低gc含量革蘭氏陽性菌碳分解代謝物阻膦效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子

低gc含量革蘭氏陽性菌碳分解代謝物阻膦效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子

1ccrpa在非速率碳源治療的機(jī)制1942年，jacce檢驗(yàn)了葡萄糖和半乳液混合碳的環(huán)境。葡萄糖消耗后，開始使用半乳液，導(dǎo)致雙重生長。隨后的研究表明,葡萄糖存在時(shí),其分解代謝物會(huì)抑制與其他糖代謝相關(guān)的基因表達(dá),這種現(xiàn)象被稱之為碳分解代謝物阻遏(carboncataboliterepression,CCR)效應(yīng)。E.coli等腸道細(xì)菌中介導(dǎo)CCR效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白為轉(zhuǎn)錄激活因子CRP(cyclicAMPreceptorprotein),又稱分解代謝基因激活蛋白(catabolitegene-activatorprotein,CAP)。當(dāng)培養(yǎng)基中不含葡萄糖時(shí),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的EIIA結(jié)構(gòu)域(EIIAGlc)處于磷酸化狀態(tài),能夠激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase,AC),催化胞內(nèi)cAMP的合成,而cAMP在濃度足夠高時(shí)可與CRP結(jié)合形成復(fù)合體,然后激活非速效碳源分解代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄;相反,葡萄糖存在時(shí)則會(huì)導(dǎo)致EIIAGlc去磷酸化,從而無法啟動(dòng)非速效碳源的利用?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)等低GC含量革蘭氏陽性菌的CCR效應(yīng)機(jī)制與大腸桿菌不相同。在有氧條件下,B.subtilis中檢測不到cAMP,亦未找到CRP類似的蛋白。1991年,Henkin等發(fā)現(xiàn)了B.subtilis中編碼分解代謝物控制蛋白的基因ccpA,將該基因中斷失活后,能夠解除葡萄糖對α-淀粉酶合成基因amyE的抑制作用,從而表明CcpA是B.subtilis中控制CCR效應(yīng)的關(guān)鍵因子。之后的研究者相繼在其他低GC含量革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)了CcpA的存在,如Clostridiumacetobutylicum、Staphylococcusxylosus、Lactobacilluspentosus、Lactococcuslactis、Listeriamonocytogenes、Streptococcusthermophilus、Enterococcusfaecalis、Thermoactinomycessp.E79等。這些研究結(jié)果表明,含PTS系統(tǒng)的低GC含量革蘭氏陽性菌大部分可能以CcpA依賴的CCR效應(yīng)進(jìn)行碳源次序代謝的調(diào)控,且這些CcpA蛋白具有較高的保守性。2ccpa的多效性控制2.1ccrp效應(yīng)的表達(dá)在CcpA調(diào)控蛋白被發(fā)現(xiàn)之前,Nicholson等就觀察到,枯草芽孢桿菌B.subtilis的淀粉酶編碼基因amyE啟動(dòng)子區(qū)存在cre(cataboliterepressionelement)位點(diǎn),該位點(diǎn)突變后可以解除葡萄糖對amyE的CCR效應(yīng),葡萄糖與淀粉即可被同步利用,從而證明cre位點(diǎn)是參與CcpA依賴的CCR效應(yīng)的重要順式調(diào)控元件。隨后的研究表明,除amyE外,許多參與碳源代謝的操縱子內(nèi)均有cre位點(diǎn)的存在,如gntR(參與葡糖酸代謝)、xylA(參與木糖代謝)、abnA(參與阿拉伯糖代謝)等。1995年,Kim等通過EMSA、footprinting實(shí)驗(yàn)證明了CcpA可以與amyE轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處的cre位點(diǎn)amyO結(jié)合,而且這種結(jié)合不需要共阻遏物Hpr的協(xié)助;但后續(xù)的相關(guān)研究表明,在大多數(shù)情況下CcpA與cre位點(diǎn)的結(jié)合需要共阻遏蛋白P-(Ser)-HPr的參與。