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文檔簡介

PCR擴增目的DNA片段聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）是1985年由KaryMullis發(fā)明的。

DNA的復制(replication)

——

由親代DNA合成兩個相同的子代DNA的過程。

復制親代DNA子代DNA

一、PCR的基本原理變性退火延伸72℃Taq聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶，由于發(fā)現(xiàn)于水生棲熱菌（Thermusaquaticus）內，故命名為Taq聚合酶（Taqpolymerase），也稱為TaqDNA聚合酶，簡稱Taq酶或Taq。DNA模板95℃（解鏈）60℃（退火）與引物結合72℃（延伸）DNA單鏈引物Taq酶，dNTPs,Mg2+模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段

的酶促合成反應。二、操作步驟：（以3－磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的擴增為例,目標片段815bp）1、PCR體系ReagentsVolume(ul)ddH2O（DEPC）2.5PCRBuffer2.5Mg2+2.5dNTPs 2.5GAPDHprimerF2.5GAPDHprimerR2.5Taqpolymerase2.5cDNAtemplate2.5Totalvolume20瞬時離心后2、反應條件：預熱：95℃3min；

解鏈：95℃30s；

退火：60℃30s；28個循環(huán)

延伸：72℃45s；

再延伸：72℃5min；

保存：12℃99min3、準備1%瓊脂糖凝膠4、加樣：延伸完畢后即可取出樣品，取8ulPCR產物加入2ul6×loadingbuffer于新的一支0.5ml的Ep管中，瞬時離心后，加入10ul樣品到瓊脂糖凝膠中。（ps:剩余PCR產物保留至下一酶切實驗用）MS5、電泳：

120V,電泳20min6、染色：

EB染3min，自來水清洗一次7、觀察：凝膠成像系統(tǒng)照相

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