木聚糖酶色譜純化技術(shù)的研究進(jìn)展

木聚糖酶色譜純化技術(shù)的研究進(jìn)展

木聚糖酶的純度和純度是決定木聚糖酶制造成本及其產(chǎn)品競爭力的重要因素。這類典型的生物技術(shù)產(chǎn)品的50.90%需要改進(jìn)。我國木聚糖酶的研究相對(duì)滯后,目前還未見產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶的報(bào)道。因此,開發(fā)具有高回收率,并能獲得高純度酶的大規(guī)模經(jīng)濟(jì)有效的生物分離純化方法,將是推動(dòng)我國木聚糖酶獲得實(shí)際商業(yè)化應(yīng)用的重要課題。本文簡要敘述了目前采用較多的木聚糖酶純化技術(shù),著重討論了雙水相體系(ATPS)和糖類結(jié)合域(CBM)的原理與方法,并就未來發(fā)展方向提出自己的觀點(diǎn)。1木聚糖酶的純化微生物產(chǎn)木聚糖酶大部分是通過色譜法最終純化。由于純化在生產(chǎn)上的重要性,國際上不少生物技術(shù)公司在最近幾十年里不斷研制出新型的色譜純化介質(zhì)及對(duì)原有介質(zhì)填料進(jìn)行改進(jìn)。使介質(zhì)的性能(流速、載量、pH使用范圍、化學(xué)穩(wěn)定性、分辨率)大大改進(jìn),各種預(yù)裝柱及高度自動(dòng)化智能化的儀器的出現(xiàn)也使得純化更加便捷,致使色譜法成為實(shí)驗(yàn)室純化蛋白質(zhì)最成熟的技術(shù),也是國內(nèi)絕大部分木聚糖酶最終純化所用的方法。木聚糖酶的純化方案設(shè)計(jì)依賴于酶的來源、酶所在的位置及最終的所需的純度。雖然也有不少一步純化的報(bào)道,但大部分都要經(jīng)過多步實(shí)現(xiàn)。一般步驟是粗酶預(yù)處理、粗酶沉淀、色譜分離。木聚糖酶純化的早期步驟通常使用低分辨率、非專一性的粗分離純化手段如硫酸銨鹽析、超濾、透析等以達(dá)到濃縮、去大部分雜質(zhì)和色素的目的;隨后常用的色譜有離子交換、凝膠過濾、疏水色譜、親和色譜和色譜聚焦。使用率最高的是離子交換和凝膠過濾,離子交換基團(tuán)大多數(shù)是以弱離子交換基團(tuán)DEAE、CM為主,其次是強(qiáng)離子SP、Q等,凝膠過濾主要色譜介質(zhì)是葡聚糖和瓊脂糖及其改良物。SaPereiraP綜述66種文獻(xiàn)中的木聚糖酶純化方案:通常需約2～5步的純化步驟,酶活性回收在0.2～78%之間變動(dòng),回收率與步驟的數(shù)目成反比,真菌產(chǎn)木聚糖酶活性回收常較細(xì)菌的為低,且色譜技術(shù)是限制高的酶活回收的因素之一。2cbm卡洛伊木馬和純度2.1糖脂糖的結(jié)構(gòu)和功能變化傳統(tǒng)的色譜雖然具有高的分辨率,但多步純化耗時(shí)、回收率低且在大規(guī)模純化上有其局限性。重組蛋白大量表達(dá)也需要高效、簡便的純化方法,使得在過去的二十年里許多專一吸附的親和純化被提出以嘗試取代多步的色譜技術(shù)。多肽融合標(biāo)簽是目前在實(shí)驗(yàn)室廣泛用于重組蛋白純化的一個(gè)有用地親和純化工具。多肽融合標(biāo)簽可以有選擇性地結(jié)合到一個(gè)固定在合適基質(zhì)上的互補(bǔ)配基上,目標(biāo)蛋白通過基工程和蛋白工程與多肽標(biāo)簽結(jié)合成融合蛋白,此融合蛋白經(jīng)一步親和層析可得相當(dāng)高的純化。江正強(qiáng)薛業(yè)敏等用多組氨酸作為標(biāo)簽經(jīng)過含鎳螯合金屬親和色譜純化木聚糖酶。