HPr(histidine-phosphorylprotein)有組氨酸殘基和絲氨酸殘基兩個(gè)磷酸化位點(diǎn),該蛋白的組氨酸殘基在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferasesystem,PTS)EI(enzymeI)催化下以磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)為底物進(jìn)行磷酸化,并將磷傳遞給負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化的PTS系統(tǒng);HPr蛋白的絲氨酸殘基隨后在Hpr激酶/磷酸酯酶HPrK/P(Hprkinase/phosphoesterase)的催化下被磷酸化,形成P-(Ser)-HPr并與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CcpA形成復(fù)合體,參與CCR效應(yīng)。HPrK/P的活性受胞內(nèi)ATP與無機(jī)磷酸比例(ATP/Pi)以及葡萄糖代謝產(chǎn)物1,6-二磷酸果糖(FBP)、6-磷酸葡萄糖(G6P)水平的影響。當(dāng)葡萄糖等速效碳源存在時(shí),胞內(nèi)高水平的ATP/P與葡萄糖代謝產(chǎn)物激活HPrK/P的激酶活性,將HPr的絲氨酸殘基磷酸化,然后P-(Ser)-HPr與CcpA結(jié)合形成復(fù)合物,與非速效碳源代謝基因的cre位點(diǎn)結(jié)合,抑制其轉(zhuǎn)錄(圖1)。值得注意的是,B.subtilis中除HPr外,還存在一個(gè)HPr的同種異型蛋白Crh(cataboliterepressionHPr-likeprotein),兩者均參與CcpA依賴的CCR效應(yīng)過程,但前者在這一過程中起主要作用。Hpr缺失后,Crh只能部分地完成Hpr的功能,而Crh缺失后,CCR效應(yīng)的調(diào)控不受影響。而以琥珀酸鹽或檸檬酸鹽為碳源時(shí),編碼Mg2+-檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的citM基因特異性地受Crh抑制。Crh目前僅在芽孢桿菌屬中被發(fā)現(xiàn)。2.2ccpa協(xié)助作用下的特定基因當(dāng)速效碳源存在時(shí),除引起CCR效應(yīng)外,也有一些基因可以被激活,這種現(xiàn)象稱為碳分解代謝物激活(carboncataboliteactivation,CCA)。CcpA依賴的CCA效應(yīng)機(jī)制與CCR效應(yīng)類似,即CcpA在共阻遏物P-(Ser)-HPr或P-(Ser)-Crh的協(xié)助下與目的基因的特定序列(如cre序列)結(jié)合,激活基因轉(zhuǎn)錄(圖1)。盡管CcpA對有些基因?qū)嵤〤CA效應(yīng)時(shí)也不需要共阻遏物,但不同點(diǎn)在于,CcpA實(shí)施阻遏效應(yīng)時(shí)的cre序列一般在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)或在讀碼框內(nèi),如amyE、bglP、cccA、dctP、glpF、phoP、acuA等;而CcpA實(shí)施激活效應(yīng)時(shí),其cre序列一般位于啟動(dòng)子上游,如ackA、pta、ilvB等,也有些受CcpA激活的基因在其啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)cre序列,如alsSD。2.3ccpa影響碳源代謝的其他機(jī)制許多微生物的ccpA基因缺失突變株除解除了CCR效應(yīng)外,亦表現(xiàn)出其他的表型,如生長受到抑制、產(chǎn)孢減少、產(chǎn)溶劑受影響等,這表明CcpA除參與碳源代謝的CCR/CCA效應(yīng)外,還可能具有其他的調(diào)控功能。2.3.1ccpa對pus操縱子的影響糖酵解是真核細(xì)胞及細(xì)菌攝入體內(nèi)的葡萄糖最初經(jīng)歷的酶促分解過程。已有研究表明,糖酵解途徑的許多關(guān)鍵酶基因均受到CcpA的調(diào)控。在B.subtilis中,編碼糖酵解過程關(guān)鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶的是gap操縱子,而研究表明,gap操縱子的激活依賴于CcpA的存在,但CcpA并不直接與gap操縱子結(jié)合,而是通過影響PTS系統(tǒng)及其代謝中間物的方式間接調(diào)控gap操縱子。此外,B.subtilis中編碼磷酸甘油酸激酶的pgk操縱子的激活也依賴于CcpA。在L.lactis中,las操縱子編碼參與糖酵解過程的磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶及L-乳酸脫氫酶,該操縱子的轉(zhuǎn)錄在ccpA缺失突變株中降低了75%。