哌替啶和氯胺酮的測定

FA2YIXUEPAGEIIPAGEII發(fā)布中華人民共和國司法部司法鑒定管理局司法鑒定技術(shù)規(guī)范2016-9-22實施2016發(fā)布中華人民共和國司法部司法鑒定管理局司法鑒定技術(shù)規(guī)范2016-2016-生物檢材中苯丙胺類興奮劑、哌替啶和氯胺酮的測定

SF/ZJD0107004——2016SF/ZJD0107004-2016目次前言 I1范圍 12規(guī)范性引用文件 13免疫篩選法原理 14免疫篩選法試劑 15免疫篩選法操作方法 16免疫篩選法結(jié)果判定 17氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法原理 28氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法試劑和材料 29氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法儀器 210氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定步驟 311氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)果計算 512氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法方法檢出限 513液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法原理 514液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法試劑和材料 515液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器 616液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定步驟 617液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)果計算 818液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法方法檢出限 8附錄A（資料性附錄）血液、尿液和毛發(fā)中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的檢出限 9PAGEI前言本技術(shù)規(guī)范按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本技術(shù)規(guī)范的附錄A為資料性附錄。本技術(shù)規(guī)范由司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所提出。本技術(shù)規(guī)范由司法部司法鑒定管理局歸口。本技術(shù)規(guī)范起草單位：司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所。本技術(shù)規(guī)范主要起草人：劉偉、卓先義、向平、沈保華、卜俊、馬棟、嚴慧。本技術(shù)規(guī)范所代替規(guī)范的歷次版本發(fā)布情況為：SF/ZJD0107004-2010。PAGE1生物檢材中苯丙胺類興奮劑、哌替啶和氯胺酮的測定范圍本技術(shù)規(guī)范規(guī)定了血液、尿液及毛發(fā)中苯丙胺（AMP）、甲基苯丙胺（MAMP）、3、4-亞甲雙氧甲基苯丙胺（MDMA）、4、5-亞甲雙氧苯丙胺（MDA）、哌替啶和氯胺酮的測定方法。本技術(shù)規(guī)范適用于血液、尿液及毛發(fā)中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶和氯胺酮的定性定量分析。規(guī)范性引用文件下列文件對于本技術(shù)規(guī)范的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本技術(shù)規(guī)范。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本技術(shù)規(guī)范。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GA/T122毒物分析名詞術(shù)語第一篇免疫篩選法原理采用高度特異性的抗原-抗體反應(yīng)的免疫膠體金層析技術(shù)，通過單克隆抗體競爭結(jié)合苯丙胺或甲基苯丙胺偶聯(lián)物和尿液中可能含有的苯丙胺或甲基苯丙胺，試劑盒含有被事先固定于膜上測試區(qū)（T）的苯丙胺或甲基苯丙胺偶聯(lián)物和被膠體金標記的抗苯丙胺或甲基苯丙胺單克隆抗體。試劑苯丙胺尿液膠體金法試劑盒，甲基苯丙胺尿液膠體金法試劑盒。操作方法用吸管吸取尿液檢材，滴入試劑盒的樣品孔中5滴（約150～200L），3～5分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果判定苯丙胺尿液膠體金法試劑盒陽性僅質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)紫紅色帶，而測試區(qū)T無紫紅色帶，提示含有苯丙胺成分。陰性質(zhì)控區(qū)C及測試區(qū)T均出現(xiàn)紫紅色帶，表明尿液中無苯丙胺或苯丙胺濃度在1000ng/mL以下。無效質(zhì)控區(qū)C未出現(xiàn)紫紅色帶，結(jié)果無效，應(yīng)重新檢驗。甲基苯丙胺尿液膠體金法試劑盒陽性僅質(zhì)控區(qū)C出現(xiàn)紫紅色帶，而測試區(qū)T無紫紅色帶，表明甲基苯丙胺濃度在1000ng/mL以上。