【響應(yīng)面法優(yōu)化益胃湯多糖類成分提取工藝的研究10000字（論文）】

響應(yīng)面法優(yōu)化益胃湯多糖類成分提取工藝的研究目錄TOC\o"1-3"\h\u30111一、引言 13971（一）益胃湯的簡(jiǎn)介 117294（二）中藥多糖的研究進(jìn)展 2152881.中藥多糖的提取分離 225732.中藥多糖的結(jié)構(gòu)研究 4244473.中藥多糖的生理活性 412034（三）益胃湯多糖的研究 4239061.地黃中多糖的研究 556932.玉竹多糖的研究 540093.北沙參多糖的研究 5101384.麥冬多糖的研究 617047（四）響應(yīng)面分析法的研究進(jìn)展 615071二、材料、試劑與儀器 624895（一）主要材料與試劑 616301（二）主要儀器 629225三、實(shí)驗(yàn)方法 627153（一）益胃湯多糖的提取 710803（二）多糖含量的測(cè)定 712398（三）益胃湯多糖提取單因素試驗(yàn) 820294（四）益胃湯多糖提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 93540（五）益胃湯多糖提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證 912756（六）數(shù)據(jù)處理 921512四、結(jié)果與討論 931555（一）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 929377（二）單因素試驗(yàn)結(jié)果與討論 1016555（三）響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與討論 131517（四）最佳工藝參數(shù)的調(diào)整及驗(yàn)證 171175（五）益胃湯多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果與討論 1719192五、結(jié)論 1826531參考文獻(xiàn)： 19【摘要】目的：用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，找到益胃湯多糖的最佳提取工藝。方法：通過單因素和Box-Behnken設(shè)計(jì)，對(duì)究浸泡時(shí)間，煎煮時(shí)間，過濾方式，粒徑大小等因素對(duì)益胃湯多糖提取率的影響進(jìn)行研究，優(yōu)化提取工藝條件，總結(jié)最佳提取工藝。結(jié)果：益胃湯多糖最佳提取工藝條件為浸泡時(shí)間70min煎煮時(shí)間65min，過濾方式減壓抽濾，粒徑大小60目，多糖提取率為31.15%。結(jié)論：通過對(duì)益胃湯多糖提取工藝的研究，獲得最優(yōu)提取方法，該方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可操作性強(qiáng)，有利于益胃湯多糖的開發(fā)利用?！娟P(guān)鍵詞】益胃湯多糖響應(yīng)面試驗(yàn)提取一、引言（一）益胃湯的簡(jiǎn)介益胃湯，清《溫病條辨》，處方：地黃5錢（18.65g）麥冬5錢（18.65g）北沙參3錢（11.19g）玉竹1錢5分（5.60g）冰糖1錢（3.73g）[1]。益胃湯方劑中的地黃與麥冬為君藥，生津潤(rùn)燥，味性甘寒，治燥劑，有滋陰養(yǎng)胃的功效。北沙參和玉竹在其中起到輔助君藥加強(qiáng)療效的作用，可以增腎臟之氣。冰糖主要是為了調(diào)合其他藥的藥性，對(duì)于脾胃具有很好的調(diào)理作用，益胃湯，顧名思義具有養(yǎng)胃的功效。對(duì)于陽(yáng)明病和溫病都有一定的治療作用，下后汗出，胃陰損傷?；蛞娢缸茻[痛，饑不欲食，口干舌燥，大便秘結(jié)，或干嘔、呃逆。舌紅少津，脈細(xì)數(shù)者。臨床常用于治療慢性胃炎、糖尿病、小兒厭食癥等屬胃陰虧損者，以及熱病后胃陰未復(fù)，胃氣不和，饑不能食，口燥咽干者[2]。這種藥物在醫(yī)學(xué)上具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)的作用，對(duì)于慢性疲勞的大鼠的應(yīng)激狀態(tài)也有很好的改善作用，能夠讓人快速?gòu)钠跔顟B(tài)中恢復(fù)過來(lái)，所以才有中醫(yī)學(xué)中所說(shuō)的增腎臟之氣，滋陰養(yǎng)胃的功效[3]。地黃是一種常用的中藥。地黃屬于寒性藥物，味道偏甘，偏苦，對(duì)于心臟，肝臟以及腎臟類疾病都有一定的治療效果，能夠治療腎陰虛，所以不管是血虛還是腎虛的患者都可以食用，有補(bǔ)腎的效果[4]。