然而,標(biāo)簽受體與基質(zhì)交聯(lián)時(shí)復(fù)雜的化學(xué)修飾、基質(zhì)循環(huán)利用的有限性、高花費(fèi)在大規(guī)模商業(yè)上的可行性等因素使得研究者尋求更合適的標(biāo)簽開辟其它新的純化途徑,CBM的應(yīng)用便是一例。糖類結(jié)合域(carbohydrate-bindingmodule,CBM)存在于許多糖苷水解酶包括木聚糖酶中,是結(jié)構(gòu)和功能上獨(dú)立的的一個(gè)非催化的功能區(qū)域。許多聚糖水解酶常包含著一個(gè)催化區(qū)域和通過連接序列相連的一到多個(gè)的CBM。第一個(gè)被鑒定的CBM是結(jié)合晶體纖維素的,因此定義為纖維素結(jié)合域(cellulose-bindingdomain,CBD)。研究揭示不同的CBM有著不同的配基專一性及不同的結(jié)合位點(diǎn),可結(jié)合到包括甘露聚糖、葡甘露聚糖、木聚糖、葡聚糖、單鏈纖維素、晶體纖維素、非晶體纖維素等糖類上。CBMs有選擇的配基結(jié)合為其發(fā)展親和純化提供了有利的條件。來自Streptomycesolivaceoviridis木聚糖酶C-端的CBM13,帶有三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(submodain)α、β、γ,每一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域上有單糖或二糖的結(jié)合點(diǎn),α亞結(jié)構(gòu)域?qū)θ樘怯休^強(qiáng)的結(jié)合能力,乳糖化-瓊脂糖親和色譜一步純化此木聚糖酶到單一組分。一般認(rèn)為這些功能區(qū)域即使彼此分開仍能執(zhí)行其功能,因此許多功能CBM通過基因操縱技術(shù)進(jìn)行獨(dú)立地表達(dá),用來分析其結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)。MangalaSL等的研究表明把從Clostridiumstercorarium木聚糖酶分離的CBM通過蛋白工程結(jié)合到無CBM的Bacillushalodurans堿性木聚糖酶上并不影響原有酶對(duì)可溶性糖活力及和PH性質(zhì),卻使之增加了對(duì)燕麥木聚糖的親和力和活性,可溶性糖可使它解吸。BeatrizRodriguez等的研究也證明來自Staphylococcusaureus的蛋白A活性并不受與CBM結(jié)合的影響。具有這種特點(diǎn)的CBM對(duì)于用它來作為一種親和標(biāo)簽是有用的。蛋白酶酶切下的CBM,通過蛋白質(zhì)工程與待分離蛋白融合形成融合蛋白,或基因工程構(gòu)建含CBM標(biāo)簽的重組蛋白,在不影響原有酶活性情況下親和色譜分離目的蛋白。MojganKavoosi等利用T.maritima木聚糖酶的CBM9-2與不溶性纖維素的親和性,成功地一步純化了含CBM標(biāo)簽的重組蛋白。然而,酶與多糖間的作用機(jī)制目前是不明確的,也有報(bào)道克隆CBM在宿主內(nèi)的糖基化與否影響到它與纖維素的親和力。CBM肽與目標(biāo)多糖之間的識(shí)別吸引了極大的關(guān)注,對(duì)它的進(jìn)一步了解必將促進(jìn)它的應(yīng)用。2.2cbd-mb-bbCBM按其氨基酸序列的相似性可分為33族,這些族按其結(jié)構(gòu)、功能、結(jié)合的專一性可分為a、b、c三類。