陰性質(zhì)控區(qū)C及測試區(qū)T均出現(xiàn)紫紅色帶，表明尿液中無甲基苯丙胺或甲基苯丙胺濃度在1000ng/mL以下。無效質(zhì)控區(qū)C未出現(xiàn)紫紅色帶，結(jié)果無效，應(yīng)重新檢驗。第二篇氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法原理利用苯丙胺類興奮劑、哌替啶和氯胺酮易溶于有機溶劑、難溶于水的特點，在堿性條件下用有機溶劑從生物檢材中提出，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測，經(jīng)與平行操作的苯丙胺類興奮劑或哌替啶、氯胺酮對照品比較，以保留時間和特征碎片離子定性分析；以定量離子峰面積為依據(jù)，外標法定量。試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶和氯胺酮純度≥98%。AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶、氯胺酮對照品溶液的制備分別精密稱取對照品AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶、氯胺酮各適量，用甲醇配成1mg/mL的對照品儲備溶液，置于冰箱中冷凍保存，有效期為12個月。試驗中所用其它濃度的標準溶液均從上述儲備液稀釋而得，冰箱中冷藏保存，有效期為6個月。10%氫氧化鈉溶液乙醚甲醇丙酮0.1%十二烷基磺酸鈉溶液0.1%洗潔精溶液0.1mol/L鹽酸溶液儀器氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有電子轟擊源（EI）。分析天平感量0.1mg。微波爐渦旋混合器離心機恒溫水浴鍋空氣泵移液器具塞離心試管冷凍研磨機測定步驟樣品預(yù)處理尿液直接提取取尿液2mL置于10mL具塞離心管中，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH11，用乙醚3mL提取，渦旋混合、離心，轉(zhuǎn)移有機層至另一離心管中，約60C水浴中揮干，殘留物用50L甲醇溶解，取血液直接提取取血液2mL置于10mL具塞離心管中，加入10%氫氧化鈉溶液0.2mL，用乙醚3mL提取，以下同10.1.1項下操作。毛發(fā)提取10.1.3.1毛發(fā)采集貼發(fā)根處剪取毛發(fā)，發(fā)根處作標記。量取長度。10.1.3.2毛發(fā)洗滌毛發(fā)樣品依次用0.1%十二烷基磺酸鈉溶液、0.1%洗潔精溶液、水和丙酮振蕩洗滌，晾干后剪成約1mm段，供檢。10.1.3.3毛發(fā)的水解10.1.3.3.1毛發(fā)的酸水解稱取50mg毛發(fā)，加1mL0.1mol/L鹽酸溶液浸潤，45C水浴水解12～15小時，取出后用10%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH10.1.3.3.2毛發(fā)的堿水解稱取50mg毛發(fā)，加1mL10%氫氧化鈉溶液，80C水浴水解5～10.1.3.4毛發(fā)的提取毛發(fā)水解液用乙醚3mL提取，渦旋混合、離心分層，轉(zhuǎn)移乙醚層至另一離心管中，約60C水浴中揮干。殘留物用50L樣品測定氣相色譜-質(zhì)譜參考條件a）色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30m′0.25mm′0.25b）柱溫：100C保持1.5min，以25C／min程序升溫至c）載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速：1.0mL/min；d）進樣口溫度：250°C；

e）進樣量：1Lf）電子轟擊源：70eV；g）四極桿溫度：150°Ch）離子源溫度：230°Ci）接口溫度：280°Cj）檢測方式：全掃描；k）質(zhì)量范圍50-500amu。l）AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的保留時間與特征碎片離子見表1。表1AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的色譜峰保留時間與特征碎片離子名稱GC/MS保留時間（min）碎片離子（m/z）AMP4.344、911)、120MAMP4.758、911)、134MDA6.677、1361)、179MDMA7.058、1351)、194哌替啶8.071、172、2471)氯胺酮8.41801)、209、152注：1）為定量離子。定性分析進行樣品測定時，如果檢出的色譜峰保留時間與空白檢材添加相應(yīng)對照品的色譜峰保留時間比較，相對誤差在2%內(nèi)，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，且所選擇的離子相對豐度比與添加對照品的離子相對豐度比之相對誤差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在這種化合物。表2相對離子豐度比的最大允許相對誤差(%)相對離子豐度比≥502050102010允許的相對誤差20253050定量測定采用外標-校準曲線法或單點法定量。用相同基質(zhì)空白添加適量目標物對照品制得一系列濃度校準樣品，以目標物的峰面積對目標物濃度繪制校準曲線，并且保證待測樣品中目標物的濃度在其線性范圍內(nèi)。當待測樣品中目標物濃度在添加樣品濃度的50%以內(nèi)時，可采用單點校準。平行試驗待測樣品應(yīng)按以上步驟同時平行測定兩份。平行試驗中兩份檢材測定結(jié)果按兩份檢材的平均值計算，雙樣相對相差不得超過20％（腐敗檢材不超過30%）。雙樣相對相差按式（1）計算：|C1-C2|雙樣相對相差（%）=100…………（1）C式中：C1、C2兩份樣品平行定量測定的結(jié)果；C兩份樣品平行定量測定結(jié)果的平均值（C1+C2）/2?？