帝皇在醫(yī)學(xué)上的藥物成分有黃酮類、糖類、木脂素類等等，地黃在西學(xué)上的藥理作用是治療人體血液系統(tǒng)，心腦血管系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)疾病，并且有一定的抗衰老作用，還能用于治療糖尿病以及胃潰瘍等疾病等，所以地黃在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍還是十分廣闊的[5]。麥冬是一種百合科的藥用植物[6]。麥冬在很早以前就被當(dāng)作藥物使用，味道偏甘，微苦，屬于寒性藥物，主要用于治療心臟，肺以及胃等器官的疾病，主要用于治療肺燥引起的咳嗽以及虛熱內(nèi)生引起的咳嗽。麥冬的化學(xué)成分主要有多糖類、甾體皂苷類、揮發(fā)油類等等，麥冬的藥理作用主要表現(xiàn)為治療心血管疾病，抗炎作用，降低血糖水平，抗衰老，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以及對(duì)腸道菌群的調(diào)控作用[7-8]。北沙參屬于傘形科的一種藥用植物，北沙參是一種較為常用的中藥，有補(bǔ)陰虛的作用，有養(yǎng)胃潤(rùn)肺的療效，對(duì)于肺燥引起的咳嗽、脾胃虛弱、咳血以及熱病等癥狀都有很好的治療作用。北沙參的化學(xué)成分包括香豆素類、酚酸類等等。北沙參在現(xiàn)代藥理研究中其具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抗腫瘤，抗氧化，抗炎，止咳祛痰等作用[9]。玉竹為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)植物玉竹［Polygonatumodoratum(Mill．)Druce］的干燥根莖[10]。玉竹味甘，性平，微寒，具有生津潤(rùn)肺、滋陰養(yǎng)胃、補(bǔ)腎之功效，對(duì)于干咳、口干咽干、多食善饑、陰虛發(fā)熱等病癥具有一定的療效，并且藥性溫和，并且不會(huì)有生濕、膩滯的副作用。玉竹的化學(xué)成分主要包括多糖類、甾體皂苷類、黃酮類等等。玉竹的藥理學(xué)作用包括降低血糖功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，緩解和解除疲勞功能，緩解延緩衰老功能，抗氧化功能等[11]。（二）中藥多糖的研究進(jìn)展多糖在動(dòng)物、植物、微生物以及藻類物質(zhì)等體內(nèi)廣泛分部存在。多糖是一種由多個(gè)糖苷鍵組合而成的化合物，并且該化合物至少包含十個(gè)單糖分子。當(dāng)前關(guān)于其的相關(guān)文獻(xiàn)都是在研究其藥理和結(jié)構(gòu)。1.中藥多糖的提取分離多糖的提取是研究課和開發(fā)利用多糖的第一步，植物多糖的提取包括溶劑通過細(xì)胞壁滲透，多糖溶解于溶劑中以及傳質(zhì)擴(kuò)散這三個(gè)過程。中藥復(fù)方組成復(fù)雜，有多種化學(xué)成分，多糖只是其中的一種。中藥復(fù)方多糖不同于單方多糖，包含多類生物活性，從而使藥理活性增強(qiáng)。中藥復(fù)方中含有多種化合物，可以利用其極性不同降多糖提取分離出來(lái)[12]。大多數(shù)多糖為極性化合物，易溶于水難溶于乙醇，可以根據(jù)溶液分子與極性基團(tuán)之間的親和性原理對(duì)多糖進(jìn)行提取。多糖提?。海?）水提法：是目前經(jīng)常應(yīng)用的提取方法，該方法簡(jiǎn)單易操作，不易破壞多糖的結(jié)構(gòu)，方法溫和且不易造成環(huán)境的污染。水提法包括水煎煮法和回流提取法。水煎煮法為傳統(tǒng)浸提法將水與藥材按比例煮沸，利用相似相溶原理多糖溶于水，但高溫可能會(huì)造成糖苷鍵破裂，從而影響多糖結(jié)構(gòu)?；亓魈崛》ň褪前讶軇┓诺嚼淠亓餮b置內(nèi)，使其回流到溶液中，通過多次提取使多糖溶解與溶劑中該方法溫度可控，操作可行性強(qiáng)。缺點(diǎn)是提取時(shí)間過長(zhǎng)造成多糖提取率降低以及多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。（2）酸堿浸提法：主要根據(jù)植物細(xì)胞以及細(xì)胞壁，在酸堿溶液中容易破裂的原理，讓植物細(xì)胞中的有效成分進(jìn)入溶液。根據(jù)多糖基團(tuán)的不同選取合適的酸液或堿液進(jìn)行提取，為盡可能避免多糖的糖苷鍵造到破壞應(yīng)選擇較低濃度的酸堿液。該方法簡(jiǎn)單，快速可提高游離糖的含量缺點(diǎn)是易造成糖苷鍵破壞。（3）超聲波輔助提取法：主要利用超聲波的空化效應(yīng)，熱效應(yīng)產(chǎn)生能形成減小與水相之間阻滯層的沖擊波，破壞植物的細(xì)胞組織使其破裂，從而使多糖溶解于溶劑中，提高多糖的溶解率。該方法優(yōu)點(diǎn)使可以減少高溫對(duì)多糖的影響，減少多糖結(jié)構(gòu)的破壞，提取效率高，縮短提取時(shí)間。缺點(diǎn)是可能會(huì)造成可溶性多糖的降解，使得多糖的生物活性大打折扣。