葡萄酒釀造過程中微生物的作用

葡萄酒釀造過程中微生物的作用

葡萄酒生產(chǎn)過程的本質(zhì)是葡萄酒的收集、葡萄糖的破碎和果汁、葡萄糖的同時(shí)、連續(xù)發(fā)酵和包裝，以及整個(gè)生產(chǎn)過程中各種微生物的代謝過程。葡萄汁發(fā)酵物及葡萄酒中的環(huán)境是低pH及高酒精濃度的,只有耐酸耐酒精的微生物可以生長(zhǎng)。在釀酒過程中最重要的菌株為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae及酒酒球菌Oenococcusoeni分別進(jìn)行酒精發(fā)酵及蘋果酸—乳酸發(fā)酵(malolacticfermentation,MLF),其他菌株在葡萄及葡萄酒中生長(zhǎng)的微生物對(duì)酒的品質(zhì)有顯著的影響。1葡萄酒的制備葡萄酒的釀造始于收集和破碎葡萄。白葡萄酒通過冷沉淀、澄清過濾或離心分離葡萄汁與葡萄皮,然后將葡萄汁移至木桶中。酒精發(fā)酵是由果汁中的自帶酵母或通過接種釀酒酵母發(fā)酵完成。將葡萄汁中主要的葡萄糖及果糖消耗后,酒被認(rèn)為是“干葡萄酒”,將酒液與酵母及葡萄的殘?jiān)蛛x。紅葡萄酒的生產(chǎn)與白葡萄酒的生產(chǎn)略有不同。葡萄經(jīng)破碎后葡萄皮浸泡在發(fā)酵液中提取顏色。紅葡萄酒通過自帶酵母或接種發(fā)酵劑進(jìn)行酒精發(fā)酵。在葡萄發(fā)酵中葡萄皮會(huì)漂浮到頂部形成一個(gè)“帽子”。為了更好地提取紅顏色和豐富葡萄酒風(fēng)味,釀酒師采取穿孔或從底部泵汁的辦法去除“帽子”的影響。一段時(shí)間后,葡萄酒與葡萄皮分離,葡萄汁在另一個(gè)容器中進(jìn)行發(fā)酵直至完成。酒精發(fā)酵完成后,根據(jù)葡萄酒的情況通過自帶或接種乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)自發(fā)或有目的進(jìn)行MLF,將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸。待發(fā)酵結(jié)束后要對(duì)葡萄酒中殘留的微生物進(jìn)行處理,防止酒的腐敗。2不同時(shí)期的微生物多樣性2.1克勒克酵母屬葡萄中一半的酵母來自葡萄園如尖頂型的無(wú)性生殖的酵母,漢森氏酵母屬Hanseniaspora和克勒克酵母屬Kloeckera。葡萄園中還存在一些對(duì)釀酒有作用的酵母擲孢酵母屬Sporobolomyces、克魯維酵母屬Kluyveromyces。2.2菌株組成及微生物代謝葡萄中的微生物的類型會(huì)影響隨后發(fā)酵過程中的生態(tài)環(huán)境尤其是在發(fā)酵初期的環(huán)境。漿果中微生物的數(shù)量水平大致在107CFU/g~108CFU/g,其中酵母的數(shù)量在105CFU/g~106CFU/g。漿果中的酵母種類有梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、假絲酵母屬Candida、隱球酵母屬Cryptococcus、紅酵母屬Rhodotorula、畢赤氏酵母屬Pichia、接合酵母屬Zygosaccharomyces、球擬酵母屬Torulopsis,占主導(dǎo)地位的是梅奇酵母屬及漢森酵母屬。破損的葡萄中漢森酵母屬Hanseniaspora、假絲酵母屬Candida、梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia數(shù)量顯著增加。釀酒酵母saccharomycescerevisiae在葡萄中很少見,數(shù)量少于10CFU/g~100CFU/g.同時(shí)發(fā)現(xiàn)有醋酸菌(葡糖桿菌屬、醋酸桿菌屬)、LAB在葡萄微生物群中占據(jù)一小部分。絲狀真菌聚集在葡萄的表面,可以侵染葡萄(葡萄孢屬Botrytis、鏈格孢屬Alternaria、單軸霉屬Plasmopara、曲霉屬Aspergillus);其中較常見的有短梗茁霉Aureobasidiumpullulans及灰霉菌Botrytiscinerea。