結(jié)合到纖維素上的CBM(cellulose-bindingdomain,CBD)在純化上有著巨大潛力。CBD在纖維素酶、木聚糖酶等多糖水解酶中的廣泛存在被認(rèn)為是適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。植物細(xì)胞壁中纖維素含量占了很大一部分,CBD的存在使得這些酶結(jié)合在不溶性纖維素上形成多酶聚集體,導(dǎo)致了酶之間的協(xié)同作用,也使得局部酶有效濃度增加,促進(jìn)了細(xì)胞壁物質(zhì)的分解。CBD可分成13個(gè)族,族之間在性質(zhì)上有著顯著的差異,在大小上處于4～20KDa,在位置上有很大的變動(dòng)性,可發(fā)現(xiàn)于肽鏈N端、C端和中間。根據(jù)其差異和所用特定的CBD,選擇適合的條件如PH、競爭性配基等可用來使其和基質(zhì)解吸。CBD可專一地吸附于可溶或不可溶的纖維素上。一些CBD不可逆地結(jié)合在纖維素上,此類CBD可用于固定化。具有此CBD的木聚糖酶或者含此CBD標(biāo)簽的酶可固定到纖維素上。另一些CBD可逆結(jié)合到纖維素上,可作為一種親和標(biāo)簽,在分離和純化上更為有用。CBD用作親和標(biāo)簽的一個(gè)重要好處是不需要基質(zhì)纖維素的活化,免除了危險(xiǎn)化學(xué)藥品如溴化氰的使用。而且作為大規(guī)模的純化程序,纖維素是一種理想的基質(zhì):化學(xué)惰性,良好的物理性質(zhì),對(duì)非專一性蛋白低親和力,可廣泛制成各種不同的形狀和大小,醫(yī)療安全、價(jià)格便宜等。這些優(yōu)勢使許多研究者意識(shí)到了CBDS在生物技術(shù)上的巨大應(yīng)用前景。3兩個(gè)水相系統(tǒng)和純水3.1木聚糖酶atps雙水相系統(tǒng)(AqueousTwo-PhaseSystem,ATPS)是20世紀(jì)60年代被提出用于分離生化物質(zhì)的一項(xiàng)液-液提取技術(shù),經(jīng)過幾十年發(fā)展,現(xiàn)已廣泛用于分離細(xì)胞、生物膜、病毒、蛋白質(zhì)、核酸和其它的生物分子。由于具有操作簡易、高載量、相系統(tǒng)一步生成、相物質(zhì)可再循環(huán)、易規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn),使ATPS成為最有工業(yè)化潛力的一門技術(shù)。又由于分離體系雙水相、條件溫和、生物兼容性等原因使其在酶等活性物質(zhì)分離上有重要的應(yīng)用價(jià)值,目前用ATPS被分離的酶已有幾十種。在應(yīng)用于木聚糖酶純化上有較成功的探討[17,18,19,20,21,22,23,24,25]。ATPS主要是通過混合兩種水溶性高聚物溶液或者一種高聚物溶液和一種鹽溶液形成,一般認(rèn)為只有兩種高聚物有疏水性差異時(shí)才會(huì)形成分開的兩相。物質(zhì)在兩相中分離依賴于物質(zhì)本身的性質(zhì)(分子量、電荷、疏水性、親和專一性、構(gòu)象)、形成兩相系統(tǒng)的成分(高聚物組成、分子量、摩爾比)、系統(tǒng)環(huán)境(溫度、PH值)和離子(NaCl)的濃度。在ATPS中,目前最常用的兩種系統(tǒng),即聚乙二醇/葡聚糖體系和聚乙二醇/磷酸鉀體系。這兩種系統(tǒng)由于無毒被廣泛由于各種物質(zhì)的分離與研究中。3.2木聚糖酶活性回收在現(xiàn)有報(bào)道中利用ATPS分離木聚糖酶大多在一步至二步就達(dá)到相當(dāng)高的純化,甚至操作工藝的連續(xù)化和半連續(xù)化,也有應(yīng)用于木聚糖酶發(fā)酵的報(bào)道。