（4）生物酶輔助提取法：在多種酶的作用下，植物細(xì)胞壁會(huì)被溶解，多糖溶解于溶劑中。該方法優(yōu)點(diǎn)是是不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)不激烈且有利于提高多糖的提取率，缺點(diǎn)是酶的價(jià)格昂貴，在大規(guī)模的提取生產(chǎn)工藝中不適用，且酶的反應(yīng)條件限制高，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，在實(shí)際操作中的可行性不好。中藥多糖的提取優(yōu)化工藝還存在許多問題，由于多糖的結(jié)構(gòu)多樣性與復(fù)雜性，提取得到的多糖可能為多種性質(zhì)相似的多糖從而導(dǎo)致提取工藝的穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性不夠好[13-14]。2.中藥多糖的結(jié)構(gòu)研究中藥多糖的結(jié)構(gòu)研究主要是對(duì)其分子量分布的研究以及對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的研究。中藥多糖是一種大分子結(jié)構(gòu)，其糖鏈的長(zhǎng)短不一致，一般在衡量其分子量時(shí)取平均值，中藥多糖主要測(cè)數(shù)均分子量和重均分子量?，F(xiàn)在在測(cè)定中藥多糖的分子量到時(shí)候一般采用凝膠滲透色譜法或高效凝膠滲透色譜法。多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為四級(jí)，用一、二、三、四來(lái)表述，中藥多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的測(cè)定采用多種手段，主要包括酸水解法，甲基化反應(yīng)后GC-MS解析，核磁分析，紅外光譜，生物質(zhì)譜等。目前對(duì)中藥多糖的結(jié)構(gòu)解析主要停留在一級(jí)結(jié)構(gòu)解析的層面，二、三、四級(jí)為高級(jí)結(jié)構(gòu)，目前研究較少，需結(jié)合新的解析方法或計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等等手段來(lái)進(jìn)行解析，進(jìn)而推動(dòng)對(duì)中藥多糖的深入研究，促進(jìn)中藥行業(yè)的發(fā)展[15]。3.中藥多糖的生理活性多糖結(jié)構(gòu)主要通過物理及化學(xué)分析方法進(jìn)行解析，任何結(jié)構(gòu)的多糖都具有藥理活性?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究顯示，中藥中多糖大多為活性多糖，中藥多糖具有提高機(jī)體免疫力，胰島素抵抗，延緩機(jī)體衰老，抗炎抗氧化，抗腫瘤，抗病毒，治療燙傷等作用。增強(qiáng)機(jī)體免疫活性：中藥多糖通過刺激淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫。據(jù)相關(guān)報(bào)道可以知道，槐根多糖具有提高機(jī)體免疫力的作用，對(duì)于鴨甲型肝炎病毒有一定的治療作用[16]。抗氧化活性：相關(guān)研究表明，黃芪多糖能夠有效阻斷NF-κB通路，從而減少活性氧的含量，有很強(qiáng)的抗氧化的作用。多糖有很好的去除ROS的作用，這或許是因?yàn)樗械膯翁翘窃及u基，能夠和羥基或超氧陰離子自由基作用生成水[17]。多糖具有抗炎的功能，主要是因?yàn)槠涑煞种泻姓{(diào)節(jié)炎性因子并且能夠抑制炎癥關(guān)鍵酶的活性。板藍(lán)根多糖能夠有效阻礙RAW264.7細(xì)胞生成炎性介質(zhì)，并且能有效阻斷炎癥通路從而起到抗炎作用[18]。中藥多糖將成為藥物學(xué)中的中藥組成部分，越來(lái)越多的中藥多糖在治療疾病過程中發(fā)揮著重要的作用。（三）益胃湯多糖的研究益胃湯中有地黃、麥冬、玉竹、北沙參四種藥材，這些藥材中含有多糖類，揮發(fā)油，苷類，香豆素類，酚酸類，生物堿，氨基酸，微量元素等，其中多糖為其主要成分含量較高。益胃湯多糖幾乎沒有研究，但其藥材北沙參、玉竹、地黃和麥冬均富含多糖，也有不少文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)簡(jiǎn)述于下。1.地黃中多糖的研究多糖類是地黃中的有效成分之一,并且中藥地黃中包含著7種地黃多糖，而對(duì)這些多糖的提取過程主要是：先經(jīng)水體醇沉，然后用sevage法去除地黃中的蛋白，最后通過色譜柱將所有成分進(jìn)行分離，之后就能得到較純的地黃多糖。地黃多糖有多種藥理作用，比如說(shuō)可以有效緩解患者在服用磺胺類藥物或者地塞米松類藥物所導(dǎo)致的免疫抵抗癥狀；能夠提升淋巴細(xì)胞IL-2的活性,從而起到保護(hù)腸內(nèi)組織粘膜的作用,還具有擴(kuò)張血管，減少毛細(xì)血管通透性的作用等等。