酵母雙雜交體系的研究進(jìn)展

酵母雙雜交體系的研究進(jìn)展

隨著生物研究的發(fā)展和人類遺產(chǎn)劑項(xiàng)目的完成，racema領(lǐng)域的研究進(jìn)入了功能改良時(shí)代。功能基因組學(xué)的主要任務(wù)就是對生物基因組中包含的全部基因及其所翻譯的蛋白質(zhì)的功能加以解讀和描述,尤其是大量未知基因的功能及其相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能。系統(tǒng)綜合分析蛋白-蛋白相互作用將為了解蛋白質(zhì)的功能提供重要的信息。然而,利用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法難以洞察在生物體內(nèi)瞬間發(fā)生的蛋白質(zhì)之間的相互作用。酵母雙雜交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中一種十分行之有效的方法。本文主要介紹了酵母雙雜交的相關(guān)知識及其發(fā)展前景。1轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交體系簡稱雙雜交體系(Two-hybridsystem),又稱相互作用陷阱(Interactiontrap),是1989年由Fields等在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中提出并初步建立的。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子,如Gal4、Gcn4等都含有2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain,AD)。DNA-BD能夠識別位于Gal4效應(yīng)基因(Gal4-responsivegene)的上游激活序列(Up-streamactivatingsequence,UAS),并與之結(jié)合。而AD則是通過同轉(zhuǎn)錄體(transcriptionmachinery)中的其他成分之間的結(jié)合,以啟動UAS下游的基因(如:Ade、His及LacZ)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng),但是當(dāng)兩者在空間上較為接近時(shí),則呈現(xiàn)完整的Gal4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動子,使其下游基因得到轉(zhuǎn)錄。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開,仍具有各自的功能,而且兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可重建而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)情況,從而達(dá)到分離蛋白或研究蛋白互作的目的。2母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)和限制2.1蛋白質(zhì)間相互作用的檢測靈敏性:能夠采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體使雜和蛋白過量表達(dá),并通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大等手段,使最終發(fā)生在核內(nèi)的微小的反應(yīng)被放大到體外,來檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。簡潔性:融合蛋白相互作用后,減去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟,大大縮短實(shí)驗(yàn)周期。真實(shí)性:酵母細(xì)胞是真核細(xì)胞,融合蛋白之間的相互作用是在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的,蛋白質(zhì)經(jīng)過翻譯后的修飾,有可能保持蛋白質(zhì)的天然空間構(gòu)象和折疊狀態(tài),接近其真實(shí)的生理狀態(tài),一定程度上可代表其在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。廣泛性:酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化期的材料構(gòu)建cDNA文庫,能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì),適用于多方面的研究。2.2其它非酵母蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法,有多方面的應(yīng)用,但仍存在一些局限性:(1)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助,這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。(2)酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問題是“假陽性”。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用,使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。