CcpA缺失后,丙酮酸激酶及L-乳酸脫氫酶活性的降低導(dǎo)致代謝產(chǎn)物中乙醇、乙酸的增加,而野生型的發(fā)酵產(chǎn)物主要為乳酸。2.3.2ccpa影響丙酮酸生成l-乳酸的機(jī)制在碳源豐富的培養(yǎng)基中,細(xì)菌通過糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸并不能全部進(jìn)入三羧酸循環(huán),而是會(huì)生成乙酸、乳酸、乙偶姻等代謝產(chǎn)物分泌到胞外,這稱為碳溢流代謝(carbonoverflowmetabolism)。在B.subtilis中的研究發(fā)現(xiàn),即使在高濃度的葡萄糖培養(yǎng)條件下,ccpA突變株也不會(huì)發(fā)生碳溢流現(xiàn)象。究其原因是:催化丙酮酸生成乙酸的兩個(gè)關(guān)鍵酶——磷酸轉(zhuǎn)移酶和乙酸激酶的編碼基因pta與ackA受到CcpA的正調(diào)控;而丙酮酸經(jīng)乙酰輔酶A生成乙偶姻途徑的關(guān)鍵酶乙酰乳酸合酶的編碼基因alsSD到亦受CcpA的正調(diào)控;此外,與乙酸、乙偶姻分解代謝相關(guān)的acsA、acuABC也受到CcpA的抑制。研究還發(fā)現(xiàn),L.lactis中的CcpA也具有促進(jìn)丙酮酸生成L-乳酸的功能。這些研究結(jié)果表明,在某些細(xì)菌中,CcpA參與調(diào)控了丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?、乙偶姻、L-乳酸等可分泌碳源的過程,從而降低了進(jìn)入TCA循環(huán)的碳流量。2.3.3ccpa影響tca循環(huán)中間產(chǎn)物的表達(dá)呼吸作用是生物體細(xì)胞把有機(jī)物氧化分解并產(chǎn)生能量的化學(xué)過程。其中三羧酸循環(huán)(tricarboxylicacidcycle,TCAcycle)是有氧呼吸過程中的關(guān)鍵反應(yīng)過程,是需氧生物體內(nèi)普遍存在的糖、脂肪和蛋白質(zhì)在體內(nèi)徹底氧化的共同代謝途徑。B.subtilis中,CcpA可以直接或間接地抑制參與TCA循環(huán)的檸檬酸合酶編碼基因citZ的表達(dá)。與檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的citM-yflN操縱子也是CcpA依賴的CCR效應(yīng)的直接靶點(diǎn)之一,而對該操縱子起正調(diào)控作用的雙組份系統(tǒng)CitS/CitT亦受到CcpA的直接抑制。此外,TCA循環(huán)中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)同樣受到CcpA的調(diào)控,例如四碳二元酸,如蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是由dctP基因編碼,該基因以及正調(diào)控該基因的雙組份系統(tǒng)dctS/dctR均受到CcpA的抑制。此外,B.subtilis中的resABCDE操縱子、編碼細(xì)胞色素c550的cccA基因、編碼細(xì)胞色素bd氧化酶的cydABCD操縱子等均參與有氧呼吸過程的電子傳遞,而這些基因的表達(dá)均受到CcpA的抑制。2.3.4ccpa影響gltab操縱子的機(jī)制微生物能夠以檸檬酸循環(huán)、糖酵解及戊糖磷酸途徑等代謝中間產(chǎn)物為碳骨架合成部分或全部氨基酸。CcpA對谷氨酸的生物合成有促進(jìn)作用。B.subtilis氨同化過程中,谷氨酸的生物合成是連接碳代謝及氮代謝的紐帶。參與谷氨酸生物合成的谷氨酸合成酶由gltAB操縱子編碼,該操縱子的激活需要糖酵解中間產(chǎn)物的積累,而在ccpA突變株中因無足夠的糖酵解中間產(chǎn)物積累導(dǎo)致gltAB操縱子無法被激活,因而CcpA能夠間接地對gltAB操縱子起到激活作用。CcpA缺失突變株中,gltAB無法激活被認(rèn)為是葡萄糖-銨鹽培養(yǎng)時(shí)菌體生長受抑制的關(guān)鍵因素。另外,參與氨基酸降解的谷氨酸脫氫酶的編碼基因rocG亦受到CcpA的CCR效應(yīng)作用。在ccpA突變株中rocG的CCR效應(yīng)被解除,導(dǎo)致谷氨酸的合成量減少,從而表現(xiàn)為突變株在葡萄糖-銨鹽培養(yǎng)基上的生長受到抑制。分支氨基酸(branched-chainaminoacids,BCAAs),如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸等的合成則受到CcpA依賴的CCA效應(yīng)的調(diào)控。BCAAs是蛋白質(zhì)中含量最高的氨基酸,可以形成蛋白質(zhì)的疏水核心,而且這些氨基酸是異構(gòu)支鏈脂肪酸和反異構(gòu)支鏈脂肪酸(芽孢桿菌膜脂脂肪酸的主要種類)生物合成的前體。