顯著升高紅細(xì)胞生成素的水平，促進(jìn)人體造血作用；以及抗疲勞抗焦慮的作用?，F(xiàn)在醫(yī)學(xué)界普遍利用地黃多糖的免疫力提升作用以及抗腫瘤作用來(lái)治療貧血以及癌癥等疾病[19]。2.玉竹多糖的研究在玉竹多糖中，多糖的分子量分布從幾千到幾百不等，多糖中的單糖主要含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖三種單糖，并且這三種單糖的作用都是不同的。玉竹中主要可以分離到六種多糖。這些多糖具有多種藥理活性，如治療糖尿病等，并且還具有降低血糖的活性成分，有很強(qiáng)的藥用價(jià)值，藥性溫和，毒副作用弱。玉竹多糖可用作免疫調(diào)節(jié)劑或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，綠色無(wú)毒，是潛在的理想佐劑。據(jù)醫(yī)學(xué)界的研究結(jié)果顯示，玉竹多糖具有滋陰生津的作用，增加cGMP含量，降低T3、T4、cAMP/cGMP含量，調(diào)節(jié)和預(yù)防能量和糖脂代謝紊亂。甲亢?？梢?。甲狀腺功能亢進(jìn)癥的負(fù)缺乏作用。多糖多糖還具有一定的抗腫瘤、抗菌等潛力，可作為抗腫瘤等疾病的佐劑。多糖提取物A可抑制淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，抑制TNF-α的產(chǎn)生，減少和促進(jìn)黏膜愈合，有一定抗炎作用。目前，對(duì)多糖構(gòu)效關(guān)系的系統(tǒng)研究進(jìn)展不大，影響了今后的開發(fā)利用。隨著提取技術(shù)和分析檢測(cè)手段的進(jìn)步，玉竹多糖的研究、開發(fā)和應(yīng)用將進(jìn)一步深化[20]。3.北沙參多糖的研究目前，北沙參中多糖的研究主要集中在多糖提取方法、提取工藝優(yōu)化、單糖組成、藥理活性等方面。人參中的多糖具有清除自由基和抗氧化的重要作用，而人參中的粗多糖具有抗腫瘤、抗癌、增強(qiáng)免疫功能的重要作用。在北沙參多糖治療作用的臨床應(yīng)用和開發(fā)中，借助現(xiàn)代的科技手段使得北沙參多糖的研究進(jìn)入一個(gè)新高度，從而更加深入的挖掘與發(fā)揮北沙參多糖在臨床治療疾病等方面的潛力[21]。4.麥冬多糖的研究麥冬中的麥冬多糖主要由果糖和葡萄糖兩種單糖組成，麥冬多糖的藥理作用是能促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，降低空腹血糖、甘油三酯，改善胰島素抵抗，其作用機(jī)制與胰島素抵抗因子有關(guān)。麥冬多糖也在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。麥冬多糖還具有抗炎、抗哮喘和抗過敏作用。麥冬多糖能抑制胃酸和胃蛋白酶的活性，保護(hù)黏膜免受炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)麥冬多糖的多種生物活性，具有很高的醫(yī)用價(jià)值，在細(xì)胞分子水平具有更光明的前景，隨著對(duì)麥冬多糖的深入研究，還要加強(qiáng)麥冬多糖體內(nèi)代謝研究，使其發(fā)揮更好藥動(dòng)學(xué)作用[22]。（四）響應(yīng)面分析法的研究進(jìn)展劉軍海,黃寶旭,蔣德超在2009年利用響應(yīng)面法對(duì)艾葉多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取試驗(yàn)因素與水平,根據(jù)中心合(Box-Benhnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法,依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因素,艾葉多糖提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等高線。二、材料、試劑與儀器（一）主要材料與試劑玉竹購(gòu)自湖南邵東產(chǎn)地，北沙參購(gòu)自山東萊陽(yáng)產(chǎn)地，地黃河南溫縣產(chǎn)地，麥冬購(gòu)自四川江油產(chǎn)地，冰糖購(gòu)自本地超市，無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-200904，純度：100.0%）中國(guó)食品藥品檢定研究院，硫酸（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，苯酚重慶川東化工集團(tuán)有限公司。