Gaikaiwarietal.較早用ATPS分離來自Bacillussp的木聚糖酶,酶液兩次經(jīng)過ATPS,第一次8%磷酸鹽,16%PEG8000,第二次12%磷酸鹽,8%PEG8000。結(jié)果是85%的活性回收和只有1.2倍的純化。MonicaAndreaBim利用聚乙二醇(PEG)/磷酸鉀鹽系統(tǒng)純化來自Bacilluspumilus的木聚糖酶,研究了12個(gè)包含不同的PEG分子量、PEG濃度、磷酸鹽濃度、氯化鈉濃度的ATP系統(tǒng),結(jié)果在最優(yōu)22%PEG6000,12%氯化鈉、10%磷酸鹽下木聚糖酶活性回收達(dá)95%和相當(dāng)高的純化,.木聚糖酶聚集在PEG富集的上相。M.C.T.Drarte在8%K2HPO4,16%PEG6000,12%NaCl的ATPS一步濃縮和純化堿性木聚糖酶,可實(shí)現(xiàn)41%的活性回收和57的純化倍數(shù),木聚糖酶集中在底相。3.3兩個(gè)水相系統(tǒng)pts的組合3.3.1peg-eudragits-100和磷酸鹽系統(tǒng)ATPS和其它技術(shù)的結(jié)合使得ATPS工藝更為高效、連續(xù)和經(jīng)濟(jì),雙水相親和沉淀技術(shù)便是其中的一種。SunitaTeotia,R.Lata等在PEG/磷酸鹽系統(tǒng)中加入了木聚糖酶的親和配基EudragitS-100,EudragitS-100是一種可逆溶-不溶性的丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物,不溶于酸性,但中性和堿性中可溶,形成了PEG-EudragitS-100/磷酸鹽兩相系統(tǒng),此系統(tǒng)分離來自Aspergillusniger和Tichoderma-reeseiandBacillusamyloliquefaciens的木聚糖酶,前者純化56倍,活性回收達(dá)93%,后者達(dá)32倍,活性回收達(dá)93%。木聚糖于與EudragitS-100結(jié)合在PEG富集相,利用EudragitS-100在PH5.5以上是可溶于水和PH4.5以下完全沉淀的特點(diǎn),降低PH值沉淀出EudragitS-100與酶的結(jié)合物,用1MNaCl使酶與EudragitS-100解吸。3.3.2蛋白質(zhì)工程對(duì)聚合物疏水性的影響從現(xiàn)有的研究表明,影響ATPS的分離系數(shù)的因素是很多的[17,27,28,29,30,31,32,33,34]。使得具體到每一種蛋白時(shí)必須有針對(duì)性地優(yōu)化ATPS參數(shù)以達(dá)最大的分離效果。在ATPS中,蛋白質(zhì)中有些氨基酸對(duì)分離系數(shù)有著重要的影響。尤其是疏水性氨基酸。FexbyS等研究把不同長度和成分的短肽的用基因技術(shù)融合到乳酸脫氫酶的N-端上以觀察其疏水性及在ATPS中的分離,結(jié)果表明疏水性的差異與ATPS中的分離效果密切相關(guān)。熒光蛋白和乳酸脫氫酶在N-端融合了三個(gè)酪氨酸,在ATPS中分離效果更好,如脯氨酸接在酪安酸標(biāo)簽和蛋白質(zhì)之間,分離系數(shù)會(huì)更增加。作者認(rèn)為可能原因是脯氨酸的剛硬結(jié)構(gòu)增加了疏水標(biāo)簽暴露至環(huán)境中,結(jié)果分離系數(shù)大大增加了。