第3章 基因工程（答案版） 【清單挖空】 高考生物 核心知識(shí)必背

第3章基因工程1.基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃贒NA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫做DNA重組技術(shù)。2.基因工程的誕生（三個(gè)理論和三個(gè)技術(shù)）：基因工程是在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，正是這些學(xué)科的基礎(chǔ)理論和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程，具體有三大理論發(fā)現(xiàn)和三個(gè)技術(shù)突破。理論基礎(chǔ)：①DNA是遺傳物質(zhì)；②DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制；③遺傳密碼的通用性和遺傳信息傳遞的方式；技術(shù)基礎(chǔ)：①限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割；②DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接；③基因工程載體的構(gòu)建與應(yīng)用3.理論上的三大發(fā)現(xiàn)⑴發(fā)現(xiàn)了遺傳物質(zhì)——DNA1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)⑵揭示了遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制：DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型、半保留復(fù)制圖，獲1958年諾貝爾獎(jiǎng)。⑶確立了遺傳信息的傳遞方式：以密碼形式傳遞1963年，美國(guó)尼倫伯格（M.W.Nirenberg）和馬太（H.Matthaei）確立了遺傳信息以密碼形式傳遞，破譯了編碼氨基酸的遺傳密碼(3個(gè)核苷酸=1個(gè)密碼子=1個(gè)aa)。（3）技術(shù)上的三大突破⑴世界上第一個(gè)重組DNA實(shí)驗(yàn)：實(shí)現(xiàn)不同來(lái)源DNA的體外重組1972年斯坦福大學(xué)化學(xué)家伯格（P.Berg）借助內(nèi)切酶和連接酶將猴病毒SV40的DNA和大腸桿菌λ噬菌體的DNA在試管中連接在了一起，第一次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組。⑵第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)：重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)，是世界上第一個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn)1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)家科恩（S.Cohen）將體外構(gòu)建的含有四環(huán)素和卡那霉素抗性基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，獲得了具有雙抗性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，成功完成了第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)。是基因工程誕生的標(biāo)志。⑶第一個(gè)真核基因在原核生物中的表達(dá)：第一次實(shí)現(xiàn)了異源真核基因在原核生物中的表達(dá)1974年，科恩（S.Cohen）和博耶（H.Boyer）將非洲爪蟾編碼核糖體基因的DNA片斷同pSC101質(zhì)粒重組，并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，結(jié)果表明動(dòng)物基因已進(jìn)入大腸桿菌并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA產(chǎn)物，第一次實(shí)現(xiàn)了異源真核基因在原核生物中的表達(dá)。第1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具一、DNA基因工程的基本工具1.DNA基因工程至少需要三種工具：“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）；“分子縫合針”——DNA連接酶；“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。（1）“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）①來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。②功能：能識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，因此具有專一性。③結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：粘性末端和平末端。思考：下圖中的圖1和圖2分別表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意圖，從圖示可以看出，EcoRⅠ限制酶識(shí)別的堿基序列是GAATTC，切割位點(diǎn)在G和A之間；SmaⅠ限制酶識(shí)別的堿基序列是CCCGGG，切割位點(diǎn)在G和C之間。圖1說(shuō)明，EcoRⅠ發(fā)揮作用是在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開(kāi)，所以產(chǎn)生的是黏性末端，圖2說(shuō)明SmaⅠ發(fā)揮作用是在它識(shí)別序列的中心軸線處將DNA的兩條鏈分別切開(kāi)，所以產(chǎn)生的是平末端。（P71“圖3-3”改編）（2）“分子縫合針”——DNA連接酶①)兩種DNA連接酶（E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶）的比較：a.相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。b.區(qū)別：E·coliDNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)；而T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。②與DNA聚合酶作用的異同：DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。（3）DNA連接酶——“分子縫合針”①作用:將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái),恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。②種類:種類來(lái)源特點(diǎn)E.coliDNA連接酶大腸桿菌只能“縫合”具有互補(bǔ)粘性末端的雙鏈DNA片段T4DNA連接酶T4噬菌體既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)粘性末端，又可“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。(4)“分子運(yùn)輸車”——載體①載體具備的條件：a.能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。b.具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入。c.具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。②最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。③其它載體：噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒2.比較與DNA有關(guān)的六種酶名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切成兩個(gè)片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子DNA聚合酶或熱穩(wěn)定DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對(duì)之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長(zhǎng)鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到單鏈末端二、DNA的粗提取與鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理:（1）提取DNA的原理：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。例如，利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。（2）鑒定DNA的原理：在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。2.方法步驟:（1）稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）去除濾液中的雜質(zhì)。