（二）主要儀器FA2004電子天平(上海良平儀器儀表公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；UV-6100型紫外分光光度計(jì)（上海元析公司）；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義予華儀器有限責(zé)任公司)；中草藥粉碎機(jī)等。三、實(shí)驗(yàn)方法（一）益胃湯多糖的提取按照益胃湯處方稱取地黃18.65g麥冬18.65g北沙參11.19g玉竹5.60g冰糖3.73g總計(jì)57.82g,，將藥材置于不銹鋼鍋中，加水800ml，大火煮開，保持微沸，過濾，渣加水400ml，大火煮開，保持微沸，過濾，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。取濃縮液1ml,加入9毫升無(wú)水乙醇，置于離心管中，以3000r/min速度離心20分鐘，取出棄去上清液，將沉淀水溶，于50ml容量瓶中定容，搖勻備用。（二）多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定益胃湯多糖的含量。1.對(duì)照品溶液的配制準(zhǔn)確稱取105度恒重干燥的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50mg，置于50ml容量瓶中，加水溶解，稀釋至指示線，搖勻。取上述溶液5ml，置于50ml容量瓶中，加水定容，得0.1mg/ml葡萄糖溶液。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取對(duì)照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml，置于10ml帶塞試管中，加水定容至終體積2.00ml，加苯酚溶液1.00ml（定量3g苯酚于小燒杯中，加水加熱溶解，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加水稀釋至刻度線，立即準(zhǔn)備使用）搖勻，迅速加入5.00ml濃硫酸。將酸充分搖勻，靜置5分鐘，在沸水浴中加熱15分鐘，取出，加入流水冷卻至室溫，精確取2.00ml水，作為試劑使用空白的。在490nm處測(cè)量吸光度值。3.精密度試驗(yàn)精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，按以下方法操作，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。4.重復(fù)性試驗(yàn)取適量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品6份，按以下配制6份0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按以下方法操作，測(cè)定吸光度。5.加樣回收率試驗(yàn)精密量取已知多糖含量的0.1mg/mL的益胃湯多糖樣品溶液6份，每份0.5mL，分別加入5、10、15、20、25和30μg的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)以下方法操作，測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算其回收率?；厥章?(試驗(yàn)測(cè)定值-樣品含糖量)/葡萄糖加入量x100%6、穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取益胃湯多糖樣品溶液1.0mL，按以下方法操作，分別在0、10、20、30、45、60和90min后測(cè)定吸光度。7、益胃湯多糖提取率的計(jì)算多糖含量與提取率的測(cè)定:采用苯酚一硫酸法,精密吸取樣品溶液1mL置于25mL容量瓶中,并加水稀釋定容。然后精密量取1mL，至于10mL容量瓶中,加蒸餾水補(bǔ)至2mL然后再加入5%的苯酚溶液1.0mL,搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL,搖勻后置40

C水浴中加熱15min,取出置冷水中冷卻10min,同時(shí)用20mL蒸餾水做空白,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)480nm處測(cè)定吸光度。多糖提取率用式：（三）益胃湯多糖提取單因素試驗(yàn)1、浸泡時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響稱取益胃湯處方藥材飲片，采用浸泡時(shí)間0min,30min,60min,120min,240min進(jìn)行煎煮，煎煮時(shí)間為60min,(一次40min，二次20min）減壓抽濾，然后使用苯酚-硫酸法測(cè)定其吸光度，計(jì)算多糖的提取率。