據(jù)統(tǒng)計(jì),到2002年已篩選出約8萬種蛋白質(zhì)相互作用,其中只有2400種相互作用得到了多于1種方法的確認(rèn)。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域,能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物,從而引起報(bào)告基因的表達(dá),產(chǎn)生“假陽性”結(jié)果。3在植物和疾病的綜合研究中，母親和植物交織系統(tǒng)的應(yīng)用3.1pto與avrpto蛋白的互作Pto與AvrPto番茄抗葉斑病的Pto基因是國際上克隆的第一個(gè)符合Flor基因?qū)驅(qū)W說意義上的植物抗病基因。1996年美國科學(xué)家利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證了番茄抗葉斑病的Pto蛋白與其相對應(yīng)的葉斑病菌Pseudomonassyringaepv.tomato中AvrPto無毒蛋白之間可以發(fā)生特異性的結(jié)合,同時(shí)證實(shí)Pto蛋白在204位上的蘇氨酸對于與AvrPto蛋白的專一性識別是必不可少的。Pto與AvrPto蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的直接互作結(jié)合,首次為Flor基因?qū)驅(qū)W說提供了分子水平上的實(shí)驗(yàn)證據(jù),對于寄主與病原物相互識別作用機(jī)制的研究具有劃時(shí)代的意義。類似這樣的例子還很多,從這個(gè)角度來看,酵母雙雜交系統(tǒng)對于植物與病原物互作和識別起了重要作用。3.2tip蛋白的形成雖然可以用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠直接驗(yàn)證植物與病原物的相互作用,但是,在多數(shù)植物-病原物互作系統(tǒng)中尚未找到抗病蛋白與無毒蛋白直接結(jié)合的證據(jù),但已發(fā)現(xiàn)有些抗病蛋白與無毒蛋白復(fù)合體的形成需要其它蛋白的參與。例如:HRT:TIP:CP,FeysBJ,etal.利用酵母雙雜交系統(tǒng),從擬南芥中捕獲到與蕪菁皺縮病毒TCV病毒外殼蛋白CP結(jié)合的TIP蛋白,TIP蛋白屬于NAC蛋白家族,參與植物胚的形成及開花過程的調(diào)控。CP外殼蛋白與TIP蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明,TIP-CP相互作用的喪失直接影響了寄主植物對TCV病毒的抗性。說明抗病基因HRT所介導(dǎo)的對TCV病毒的抗性,需要TIP蛋白與病毒外殼蛋白的結(jié)合,這種結(jié)合導(dǎo)致了擬南芥防御相關(guān)基因的表達(dá)。3.3植物與病毒蛋白相互作用的研究3.3.1grab在小麥細(xì)胞復(fù)制動力學(xué)病毒復(fù)制酶在病毒侵染植物過程中的主要作用是整合病毒和寄主植物的相關(guān)功能,調(diào)控基因表達(dá),復(fù)制病毒RNA、DNA。Qi等利用酵母雙雜交技術(shù),以小麥矮縮雙生病毒(wheatdwarfvirus,WDV)的復(fù)制酶A(replicationproteinA,RepA)為誘餌,從小麥的cDNA文庫中得到GRABgeminivirusRepA-binding的protein家族,并對其中2個(gè)成員進(jìn)行分子特性及功能分析,研究表明GRAB的表達(dá)能夠抑制WDV在小麥細(xì)胞中的復(fù)制。3.3.2tipctv-intractingmoin的構(gòu)建病毒外殼蛋白(Coatprotein,CP)與病毒侵染、病毒組裝及其在植物體細(xì)胞間運(yùn)動有關(guān)。RenT,etal.以蕪菁皺縮病毒(turnipcrinklevirus,TCV)的外殼蛋白為誘餌,篩選擬南芥的cDNA文庫,鑒定出一個(gè)名為TIPTCV-interactingprotein的蛋白。以番茄花葉病毒(TomatoMosaicVirus,ToMV)的外殼蛋白為誘餌,從煙草的cDNA文庫里分離出一個(gè)激發(fā)子反應(yīng)蛋白,并用病毒介導(dǎo)基因沉默VIGS實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了它的功能,該基因沉默后,CP不能長距離運(yùn)動,說明這個(gè)蛋白與ToMV外殼蛋白的互作有利于病毒的長距離運(yùn)動。4酵母雙雜交及其衍生系統(tǒng)在生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用近幾年來,酵母雙雜交技術(shù)在植物功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究中發(fā)揮了重大作用。它被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和功能基因組學(xué)等領(lǐng)域,已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要實(shí)驗(yàn)手段之一,獲得了許多有價(jià)值的重要發(fā)現(xiàn)。酵母雙雜交及其衍生系統(tǒng)在生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的不斷深入,為我們展示了一個(gè)明確生物體內(nèi)蛋白質(zhì)之間紛繁復(fù)雜作用關(guān)系的有效途徑。隨著酵母雙雜交系