生長(zhǎng)在葡萄上的霉菌產(chǎn)生多種代謝物如真菌毒素赭曲霉素A并且干擾葡萄的微生物生態(tài)環(huán)境并從而影響酒精發(fā)酵中酵母的生長(zhǎng),改變酒的風(fēng)味。葡萄孢屬會(huì)影響糖類、酒石酸、蘋果酸的代謝,減少總糖量,提高葡萄酒的pH。灰霉菌可造成灰霉病,其它的霉菌可以參與由其它微生物引發(fā)的感染,但自己不足以引起感染。此外,真菌在葡萄表面會(huì)創(chuàng)造一種利于醋酸菌生長(zhǎng)的環(huán)境,醋酸菌數(shù)量的增多易造成酒的腐敗。2.3葡萄汁和葡萄酒中的微生物2.3.1菌株間的發(fā)酵新鮮無(wú)破損的葡萄制成的葡萄汁中只有少量的細(xì)菌(<103CFU/mL~104CFU/mL),當(dāng)酵母啟動(dòng)酒精發(fā)酵后,細(xì)菌生長(zhǎng)停滯并逐漸死亡。根據(jù)葡萄汁及葡萄酒的酸度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、酒精濃度,其中生長(zhǎng)活躍的細(xì)菌通常包括LAB及醋酸菌。其他的細(xì)菌如梭狀芽胞桿菌clostridia、放線菌actinomyces、鏈霉菌屬streptomyces也存在于酒的環(huán)境中,但比較少見。被土壤污染的葡萄中存在梭狀芽胞桿菌,它產(chǎn)生的孢子對(duì)熱和化學(xué)處理有很強(qiáng)的抵抗力,因此處理被它污染的酒液比較棘手。鏈霉菌屬可降解纖維造成對(duì)過濾裝置的破壞。大多數(shù)與酒相關(guān)的細(xì)菌及很多酵母對(duì)SO2敏感。LAB是兼性厭氧菌,在厭氧的環(huán)境中可存活;參與釀酒的LAB主要來自4個(gè)屬(乳桿菌屬Lactobacillus、片球菌屬Pediococcus、明串珠菌屬Leuconostoc、酒球菌屬Oenococcus)。這些微生物普遍存在于葡萄及釀酒環(huán)境中。葡萄的破碎成數(shù)量級(jí)的增加了乳酸菌的數(shù)量;酒精發(fā)酵的第一周釀酒酵母產(chǎn)生的酒精減少LAB的數(shù)量,通常低于103CFU每mL;酒的pH強(qiáng)烈的影響LAB的存活,在發(fā)酵中及發(fā)酵后pH高于3.5對(duì)乳桿菌屬及片球菌屬的存活有利,當(dāng)pH低于3.5對(duì)酒球菌屬存活有利。新發(fā)酵的葡萄酒中LAB的數(shù)量較低,主要是由于pH、酒精、抑菌物質(zhì)如SO2等因素的影響。當(dāng)酒進(jìn)入貯藏階段,LAB對(duì)酒精的耐受力增加。LAB的數(shù)量又有所增長(zhǎng)。在一些葡萄酒中會(huì)發(fā)生MLF,它是一種重要的二次發(fā)酵,在酒精完全發(fā)酵后的兩到三周內(nèi)進(jìn)行。酒球菌O.oeni主導(dǎo)MLF通過將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸從而降低酒的酸度、產(chǎn)生其他代謝物增進(jìn)酒的風(fēng)味、消耗多余的養(yǎng)分提高酒中微生物的穩(wěn)定性,對(duì)葡萄酒的釀造具有重要的影響。醋酸菌是革蘭氏陰性需氧菌,可利用甘油和酒精產(chǎn)生醋酸、乙醛、乙酸乙酯。葡萄酒中的醋酸菌主要來自3個(gè)屬,醋桿菌屬Acetobacter、葡糖桿菌屬Gluconobacter、葡糖醋桿菌屬Gluconacetobacter。破碎的葡萄中含有相當(dāng)數(shù)量的葡糖桿菌屬,其產(chǎn)生的葡萄糖酸及其它含羰基化合物可以與SO2結(jié)合,降低亞硫酸鹽的抑制作用,導(dǎo)致葡萄汁的腐敗。一旦進(jìn)行葡萄汁發(fā)酵,厭氧環(huán)境有效抑制醋酸菌的生長(zhǎng)和新陳代謝。但有很多醋酸菌在厭氧發(fā)酵結(jié)束后仍存在,并未完全消除在發(fā)酵過程中。事實(shí)上,醋酸菌在木桶頂部存在空氣的環(huán)境中可存活,直到活躍發(fā)酵期木桶頂部被CO2充滿。