2、煎煮時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響稱取益胃湯處方藥材飲片，采用煎煮時(shí)間為30、60、90、120、150min按照2.2.1煎煮方法進(jìn)行煎煮，煎煮前浸泡60min,減壓抽濾，然后使用苯酚-硫酸法測(cè)定其吸光度，計(jì)算多糖的提取率。3、過濾方式對(duì)多糖提取率的影響稱取益胃湯處方藥材飲片，采用浸泡時(shí)間60min,煎煮時(shí)間90min，按照2.2.1煎煮方法進(jìn)行煎煮，以減壓抽濾，濾紙自然過濾，脫脂棉濾過三種不同方式，然后使用苯酚-硫酸法測(cè)定其吸光度，計(jì)算多糖的提取率。4、粒徑大小對(duì)多糖提取率的影響分別稱取過10、20、4、60、80目篩的益胃湯處方藥材粉末各一份，采用浸泡時(shí)間60min,煎煮時(shí)間90min,減壓抽濾，然后使用苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖的提取率。（四）益胃湯多糖提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用單因素檢驗(yàn)確定自變量，以多糖提取率作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)響應(yīng)面。進(jìn)行了三步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。使用DesignExpert13軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2-1。表2-1響應(yīng)面分析法因素水平表Table1.Responsesurfaceanalysisfactorleveltable因素水平-101A浸泡時(shí)間/min3060120B煎煮時(shí)間/min6090120C粒徑大小/目406080（五）益胃湯多糖提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證根據(jù)反應(yīng)面試驗(yàn)得到的益胃湯多糖最佳提取工藝，進(jìn)行3個(gè)平行操作驗(yàn)證上述工藝參數(shù)，考察益胃湯多糖最佳提取工藝條件的穩(wěn)定性和適用性。（六）數(shù)據(jù)處理作圖用MicrosoftExcel2010軟件，SPSS20.01對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.01和0.05具有極顯著性差異和顯著性差異。四、結(jié)果與討論（一）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線如圖1所示。根據(jù)益胃湯多糖水溶液測(cè)得的吸光度值計(jì)算益胃湯多糖濃度。上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的得益胃湯多糖含量。圖1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1.Standardcurveofglucose.1、精密度試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果RSD=0.321%(n=6)，表明試驗(yàn)儀器精密度良好。2、重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果RSD=2.253%(n=6)，表明該試驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好3、加樣回收率試驗(yàn)測(cè)得加樣回收率平均值為99.1%，RSD=2.527%(n=6)，表明該試驗(yàn)方法可行。4、穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果RSD=1.318%(n=6)，表明樣品中的總糖含量在90min內(nèi)含量穩(wěn)定、無(wú)變化。（二）單因素試驗(yàn)結(jié)果與討論1、不同浸泡時(shí)間對(duì)益胃湯多糖提取率的影響由圖2可見，隨著浸泡時(shí)間增長(zhǎng)，益胃湯多糖的提取率先增大后降低，浸泡時(shí)間為60分鐘時(shí)提取的量最多，隨著浸泡時(shí)間的增加，提取量趨于下降，如果浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，可能對(duì)多糖的提取沒有幫助。由于時(shí)間的延長(zhǎng)，兩相溶質(zhì)的濃度差減小，多糖不再析出，如果同時(shí)繼續(xù)加熱，多糖就會(huì)水解氧化，從而降低多糖的提取率。圖2.