方案一：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過(guò)濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液；方案二：直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液。（3）DNA的析出：方案一：在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；方案二：將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。（4）DNA的鑒定：取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶解于其中一支試管的NaCl溶液中，再向兩支試管中加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。3.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中出現(xiàn)了失誤等。提示:還原糖加斐林試劑后,置于55～65℃熱水中加熱;而DNA加二苯胺試劑后,置于沸水中加熱。4.DNA粗提取中的注意事項(xiàng)（1）本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核(無(wú)DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作材料。（2）加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。（3）二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。（4）提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，加入的洗滌劑能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。（5）在DNA進(jìn)一步提純時(shí)，選用冷卻的95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。第2節(jié)基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。一、目的篩選與獲取1.目的基因概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因,如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。2.篩選合適的目的基因：（1）從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是篩選合適的目的基因較為有效的方法之一。測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù)、序列比對(duì)工具等的應(yīng)用，為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。（2）獲取目的基因方法：①人工合成目的基因。例如，我國(guó)首批具有較高抗蟲(chóng)活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的培育過(guò)程中，科學(xué)家人工合成了目的基因。②常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。③通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。（3）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)含義：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)。它是一項(xiàng)在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。該技術(shù)由穆里斯等人于1988年發(fā)明。（2）原理：DNA半保留復(fù)制。（3）基本條件：①場(chǎng)所：在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，其中一般要添加Mg2＋。②DNA復(fù)制的模板：DNA母鏈。③合成子鏈的原料：4種脫氧核苷酸。④酶：耐高溫的DNA聚合酶，其作用是催化合成DNA子鏈。⑤引物：其作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。(4)過(guò)程：目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸,即將4種脫氧核甘酸加到引物的3'端，如此重復(fù)循環(huán)多次。由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（2n,其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。每次循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性和延伸三步：①變性：當(dāng)溫度上升到90℃時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。(5)操作：PCR過(guò)程可以在PCR擴(kuò)增儀中自動(dòng)完成。(6)鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物。4.獲取目的基因的其他方法：在獲得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的過(guò)程中，除通過(guò)PCR獲取目的基因外，還可以通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。5.從基因工程的目的來(lái)看，基因工程操作中要有“目的基因的篩選與獲取”這一步的原因是：有了目的基因，才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。（P176“教師教學(xué)用書(shū)”）思考：下圖為PCR反應(yīng)原理示意圖，圖中①表示引物，該物質(zhì)是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸；②表示熱穩(wěn)定性聚合酶（Taq酶）；dCTP、dATP、dGTP、dTTP的中文名稱依次是：三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸；③表示變性（雙鏈DNA解聚為單鏈），發(fā)生該過(guò)程的條件是溫度上升到90℃；④表示復(fù)性（兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，發(fā)生該過(guò)程的條件是溫度下降到50℃左右；⑤表示延伸（4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈），發(fā)生該過(guò)程的條件是溫度上升到72℃左右。（P77“相關(guān)信息”P(pán)78“圖3-5”改編）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1．基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的：讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2．基因表達(dá)載體的組成：一個(gè)基因表達(dá)載體應(yīng)含有目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等。3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程：首先用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口；然后用同一種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子。思考：1.下圖為基因表達(dá)載體模式圖，圖中①表示啟動(dòng)子，它是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，其作用是驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類所需要的蛋白質(zhì)。有時(shí)為了滿足應(yīng)用需要，會(huì)在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。②表示終止子，位于基因的下游，是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA短片段，其作用是能夠使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來(lái)。③表示標(biāo)記基因，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，如抗生素抗性基因就可以作為這種基因。思考：2.在基因工程操作中要有“表達(dá)載體的構(gòu)建”這一步，因?yàn)閱为?dú)的目的基因是不能穩(wěn)定遺傳的。而構(gòu)建表達(dá)載體可以使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（P177“教師教學(xué)用書(shū)”）基因表達(dá)載體的構(gòu)建會(huì)因目的基因的不同、受體細(xì)胞的不同而有所差別，不可能是千篇一律的。