B.subtilis中負(fù)責(zé)BCAAs生物合成的關(guān)鍵操縱子為ilv-leu操縱子,該操縱子直接受CcpA的激活,其編碼產(chǎn)物參與催化由丙酮酸到氨基酸的生物合成,并且將碳代謝與氨基酸合成偶聯(lián)起來。2.3.5ccpa影響生物被膜的表達(dá)CcpA除了廣泛地參與碳、氮代謝的調(diào)控外,在某些微生物中還參與一些特殊的生理過程,如產(chǎn)孢、產(chǎn)溶劑、毒性基因的表達(dá)等。在重要的產(chǎn)溶劑梭菌C.acetobutylicumATCC824中,ccpA中斷后,在不調(diào)控pH的情況下,突變株在發(fā)酵培養(yǎng)基中出現(xiàn)酸累積,從而無法正常產(chǎn)生溶劑。這表明CcpA直接或間接地參與了該菌株產(chǎn)酸產(chǎn)溶劑過程的調(diào)控。在一些致病菌如釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)中,CcpA直接激活毒性基因的表達(dá)。此外,在胚芽乳桿菌(Lactobacillusplantarum)中,CcpA參與調(diào)控dnaK(編碼熱休克蛋白)、groESL操縱子(編碼分子伴侶)的激活,ccpA突變菌株在熱激后的存活率比野生型菌株明顯降低;在B.subtilis及S.aureusSA113中,CcpA通過調(diào)控cidA、icaA、citB、citZ等基因的表達(dá)促進(jìn)生物被膜(biofilm)的形成;在C.perfringens中,CcpA通過抑制pilT、pilD基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而負(fù)調(diào)控TFP依賴的滑移運(yùn)動(dòng),且該菌的充分產(chǎn)孢和生物被膜的充分形成亦依賴于CcpA,但具體機(jī)制尚不清楚。3ccpa結(jié)構(gòu)與功能的研究3.1ccpa結(jié)構(gòu)及連接域分析CcpA屬于LacI-GalR轉(zhuǎn)錄因子家族,其N末端為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,DBD),C末端結(jié)構(gòu)域又稱核心結(jié)構(gòu)域(coredomain),參與同源二聚化及共阻遏物的結(jié)合。在巨大芽孢桿菌B.megaterium中,CcpA的N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由60個(gè)氨基酸殘基組成,包含兩個(gè)DNA結(jié)合元件:由3個(gè)α螺旋(helix1~3)形成的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)結(jié)構(gòu),結(jié)合DNA雙螺旋的大溝;由helix4形成鉸鏈螺旋(hingehelix),結(jié)合DNA雙螺旋小溝。C末端的核心結(jié)構(gòu)域由第61~332個(gè)氨基酸殘基組成,可分為N亞結(jié)構(gòu)域(Nsubdomain)及C亞結(jié)構(gòu)域(Csubdomain)。N亞結(jié)構(gòu)域含4個(gè)α螺旋(I~III,IX),包圍著6股平行β折疊片(A~E,J),參與同共阻遏物的結(jié)合。C亞結(jié)構(gòu)域含5個(gè)α螺旋(IV~VIII),包圍著5個(gè)β折疊股(F~I,K)。兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域間由βE-αIV、βI-αIX、βJ-βK形成3個(gè)連接,使得兩個(gè)亞基間可以旋轉(zhuǎn)(圖2)。B.megaterium的CcpA與P-(Ser)-HPr、P-(Ser)-Crh等共阻遏物及cre序列結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析。但由于CcpA的N末端DBD與C末端核心結(jié)構(gòu)域之間的連接很不穩(wěn)定,因而完整的CcpA單晶很難獲得。B.megaterium、B.subtilis、L.lactis中斷開的CcpAC末端結(jié)構(gòu)域及N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)也已分別得到解析。3.2ccpa影響cre位點(diǎn)的機(jī)制一般情況下,CcpA需要結(jié)合共調(diào)節(jié)物P-(Ser)-HPr發(fā)生變構(gòu)才能與cre序列結(jié)合。通過比較CcpA-P-(Ser)-HPr-cre復(fù)合體中CcpA的結(jié)構(gòu)和脫輔基的CcpA(apoCcpA)結(jié)構(gòu),可以發(fā)現(xiàn),結(jié)合了P-(Ser)-HPr后,CcpA的C亞結(jié)構(gòu)域幾乎不受影響,但N亞結(jié)構(gòu)域發(fā)生了3~8°的旋轉(zhuǎn),從而由“關(guān)”的狀態(tài)變?yōu)椤伴_”的狀態(tài)(圖3C)。