浸泡時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2.Effectofsoakingtimeonextractionyieldofpolysaccharides2、不同煎煮時(shí)間對(duì)益胃湯多糖提取率的影響由圖3可知，當(dāng)煎煮時(shí)間為90min時(shí)益胃湯多糖的提取率最高，隨著煎煮時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，益胃湯多糖提取率下降，造成下降的原因可能是隨著長(zhǎng)時(shí)間的高溫煎煮，益胃湯多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞，多糖發(fā)生部分降解。圖3.煎煮時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3.Influenceofdecoctingtimeonextractionyieldofpolysaccharides3、不同過濾方式對(duì)益胃湯多糖提取率的影響由圖4可知，不同的過濾方式得到益胃湯多糖提取率相差不大，其中脫脂棉過濾效果最佳，但該方法會(huì)使多糖中存在的雜質(zhì)多且過濾方式不如減壓抽濾簡(jiǎn)單便捷因此后續(xù)采用減壓抽濾的方式。圖4.過濾方式對(duì)多糖提取率的影響Fig.4.Influenceoffiltrationmethodonextractionrateofpolysaccharide4、不同粒徑大小對(duì)益胃湯多糖提取率的影響由圖5可知當(dāng)藥材粉碎粒徑為60目時(shí)，益胃湯多糖的提取率最高，不同粒徑大小藥材對(duì)多糖的提取率影響不大。圖5.粉碎粒徑對(duì)多糖提取率的影響Fig.5.Influenceofpulverizedparticlesizeonextractionyieldofpolysaccharide（三）響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與討論在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)益胃湯多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。以單因素試驗(yàn)的結(jié)果確定了浸泡時(shí)間（A）、煎煮時(shí)間（B）、粒徑大?。–）3個(gè)影響因素的設(shè)計(jì)水平，以Design-Expert13進(jìn)行結(jié)果分析，以多糖提取率（Y）對(duì)A、B、C進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y＝30.16＋0.84A＋1.01B＋0.71C-0.35AB-0.43AC＋0.040BC-3.18A2-2.22B2-2.87C2。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析。表2-2.響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=3)Table2.Designandresultsofresponsesurfaceexperiment(n=3)A：浸泡時(shí)間/minB：煎煮時(shí)間/minC：粒徑大小/目提取率/%1-1-1022.66200030.23300031.35401-125.37511026.15610124.98700029.69800028.98901127.3710-10-122.38111-1025.44120-1124.681310-124.93140-1-122.841500030.5716-11024.7817-10124.14該模型和模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表2-3所示。試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚉r>F的值<0.01,十分顯著，即該模型用于評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)的可信度非常高。失擬項(xiàng)P=0.8252(P>0.05),不顯著，表明方差擬合度較好，誤差較小。表2-3.回歸模型方差分析結(jié)果Table3.Analysisofvarianceforresponsesurfaceofthequadraticpolynomialmodel方差來(lái)源平方和自由度均方FPr>FMode148.31916.4818.440.0004A-浸泡時(shí)間2.9312.933.280.1132B-煎煮時(shí)間3.5413.543.960.0870C-粒徑大小0.7510.750.840.3888AB2.7912.793.120.1208AC0.06110.0610.0680.8017BC2.6912.693.010.1264A274.61174.6183.49<0.0001B232.60132.6036.480.0005C24.4914.495.020.0600殘差6.2670.89失擬項(xiàng)1.1530.380.300.8252凈誤差5.1141.28總離差154.5716注：P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖，分析當(dāng)浸泡時(shí)間，煎煮時(shí)間，粒徑大小三個(gè)因素中的一個(gè)因素固定時(shí)，另外兩個(gè)因素的交互作用對(duì)益胃湯多糖提取率的影響。