瞻自囼灣韵嗤|(zhì)空白替代檢材外，均按上述步驟進行。結(jié)果計算以外標-校準曲線法或按式（2）計算被測樣品中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮濃度：A1WC=………（2）A2W1式中：C待測樣品中目標物的濃度（g/mL或g/g）；A1待測樣品中目標物的峰面積；A2添加樣品中目標物的峰面積；W添加樣品中目標物的添加量（g）；W1待測樣品取樣量（mL或g）。方法檢出限血液、尿液和毛發(fā)中苯丙胺類興奮劑、哌替啶和氯胺酮的檢出限見附錄A。第三篇液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法原理利用苯丙胺類興奮劑、哌替啶和氯胺酮易溶于有機溶劑、難溶于水的特點，在堿性條件下用有機溶劑從生物檢材中提出，提取后的樣品用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行檢測，經(jīng)與平行操作的苯丙胺類興奮劑或哌替啶、氯胺酮對照品比較，以保留時間和兩對母離子/子離子對進行定性分析；以定量離子對峰面積為依據(jù)，外標法定量。試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮對照品及溶液的制備同8.1及8.2。丙酮乙醚10%氫氧化鈉溶液0.1mol/L鹽酸溶液0.1%十二烷基磺酸鈉溶液0.1%洗潔精溶液乙腈色譜純。甲酸優(yōu)級純。乙酸銨色譜純。流動相緩沖液20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液：分別稱取1.54g乙酸銨和1.84g甲酸置于1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，pH值約為4。儀器液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源（ESI）。分析天平感量0.1mg。渦旋混合器離心機恒溫水浴鍋移液器具塞離心試管冷凍研磨機測定步驟樣品預(yù)處理尿液提取取尿液2mL置于10mL具塞離心管中，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH11，用乙醚3mL提取，渦旋混合、離心，轉(zhuǎn)移有機層至另一離心管中，約60C水浴中揮干，殘留物中加入100L乙腈:流動相緩沖液（70:30）進行溶解，取血液提取取血液2mL置于10mL具塞離心管中，加入10%氫氧化鈉溶液0.2mL，用乙醚3mL提取，以下同16毛發(fā)提取稱取50mg毛發(fā)，同10.1.3.3項酸水解或堿水解后，用乙醚3mL提取，以下同16.1.1項下操作。樣品測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參考條件a）色譜柱：AllurePFPPropyl100mm2.1mm5mb）柱溫：室溫；c）流動相：V（乙腈）：V（緩沖液）=（70：30）；d）流速：200L/min；

e）進樣量：5Lf）掃描方式：正離子掃描（ESI+）；g）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；h）離子噴霧電壓：5500V；i）離子源溫度：500Cj）每個化合物分別選擇2對母離子/子離子對作為定性離子對。其定性離子對、定量離子對、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）和保留時間（tR）見表3。表3AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的定性離子對、定量離子對、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)和保留時間（tR）名稱定性離子對DP(V)CE(eV)保留時間(min)AMP136.1/119.11)20335.12136.1/91.126MAMP150.1/119.11)30166.07150.1/91.126MDMA194.2/163.41)35185.93194.2/105.029MDA180.1/163.11)40155.01180.1/135.128哌替啶248.3/220.350308.49248.3/174.130氯胺酮238.1/179.11)40255.3238.1/125.140注：1）為定量離子對。定性測定進行樣品測定時，如果檢出的色譜峰保留時間與空白檢材添加對照品的色譜峰保留時間比較，相對誤差小于2%，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，均出現(xiàn)所選擇的離子對，而且所選擇的離子對相對豐度比與添加對照品的離子對相對豐度比之相對誤差不超過表4規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在這種化合物。表4相對離子對豐度比的最大允許相對誤差(%)相對離子對豐度比≥502050102010允許的相對誤差20253050定量測定采用外標-校準曲線法或單點法定量。用相同基質(zhì)空白添加適量目標物對照品制得一系列校準樣品，以目標物的峰面積對目標物濃度繪制校準曲線，并且保證所測樣品中目標物的響應(yīng)值在其線性范圍內(nèi)。當待測樣品中目標物濃度在添加樣品濃度的50%以內(nèi)時，可采用單點校準。平行試驗待測樣品應(yīng)按以上步驟同時平行測定兩份。平行試驗中兩份檢材測定結(jié)果按兩份檢材的平均值計算，雙樣相對相差不得超過20％（腐敗檢材不超過30%）。雙樣相對相差按式（1）計算：|C1-C2|雙樣相對相差（%）=100……………（1）C式中：C1、C2兩份樣品平行定量測定的結(jié)果；C兩份樣品平行定量測定結(jié)果的平均值（C1+