CcpA與P-(Ser)-HPr的相互作用主要是通過CcpA二聚體中單體1N亞結(jié)構(gòu)域的α螺旋I、IX及單體2N亞結(jié)構(gòu)域α螺旋I、II來實(shí)現(xiàn)的,其中CcpA的Tyr295、Ala299、Val300、Leu304等氨基酸殘基可以與P-(Ser)-HPr的Ile47、Met48、Met51等氨基酸殘基形成緊密的界面(圖3)。CcpA與P-(Ser)-HPr結(jié)合后,后者的Ser46-P可與CcpA中Arg303作用,使Arg303旋轉(zhuǎn)并隨之造成Tyr89位置的改變,進(jìn)一步導(dǎo)致Tyr91和Thr306間氫鍵的斷裂,Tyr91將Thr61排出,使N末端DBD的HTH結(jié)構(gòu)發(fā)生約180°旋轉(zhuǎn),改變兩個(gè)CcpA單體鉸鏈螺旋的排列,從而使CcpA與cre位點(diǎn)結(jié)合CcpA位于N亞結(jié)構(gòu)域和N末端DBD之間的Thr61的位置變化是這種“開關(guān)”調(diào)控的關(guān)鍵。芽孢桿菌中HPr的同種異型蛋白Crh參與CcpA變構(gòu)調(diào)節(jié)作用的機(jī)制與HPr類似,但HPr與CcpA的結(jié)合能力比Crh高10倍左右。6-磷酸-葡萄糖、1,6-二磷酸-果糖同CcpA的結(jié)合可以對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行微調(diào),增強(qiáng)CcpA-P-(Ser)-HPr與cre的結(jié)合。作為多效調(diào)控因子,CcpA可以同很多基因的cre位點(diǎn)結(jié)合,這些cre位點(diǎn)具有一定的保守性,同時(shí)也有一定的差異。CcpA如何同這些差異的cre位點(diǎn)結(jié)合,在抑制一些基因表達(dá)的同時(shí)又能激活一些基因的表達(dá)呢?Schumacher等分別以受CcpA激活、抑制及隨機(jī)的cre位點(diǎn)與CcpA共結(jié)晶,通過對晶體結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn)CcpA-P-(Ser)-HPr復(fù)合體與上述三個(gè)cre位點(diǎn)結(jié)合的親和性是相近的。在與不同的cre位點(diǎn)結(jié)合時(shí),CcpA的結(jié)構(gòu),尤其是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生不同角度的彎曲。在這個(gè)過程中,CcpADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Arg22、Leu55這兩個(gè)保守的氨基酸殘基識(shí)別cre序列的保守區(qū),而一些非極性氨基酸,如I5、A18等,可以加強(qiáng)與cre序列的結(jié)合過程,從而使CcpA-P-(Ser)-HPr復(fù)合體與不同cre位點(diǎn)結(jié)合的親和性相近。由此,再根據(jù)之前研究人員的工作,我們可以得出結(jié)論,CcpA行使阻遏或激活效應(yīng)主要是由cre位點(diǎn)的位置決定的,行使阻遏效應(yīng)時(shí)的cre位點(diǎn)一般在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)或在讀碼框內(nèi),如amyE、bglP、cccA、dctP、glpF、phoP、acuA等;而CcpA行使激活效應(yīng)時(shí),其cre位點(diǎn)一般位于啟動(dòng)子上游。3.3ccpa影響cre位點(diǎn)及ccrpa回復(fù)突變的機(jī)制由于CcpA具有多效性調(diào)控功能,將其敲除后會(huì)影響許多生理代謝過程,因此有必要研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,而對CcpA進(jìn)行點(diǎn)突變及隨機(jī)突變是了解其功能域和活性位點(diǎn)的重要手段之一。在B.megaterium中,CcpA發(fā)生T4S、7H、N49S單點(diǎn)突變后,可解除對xylA基因的抑制,且保持菌體的正常生長。這三個(gè)氨基酸殘基均位于CcpAN末端DBD結(jié)構(gòu)域,Thr4是HTH結(jié)構(gòu)的第一個(gè)氨基酸,Arg47位于N末端DBD與C末端核心結(jié)構(gòu)域的連接處,Asn49參與形成鉸鏈α螺旋與DNA小溝結(jié)合。這三個(gè)位點(diǎn)突變成相似氨基酸后,可能僅影響CcpA與部分cre位點(diǎn)的結(jié)合(如xylA上游的cre位點(diǎn)),但不影響與生長相關(guān)的基因的激活(如分支氨基酸的合成),