由方程得到的模型的響應(yīng)面和等高線圖如圖5-7所示?？梢钥闯觯绊懸蛩谺（煎煮時(shí)間）對(duì)提取率的影響最大，因?yàn)橐婢S糖多糖的三維曲線最為陡峭。其次是影響因素A（浸泡時(shí)間）和影響因素C（粒度）對(duì)益胃湯多糖提取率的影響最小。如圖5和圖6所示，隨著浸泡時(shí)間的增加，益胃湯多糖的得率先升高后降低，多糖的提取率呈拋物線趨勢(shì)。如圖5和圖7所示，益胃湯多糖的提取率隨煎煮時(shí)間的不同而不同，如果煎煮時(shí)間過長(zhǎng)，益胃湯多糖的提取率下降。煎煮時(shí)間過長(zhǎng)可能是因?yàn)槎嗵窃陂L(zhǎng)時(shí)間的高溫條件下，多糖的結(jié)構(gòu)造到破壞，多糖發(fā)生降解。如圖6和圖7所示，隨著浸泡時(shí)間和煎煮時(shí)間的增長(zhǎng)，益胃湯多糖的提取率先升高后降低，而益胃湯藥材粒徑大小對(duì)多糖的提取率影響不大。圖5.浸泡時(shí)間和煎煮時(shí)間對(duì)多糖提取率影響的3D響應(yīng)圖和等高線圖Fig.53Dresponseplotandcontourplotoftheeffectsofsoakingtimeanddecoctingtimeontheextractionrateofpolysaccharides圖6.浸泡時(shí)間和粒徑大小對(duì)多糖提取率影響的3D響應(yīng)圖和等高線圖Fig.63Dresponseplotandcontourplotoftheeffectsofsoakingtimeandparticlesizeontheextractionrateofpolysaccharides圖7.煎煮時(shí)間和粒徑大小對(duì)多糖提取率影響的3D響應(yīng)圖和等高線圖Fig.7.3Dresponseplotandcontourplotoftheeffectsofdecoctingtimeandparticlesizeontheextractionyieldofpolysaccharides（四）最佳工藝參數(shù)的調(diào)整及驗(yàn)證應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化出益胃湯最佳工藝條件即浸泡時(shí)間71.816min,煎煮時(shí)間63.534min,粒徑大小57.972，在此參數(shù)下益胃湯多糖的提取率為31.267%。結(jié)合實(shí)際情況以及實(shí)驗(yàn)操作的方便性，將優(yōu)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，調(diào)整后的參數(shù)為浸泡時(shí)間70min,煎煮時(shí)間65min,粒徑大小60目，重復(fù)3次的益胃湯多糖的提取率為31.20%，30.88%，31.37%。平均提取率為31.15%。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值基本吻合，表明模型對(duì)益胃湯多糖提取工藝優(yōu)化條件的可行性與準(zhǔn)確性。（五）益胃湯多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果與討論從益胃湯中提取多糖，煎煮條件不同，多糖的提取率不同，當(dāng)浸泡時(shí)間為60min時(shí)，提取率最高，隨著浸泡時(shí)間增長(zhǎng)，多糖結(jié)構(gòu)破壞以及部分雜質(zhì)溶出從而可能是造成提取率下降的原因。煎煮時(shí)間為90min時(shí)提取率最高，過濾方式對(duì)多糖提取率影響不大，藥材的粒徑減小可以提高多糖提取率。五、結(jié)論益胃湯多糖的常用提取方法是水煎煮法，而苯酚硫酸法可以用于測(cè)量多糖的剩余量，因而能夠計(jì)算出多糖提取率。在單因素試驗(yàn)考察不同浸泡時(shí)間，煎煮時(shí)間，過濾方式，藥材粒徑大小下益胃湯多糖提取率的基礎(chǔ)上，進(jìn)而進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以浸泡時(shí)間（A）、煎煮時(shí)間（B）、粒徑大小（C）3個(gè)影響因素的設(shè)計(jì)水平，得到益胃湯多糖最佳提取工藝條件為浸泡時(shí)間70min,煎煮時(shí)間65min,粒徑大小60目，多糖提取率為31.15%。

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