適應證的策略。研究結果證實,Kadcyla在一個二期臨床試驗中顯示作為一線用藥能顯著延長HER2陽性乳腺癌患者無進展生存期。Kadcyla治療組無進展生存期的中位數(shù)是14.2個月,和曲妥珠/多西他賽對照組的9.2個月相比延長了5個月,具有統(tǒng)計學顯著。除此之外,Kadcyla的耐受性似乎更好,三級以上不良反應的發(fā)生率為46.4%,顯著低于標準組的90.9%。另外,EMILIA三期臨床所證實Kadcyla的藥理學特征也值得重視。腫瘤病理切片以及之前動物模型實驗中的數(shù)據(jù)顯示,對曲妥珠單抗治療產(chǎn)生抵抗性的患者人群中HER2受體數(shù)量和功能均未受到損傷性影響。內臟轉移灶腫瘤的消退指明,釋放的細胞毒素DM1在細胞內的聚集濃度足以導致細胞因有絲分裂障礙而死亡,并且沒有出現(xiàn)曲妥珠單抗單藥治療時經(jīng)常發(fā)生的腫瘤生長遲緩(cytostasis)。這樣,Kadcyla的實驗結果和最初的設計目標完全一致,既保留了曲妥珠單抗的作用又增加了潛在的細胞毒素藥物的效應。Kadcyla的成功至少在兩方面表現(xiàn)重要意義:(1)Mylotarg和Adcetris都是靶向血液腫瘤細胞表面抗原(CD33和CD30),到目前為止顯示明顯療效的臨床實驗也局限于血液腫瘤。而Kadcyla是靶向固體腫瘤細胞。理論上講,固體腫瘤組織更復雜,給ADC藥物的滲透造成更多困難;(2)Kadcyla的接頭是由穩(wěn)定的硫醚鍵連接,被腫瘤細胞吞噬后釋放了仍然帶有接頭片段但具有同等活性的美登素細胞毒素,同時也表明這類ADC藥物在細胞外沒有釋放細胞毒素。Kadcyla明顯的臨床療效證明,細胞內或細胞表面裂解接頭不是ADC藥物設計的必要條件。以上數(shù)據(jù)表明,Adcetris和Kadcyla的研發(fā)過程和結果都堪稱完美,一方面對ADC類新藥的開發(fā)起著重要的推動作用,另一方面對這個領域的新入門廠家也是顯然的商業(yè)壓力。除了這兩個成功推出的ADC新藥以外,至少有30個其他ADC藥物已經(jīng)處于不同的臨床階段,是進入抗體藥物偶聯(lián)物研發(fā)領域的市場挑戰(zhàn)。3.2抗藥物偶聯(lián)和小分子新藥研發(fā)相比,技術上開發(fā)抗體藥物偶聯(lián)物的門檻要高得多。除了以上所述ADC藥物的設計經(jīng)驗和技術,也要牽扯到批量單抗的生產(chǎn)和純化,以及和小分子偶聯(lián)的均一性和可控性。目前這個領域的領頭羊都擁有獨具特色的ADC技術平臺,比如西雅圖遺傳制藥公司的vc-MMAE平臺、Immun