滲透促進劑對皮肉瘤后脂質(zhì)的影響

滲透促進劑對皮肉瘤后脂質(zhì)的影響

人體皮膚是藥物透皮吸收的主要屏障。為了提高藥物的透皮吸收的量,往往要借助于各種滲透促進劑(促滲劑)。因此促滲劑的作用機理成為研究領(lǐng)域的一個熱點。紅外技術(shù)的發(fā)展,特別是衰減全反射傅立葉紅外光譜(ATR-FTIR)的出現(xiàn)使得在體研究人體皮膚角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)、促滲劑與角質(zhì)層細胞的相互作用,以揭示各種促滲劑的作用機理成為可能。在ATR-FTIR中,只需將被測樣品與ATR附件相接觸就可以測定。由于這一技術(shù)無需制樣,不具破壞性,在研究樣品表面性質(zhì)方面顯示出獨特的應(yīng)用價值。ATR-FTIR用于人體在體皮膚角質(zhì)層的研究,國內(nèi)未見論文的發(fā)表。本文應(yīng)用ATR-FTIR測定皮膚表面不同深度角質(zhì)層的CH2-伸縮振動峰的波數(shù)位移以及脂質(zhì)的相對含量,來考察油酸(OA)和月桂氮艸卓酮(Azone)對角質(zhì)層脂質(zhì)的作用。1藥物和試劑Azone(藥用),廣州市化學(xué)助試劑廠;OA(分析純),沈陽市試劑三廠;丙二醇(分析純),沈陽市試劑三廠;壓敏膠帶,自制。2實驗方法2.1反射光柵ire室溫:18-20℃;RH:39%;儀器型號:FTS-65A(BIO-RAD);反射棱鏡(IRE):ZnSe;入射角:45°;掃描次數(shù):64次;分辨率:8cm-1;波數(shù)的精確度:0.1cm-1。2.2皮膚atr-ftir測試受試者,30歲,健康男性,無皮膚病史。測試部位在實驗前48h內(nèi)不得應(yīng)用任何化妝品及外用藥物。在進行ATR-FTIR測定之前,受試部位用蒸餾水沖洗,藥棉輕輕擦干。兩手的前臂劃分為4個區(qū)(3×9cm2),分別為:空白對照區(qū)、丙二醇(PG)處理區(qū)、5%AzonePG溶液處理區(qū)、5%OAPG溶液處理區(qū)。處理時間為2h。在處理過程中,該區(qū)用藥棉及聚乙烯膜覆蓋,以防污染衣物,但不密封。處理后用藥棉將被處理部位徹底擦拭干凈,再用酒精藥棉球輕擦2遍。讓皮膚在室溫下自然恢復(fù)2h,然后進行ATR-FTIR測定。第一次測定完成后,在受試部位用壓敏膠帶(3×9cm2)進行角質(zhì)層剝離(粘貼1min),并分別在剝離的第2、4、8、15次后再進行ATR-FTIR測定。同時準(zhǔn)確稱量壓敏膠帶在使用前后的重量,其重量之差為剝離角質(zhì)層的重量。2.3酰胺峰的積分面積儀器在800cm-1～4000cm-1范圍內(nèi)記錄樣品的紅外圖譜。由于水峰和其它峰存在的影響,使CH2-伸縮振動吸收峰在3200cm-1、2850cm-1附近以肩峰的形式出現(xiàn);所以積分之前首先進行基線校正。積分區(qū)間為2835.4cm-1～2946.3cm-1。這一積分面積用來計算皮膚表面脂質(zhì)的相對含量。在ATR-FTIR中,樣品吸收峰的強度除了與樣品的性質(zhì)和量有關(guān)外,還與樣品同IRE接觸的緊密程度有關(guān)。特別是在體實驗,在兩次采樣中難于使接觸的緊密程度達到完全一致。因此不能直接將吸收強度進行比較。為了獲取有意義的數(shù)據(jù),本文以酰胺Ⅰ峰(1640cm-1)面積為基準(zhǔn),對CH2-伸縮振動峰面積進行歸一化處理。酰胺Ⅰ峰來源于皮膚角質(zhì)層中的角蛋白,其吸收強度與皮膚同IRE的接觸緊密與否有關(guān)。酰胺Ⅰ峰的積分范圍為:1580.7cm-1～1727.3cm-1。并將未作任何處理的皮膚角質(zhì)層的脂質(zhì)含量定為100%,用滲透促進劑處理或用壓敏膠剝離后的角質(zhì)層與之比較。文獻中應(yīng)用相同或類似的方法對皮膚吸收的水分或藥物進行了定量。3皮膚角質(zhì)層中ch2-偏轉(zhuǎn)構(gòu)象的分布ATR-FTIR光譜是一種很有效的紅外實驗方法,在研究樣品表面性質(zhì)方面顯示出獨特的應(yīng)用價值。在ATR-FTIR中,無需制樣,不具破壞性,為在體研究人體皮膚的屏障功能和滲透促進劑的作用機理及藥物的經(jīng)皮吸收奠定了基礎(chǔ)。紅外光束照射穿透進入皮膚的深度(dp)可由下式估計:入射角為45°,在波數(shù)為2820cm-1～2850cm-1時,dp約為0.7μm,大概相當(dāng)于一個角質(zhì)層細胞的厚度。