發(fā)酵過程中泵送酒液到頂部有效減輕醋酸菌對(duì)葡萄酒的毒害作用。2.3.2酵母菌種的發(fā)酵葡萄汁及葡萄酒微生物中酵母占據(jù)主導(dǎo)地位。葡萄汁及葡萄酒中還包含大量的酵母如梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、酒香酵母屬Brettanomyces、畢赤氏酵母屬Pichia、假絲酵母屬Candida、漢森氏酵母屬Hanseniaspora、克魯維酵母屬Kluyveromyces、孢圓酵母屬Torulaspora、德巴利氏酵母屬Debaryomyces、接合酵母屬Zygosaccharomyce、裂殖酵母屬Schizosaccharomyces。其中的漢森氏酵母、假絲酵母、梅奇酵母啟動(dòng)酒精的發(fā)酵。畢赤氏酵母屬、伊薩酵母屬Issatchenkia、克魯維酵母屬在這一階段進(jìn)一步增長(zhǎng)。這些酵母的濃度會(huì)達(dá)到106CFU/mL~107CFU/mL。這些酵母在發(fā)酵中期逐漸減少。釀酒酵母對(duì)其代謝產(chǎn)物尤其是酒精的高耐受力使它成為發(fā)酵中期及后期的優(yōu)勢(shì)菌種,濃度達(dá)到107CFU/mL~108CFU/mL。漢森氏酵母屬、假絲酵母屬、梅奇酵母屬、伊薩酵母屬、克魯維酵母屬對(duì)濃度超過5%~7%的酒精沒有耐受力,在發(fā)酵中期逐漸減少。這些菌株在低溫時(shí)對(duì)酒精的敏感度降低,當(dāng)溫度低于15℃~20℃,假絲酵母及漢森氏酵母發(fā)酵一部分酒精。與釀酒酵母一樣在發(fā)酵后期成為優(yōu)勢(shì)菌株。2.4葡萄汁和葡萄酒中微生物多樣性的影響因素2.4.1釀酒酵母大量繁殖的影響因素很多環(huán)境因素影響葡萄酒中的微生物菌群。其中pH的影響最大,低pH(<3.5)抑制很多細(xì)菌,尤其是乳酸菌不能生長(zhǎng)。在葡萄酒正常pH范圍內(nèi)(2.8~4.2)酵母的生長(zhǎng)不受影響。溫度是另一個(gè)重要的因素,低溫抑制細(xì)菌、釀酒酵母的生長(zhǎng),當(dāng)溫度低于12℃釀酒酵母的初發(fā)酵被抑制。長(zhǎng)期低溫并添加適量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于葡萄汁中野生微生物的生長(zhǎng)。在釀酒酵母大量繁殖之前,醋酸菌、霉菌為需氧菌,有氧氣的環(huán)境易導(dǎo)致腐敗發(fā)生。釀酒酵母對(duì)氧氣的競(jìng)爭(zhēng)能力很強(qiáng),當(dāng)釀酒酵母開始大量繁殖時(shí)需適當(dāng)通風(fēng)促進(jìn)釀酒酵母的繁殖。LAB是兼性厭氧菌,氧氣促進(jìn)釀酒酵母生長(zhǎng)的同時(shí)也對(duì)兼性厭氧的LAB的生長(zhǎng)有刺激作用。2.4.2發(fā)酵溫度對(duì)微生物的影響釀酒中的操作對(duì)葡萄酒中的微生物菌群都會(huì)產(chǎn)生影響,如SO2的使用,冷浸、發(fā)酵溫度、通風(fēng)、添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、接種釀酒酵母。衛(wèi)生狀況如設(shè)備清潔的頻率。其他操作如浸皮、帽處理、浸泡時(shí)間都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng);漿果中的微生物像膜一樣附著在漿果表面難以去除,但營(yíng)養(yǎng)豐富的葡萄汁環(huán)境類似于發(fā)酵培養(yǎng)基,由分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞會(huì)釋放到發(fā)酵物中。因此,果皮接觸葡萄汁時(shí)間的長(zhǎng)短影響后代細(xì)胞的釋放,從而影響葡萄汁中微生物的種類;帽處理中泵數(shù)量及種類的選取也會(huì)影響葡萄汁中微生物的種類。