歸納：?jiǎn)?dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比比較項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰的堿基mRNA上三個(gè)相鄰的堿基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）花粉管通道法：花粉管通道法有多種操作方式。例如，可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：①轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。注：此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。②農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。③轉(zhuǎn)化過(guò)程：如果將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞。2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：將目的基因?qū)雱?dòng)物受精卵最常用的一種方法是利用顯微注射直接將目的基因注入動(dòng)物的受精卵中,這個(gè)受精卵將發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物。3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：常以大腸桿菌作為受體細(xì)胞，一般先用Ca2＋處理受體細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。4.常用的轉(zhuǎn)化方法：①將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等。②將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是受精卵。③將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法或CaCl2法)思考：1.下圖為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖，圖中①表示T-DNA，②表示構(gòu)建表達(dá)載體的過(guò)程，③的名稱是含目的基因的重組Ti質(zhì)粒，④表示轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的過(guò)程，⑤表示導(dǎo)入植物細(xì)胞的過(guò)程，⑥表示將目的基因插入染色體的DNA中，⑦表示培養(yǎng)再生成植株的過(guò)程，該過(guò)程中所用的技術(shù)是植物組織培養(yǎng)技術(shù)。思考：2.在基因工程操作中要有“目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”這一步，這是因?yàn)楹心康幕虻谋磉_(dá)載體只有進(jìn)入受體細(xì)胞，并且維持穩(wěn)定和表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。（P177“教師教學(xué)用書(shū)”）四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1.目的：目的基因的檢測(cè)與鑒定的目的是判斷導(dǎo)入受體細(xì)胞后的目的基因是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。這是基因工程的第四步工作，也是檢査基因工程是否做成功的一步。例如：一個(gè)抗蟲(chóng)或抗病的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后，是否賦予了植物抗蟲(chóng)或抗病特性，需要做抗蟲(chóng)或抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否具有抗性以及抗性的程度。這屬于基因工程操作中的第四步——檢測(cè)和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。2.方法：（1）分子生物學(xué)水平的檢測(cè)：通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因。利用PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。用相應(yīng)抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)等。（2）個(gè)體水平的鑒定：除進(jìn)行分子水平檢測(cè)外，還需要進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定，例如，通過(guò)抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)等判斷是否獲得了抗性及抗性程度。五、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理（1）DNA片段的擴(kuò)增：PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。（2）瓊脂糖凝膠電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下,這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。2.方法步驟（1）移液：用微量移液器按照配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分。待所有的組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。（2）離心：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在管的底部。（3）反應(yīng)：將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)。（4）根據(jù)待分離的DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液，并加入適量的核酸染料混勻。（5）將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。（6）接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。（7）電泳結(jié)束后，取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。3.操作提示（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。（2）緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存。使用前將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。（3）在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。（4）在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（1）可以通過(guò)在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。（P85“問(wèn)題1”）（2）如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體；退火溫度過(guò)低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。（P85“問(wèn)題2”）第3節(jié)基因工程的應(yīng)用一、基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用主要被廣泛用于改良動(dòng)植物品種、提高作物和畜產(chǎn)品的產(chǎn)量等方面。具體來(lái)說(shuō)，其在植物方面應(yīng)用主要有培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物、轉(zhuǎn)基因抗病植物、轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物以及改良植物的品質(zhì)，在動(dòng)物方面的應(yīng)用主要有提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速率、改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)。1.轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物(1)方法：從某些生物中分離出具有抗蟲(chóng)功能的基因，將它導(dǎo)入作物中培育出具有抗蟲(chóng)性的作物。(2)成果：已問(wèn)世的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯等。2．轉(zhuǎn)基因抗病植物(1)背景：許多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常規(guī)育種的方法很難培育出抗病的新品種。(2)方法：科學(xué)家將來(lái)源于某些病毒、真菌抗病基因物。