色氨酸標(biāo)簽蛋白在ATPS中促進(jìn)分離也與它在系統(tǒng)中暴露于ATPS表面活性劑富集相中有關(guān)。說明蛋白質(zhì)的疏水性對(duì)在雙相系統(tǒng)中的分離有促進(jìn)作用。Nilsson.ALinder.M.B等人的研究也都證明物質(zhì)疏水性與在ATPS中的有效分離有很大的關(guān)系。疏水作用具有高的選擇性,其差異能被用做有效手段為簡化蛋白質(zhì)分離,蛋白質(zhì)的疏水性通過小的基因修飾如定點(diǎn)誘邊或與疏水肽標(biāo)簽的融合很容易地改變,一些蛋白質(zhì)一端接上疏水氨基酸標(biāo)簽,即使只增加分子量的1%,改變等電點(diǎn)2%也會(huì)對(duì)其疏水性有很大的影響。在已報(bào)道的木聚糖酶純化方案里,有相當(dāng)一部分用到疏水層析,利用酶本身疏水性差異或者在不影響酶活性的前提下通過蛋白工程改變待分離酶的疏水性,這種蛋白質(zhì)工程與雙水相系統(tǒng)的結(jié)合將使分離效果得到提高。與傳統(tǒng)的親和標(biāo)簽相比,疏水肽標(biāo)簽有一個(gè)重要的好處是開挖簡單、并不昂貴生物分離材料的可能性,是一個(gè)重要的工具。3.3.3金屬離子表面活性劑ATPS與親和技術(shù)的結(jié)合也是未來的一個(gè)發(fā)展方向,ATPS由于載量大,選擇性較低,如在成相劑(聚乙二醇)上接上待分離蛋白的親和配基,則可大大地提高了專一性,目前可接上去的配基有活性染料、金屬離子、蛋白質(zhì)配體等。在這親和ATPS里,許多酶被純化。Lam,H等用ATPS分離蛋白標(biāo)簽CBM9-GFP,此標(biāo)簽是綠熒光蛋白(GFP)與多糖結(jié)合域(CBM)的連接體,目的是研究CMB蛋白標(biāo)簽在親和ATPS中的分離效果。一種葡萄糖衍生而來的非離子表面活性劑C(10)G(1)既是成相劑又是CBM的親和配基,在水溶液中形成膠束兩相系統(tǒng),競爭性抑制劑葡萄糖可阻斷CBM與配基的親和性,被加入的作為對(duì)照。結(jié)果是CMB與表面活性劑的親和使分離系數(shù)高于對(duì)照組6倍,表明此親和ATPS有可能應(yīng)用于任何含CBM標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)分離及具有CBM的酶的分離。4eudragits-100和k-roy三相系統(tǒng)與ATPS的不同在上下相之間有一界面相。AparnaSharma,M.N.Gupta用三相系統(tǒng)純化來自Aspergillusniger的木聚糖酶,其操作是木聚糖粗酶與親和劑EudragitS-100溶液混合,加入低于鹽析濃度的30%硫酸銨溶液,再以等體積加入有機(jī)溶劑正丁醇,有機(jī)溶劑的加入把蛋白質(zhì)推出溶液,結(jié)果上相是有機(jī)溶劑相,下相是水相,在兩相的中間形成一層蛋白質(zhì)沉淀界面,沉淀相是EudragitS-100和酶的結(jié)合物,1M的NaCl使酶與EudragitS-100分離,其木聚糖酶活性回收達(dá)60%,純化倍數(shù)達(dá)95倍,直接達(dá)到電泳純。IpsitaRoy等用三相系統(tǒng)純化已被8M尿素/100mM二硫蘇糖醇變性的Aspergillusniger木聚糖酶,達(dá)到了21倍的純化倍數(shù)和93%回收率,且實(shí)現(xiàn)了變性木聚糖酶的復(fù)性。此方法可借鑒于純化木聚糖酶重組蛋白超量表達(dá)時(shí)形成的包涵體。5木聚糖酶純化EveraldoSilvinoDosSantos等人曾嘗試用擴(kuò)張床吸附技術(shù)(Expan