ATR-FTIR圖譜代表了縱向深度為一個角質(zhì)細胞厚度處脂質(zhì)的信息.而普通紅外在體外測定時,由于是透射方式,圖譜信息來自整個角質(zhì)層。所以ATR-FTIR對于測定縱向不同深度角質(zhì)層中脂質(zhì)的變化及分布更為靈敏。膠帶剝離技術(shù)和ATR-FTIR光譜技術(shù)的聯(lián)用可以獲取人體在體不同深度的光譜信息。早期的文獻以剝離次數(shù)來衡量或代替角質(zhì)層的深度;但實際上,即使在皮膚的同一部位,也很難保持每次剝離相同數(shù)量的角質(zhì)層細胞。因此,采用單位面積剝離下角質(zhì)層的累積重量來作為皮膚角質(zhì)層深度的衡量指標(biāo)更為準(zhǔn)確、合理,也為文獻所應(yīng)用。在角質(zhì)層的IR圖譜(圖1)中,發(fā)生在2800cm-1～2950cm-1附近的CH2伸縮振動峰的位移是指示脂質(zhì)側(cè)鏈自由度水平的靈敏指標(biāo),波數(shù)位移的大小與CH2-的偏轉(zhuǎn)/全反構(gòu)象體的比例有關(guān)。有研究表明人、豬、大鼠的角質(zhì)層中均有一個隨溫度升高的相轉(zhuǎn)變過程,νasCH2和νsCH2位移大小在6cm-1～3cm-1間。提示了相轉(zhuǎn)變后,脂質(zhì)側(cè)鏈中CH2-偏轉(zhuǎn)構(gòu)象增多,角質(zhì)層中脂質(zhì)排列的無序性增加。以νCH2對單位面積剝離角質(zhì)層的累積重量作圖,所得圖線見圖2。從圖中可以看出,無論是對于νasCH2還是νsCH2,OA和Azone均使得峰位藍移,就峰位藍移的大小來說,Azone比OA的作用更為強大。但,這種作用隨著角質(zhì)層深度的增大而減弱。這同一般情況下Azone比OA具有更強的促進滲透的結(jié)論相符合。一般認為用壓敏膠帶剝離15～20次后,可以接近全部剝離角質(zhì)層。實驗中,剝離15次后兩種滲透促進劑的影響仍然存在,但峰位藍移的大小Azone和OA已經(jīng)沒有差別。為了考察PG是否對峰位的藍移有貢獻,以PG處理皮膚后進行ATR-FTIR測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后的角質(zhì)層中的CH2-伸縮振動峰位與未處理的無明顯的差別。人體角質(zhì)層中脂質(zhì)的縱向分布如圖3,從圖中可以看出,PG對皮膚角質(zhì)層中脂質(zhì)的含量分布無明顯影響。對于油酸,在角質(zhì)層外層脂質(zhì)的含量明顯高于內(nèi)層?？赡苁怯捎谟退釢B透進入外層角質(zhì)層細胞間所致。但通過脂質(zhì)含量的增加可以算出,即使在角質(zhì)層的最外層外來油酸的數(shù)量也僅占脂質(zhì)總量的20%左右。隨著角質(zhì)層深度的增加,脂質(zhì)總量也逐漸接近正常值。由這些數(shù)據(jù)結(jié)合νCH2波數(shù)位移的大小,從一個側(cè)面證實了原來文獻中的假設(shè)νCH2的位移主要是角質(zhì)層細胞間固有的脂質(zhì)側(cè)鏈CH2-構(gòu)象的偏轉(zhuǎn)引起的而不是直接來源于外源性油酸。Azone本身含有內(nèi)酰胺基團,它具有很強的酰胺峰Ⅰ。如果Azone大量的進入了角質(zhì)層深層,用以上的定量的方法來求得的脂質(zhì)的分布顯然有較大的偏差,因為由純Azone的圖譜求出的νCH2和酰胺Ⅰ峰面積之比為2.91,遠遠高于人體皮膚角質(zhì)層的值0.38。但從圖3中我們可以看出,皮膚角質(zhì)層經(jīng)過5%Azone溶液處理后,脂質(zhì)的分布并沒有明顯地變化,剝離兩次后,νCH2和酰胺Ⅰ峰面積之比即恢復(fù)了正常值。故可以證明Azone并沒有大量地進入角質(zhì)層深部。用OA、Azone處理皮膚后,剝離角質(zhì)層前求出的脂質(zhì)含量均偏高,是由于外層角質(zhì)細胞吸附了較多數(shù)量的滲透促進劑所致。實驗結(jié)果提示我們,OA作為透皮吸收促進劑的機理可能是與皮膚整個角質(zhì)層中脂質(zhì)發(fā)生作用,使側(cè)鏈無序性變大,導(dǎo)致脂質(zhì)的流動性增加,減少了藥物透過皮膚進入體內(nèi)的阻力。并對最外層的角質(zhì)層作用最為強烈。這一結(jié)論和文獻報道一致。Azone的作用機制與OA相類