酒精發(fā)酵過程對(duì)酒液表面微生物的抑制作用取決于厭氧條件下木桶上方CO2層的形成。如果要豐富葡萄酒中微生物區(qū)系,就推遲釀酒酵母的接種,為其他微生物的生長(zhǎng)及終產(chǎn)物的產(chǎn)生提供充足的時(shí)間。提前添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)促進(jìn)非釀酒酵母的繁殖。2.4.3酒精發(fā)酵對(duì)酵母菌株的影響葡萄酒中微生物的相互作用包括競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)成分和通過代謝產(chǎn)生最終產(chǎn)物抑制其他菌種生長(zhǎng)的物質(zhì)。酵母的代謝產(chǎn)物如酒精可以抑制大多數(shù)的細(xì)菌、霉菌及一些酵母。當(dāng)酒精濃度大于7%,非釀酒酵母的生長(zhǎng)受到抑制。一些釀酒酵母會(huì)產(chǎn)生抑制肽抑制其他酵母菌株。釀酒在缺氧的環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)氧氣的能力更強(qiáng),非釀酒酵母對(duì)于缺氧的環(huán)境缺乏耐受力,移除多余的氧氣使非釀酒酵母更早地死亡。非釀酒酵母在發(fā)酵初期可以利用氨基酸及維他命來生長(zhǎng),從而限制了釀酒酵母的生長(zhǎng)。在發(fā)酵的中后期,死亡及自身溶解的非釀酒酵母的細(xì)胞可成為釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)源。細(xì)菌同樣可以產(chǎn)生細(xì)菌素抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。酒精發(fā)酵結(jié)束后,自溶的酵母為隨后引發(fā)MLF的酒酒球菌提供了營(yíng)養(yǎng),刺激了酒酒球菌的生長(zhǎng)。在活躍發(fā)酵期,霉菌幾乎不存在。但霉菌產(chǎn)生的霉菌毒素會(huì)殘留在漿果表面抑制葡萄汁及葡萄酒中的微生物。葡萄鉤絲殼菌Uncinulanecator污染葡萄產(chǎn)生的蘑菇味在酒精發(fā)酵中可消除;酵母細(xì)胞壁中尤其是β-葡聚糖對(duì)霉菌毒素有吸附的作用。3生長(zhǎng)代謝及腐敗微生物已經(jīng)裝瓶的葡萄酒中要防止瓶中微生物的生長(zhǎng)代謝從而防止葡萄酒變渾濁、失去風(fēng)味。腐敗微生物包括細(xì)菌、酵母、霉菌;細(xì)菌包括乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌、鏈霉菌。3.1幾種菌種對(duì)葡萄酒中糖的等氨基酸的影響LAB(短乳桿菌Lactobacillusbrevis、腸系膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides)會(huì)降解賴氨酸造成酒液顏色變深,利用組氨酸等氨基酸產(chǎn)生組胺使部分消費(fèi)者產(chǎn)生頭痛;幾種菌共同發(fā)酵葡萄酒中的糖,產(chǎn)生乳酸、CO2、醋酸、甘油等,使酒具有酸白菜和酸牛奶味,破壞酒的品質(zhì)。醋桿菌屬侵染葡萄酒后會(huì)在酒液與空氣接觸的表面形成一層淡灰色的薄膜,最初是透明的,以后變暗,有時(shí)形成帶褶皺的玫瑰色薄膜,然后薄膜部分脫落沉人酒液中造成酒體渾濁,發(fā)出不良醋酸氣味,使酒液的揮發(fā)酸含量增高。苦味芽孢桿菌侵染葡萄酒使之變苦,多發(fā)生在紅葡萄酒和老酒中。受侵染的葡萄酒中還原糖、酒石酸鹽類和甘油含量都減少,總酸、揮發(fā)酸含量增加。3.2蘑菇腐敗來自腐敗的軟木塞中的霉菌,會(huì)引起酒的渾濁;代謝產(chǎn)生的2,4,6-三氯苯甲醚使酒液中出現(xiàn)的霉塞味。3.3釀酒酵母的處理接合酵母對(duì)糖有很高的耐受力會(huì)產(chǎn)生CO2造成酒的渾濁。畢赤氏酵母也造成酒的渾濁。假絲酵母在酒表面形成一層灰白色或暗黃色的,隨時(shí)間增厚,