(3)成果：轉(zhuǎn)基因抗病毒甜椒、番木瓜和煙草等。3．轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物(1)背景：雜草常常危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而大多數(shù)除草劑不僅能殺死田間雜草，還會(huì)損傷作物，導(dǎo)致作物減產(chǎn)。(2)方法：將降解或抵抗某種除草劑的基因?qū)胱魑?，可以培育出抗除草劑的作物品種。(3)優(yōu)點(diǎn)：在噴灑除草劑時(shí)，田間雜草會(huì)被殺死而作物不會(huì)受到損傷。(4)成果：轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米、大豆、油菜和甜菜等。4.改良植物的品質(zhì)：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以提高植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、觀賞價(jià)值等。例如，將必需氨基酸含量多的蛋白質(zhì)編碼基因?qū)胫参镏?，可以提高這種氨基酸的含量。我國(guó)科學(xué)家成功地將與植物花青素代謝相關(guān)的基因?qū)氚珷颗Ｖ?，使它呈現(xiàn)出自然界沒(méi)有的顏色變異，大大提高了它的觀賞價(jià)值。5.提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速率：（1）原理及方法：由于外源生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)可以使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生長(zhǎng)得更快，因此科學(xué)家將這類基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)，以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速率。（2）成果：我國(guó)科學(xué)家將外源生長(zhǎng)激素基因?qū)膈庺~(yú),在同等養(yǎng)殖條件下，轉(zhuǎn)基因鯉魚(yú)的生長(zhǎng)速率比非轉(zhuǎn)基因鯉魚(yú)提高了42%?115%。6．改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)：有些人由于乳糖酶分泌少,不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后會(huì)出現(xiàn)腹瀉等不適癥狀，這稱為乳糖不耐受。我國(guó)約有1/3的成年人對(duì)乳糖不耐受。為了解決這一問(wèn)題，科學(xué)家將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，使獲得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他營(yíng)養(yǎng)成分不受影響。思考：從環(huán)境保護(hù)角度出發(fā)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻與普通水稻相比在害蟲(chóng)防治方面的優(yōu)越性有：減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用量，降低了環(huán)境污染；降低生產(chǎn)成本。二、基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用（1）對(duì)微生物或動(dòng)植物的細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使它們能夠生產(chǎn)藥物。這些藥物包括細(xì)胞因子、抗體、疫苗和激素等，它們可以用來(lái)預(yù)防和治療人類腫瘤、心血管疾病、傳染病、糖尿病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。我國(guó)生產(chǎn)的重組人干擾素、血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子等基因工程藥物均已投放市場(chǎng)。（2）利用基因工程技術(shù)，讓哺乳動(dòng)物批量生產(chǎn)藥物。科學(xué)家將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子等調(diào)控元件重組在一起，通過(guò)顯微注射的方法導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中，由這個(gè)受精卵發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在進(jìn)入泌乳期后，可以通過(guò)分泌乳汁來(lái)生產(chǎn)所需要的藥物,這稱為乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。目前，科學(xué)家已經(jīng)在牛、山羊等動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器中，獲得了抗凝血酶、血清白蛋白、生長(zhǎng)激素和a-抗胰蛋白酶等重要的醫(yī)藥產(chǎn)品。構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器的過(guò)程為：將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子等調(diào)控元件重組在一起，通過(guò)顯微注射的方法導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中，由此發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在進(jìn)入泌乳期后，可以通過(guò)分泌乳汁來(lái)生產(chǎn)所需要的藥物,這稱為乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。（3）基因工程技術(shù)還可能使建立移植器官工廠的設(shè)想成為現(xiàn)實(shí)。目前，科學(xué)家正嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)對(duì)豬的器官進(jìn)行改造，培育出不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。三、基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用（1）利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用氨基酸。例如，阿斯巴甜是一種普遍使用的甜味劑，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，這兩種氨基酸就可以通過(guò)基因工程實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。（2）利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用酶。例如，奶酪是一種被廣泛食用的發(fā)酵奶制品。大多數(shù)奶酪的生產(chǎn)需要使用凝乳酶來(lái)凝聚固化奶中的蛋白質(zhì)?？茖W(xué)家將編碼牛凝乳酶的基因?qū)氪竽c桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過(guò)工業(yè)發(fā)酵批量生產(chǎn)凝乳酶。另外，加工轉(zhuǎn)化糖漿需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也都可以通過(guò)構(gòu)建基因工程菌，然后用發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)。（3）利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用維生素。思考：相比從天然產(chǎn)物中提取的酶，通過(guò)構(gòu)建基因工程菌，然后用發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)的食品工業(yè)用酶的優(yōu)點(diǎn)是：純度更高，生產(chǎn)成本顯著降低,生產(chǎn)效率較高。四、其他方面的應(yīng)用：基因工程使人們更容易培育出具有優(yōu)良性狀的動(dòng)植物品種，獲得很多過(guò)去難以得到的生物制品，甚至還能培育出可以降解多種污染物的“超級(jí)細(xì)菌”來(lái)處理環(huán)境污染,蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用從基因、蛋白質(zhì)和性狀關(guān)系角度，對(duì)基因工程的實(shí)質(zhì)可描述為：基因工程是將一種生物的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，讓后者產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，進(jìn)而表現(xiàn)出新的性狀。基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。一、蛋白質(zhì)工程及其崛起的緣由1.蛋白質(zhì)工程的概念:蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)